RELATÓRIO 1 (nota 2,2) (valor 2,3) Conservação

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 
FUNDAMENTOS DA DIVERSIDADE BIOLÓGICA E PROTISTA 
ALUNA: Aléxia Antonia Lessa da Costa 
TURMA AB – Ciências Biológicas/Bacharelado 2016.1 
 
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 
 
TEMA: Conservação de amostras biológicas e uso de corantes – 12/05/2016 
 
 Nesta última aula do Bloco 1 da disciplina de Fundamentos da Diversidade 
Biológica e Protista, ministrada pelo professor Sérgio Lourenço, foi estudado os métodos 
de conservação de amostras biológicas, utilizados para evitar a decomposição das mesmas 
e o uso de corantes. 
Conservação de amostras biológicas 
 Qualquer amostra biológica está sujeita à vulnerabilidade de 
decomposição. Essa vulnerabilidade pode levar na perda dessas amostras devido a 
atividade microbiana. A partir desse contexto o que é conservação? Conservação é 
quaisquer procedimentos que levem ao interrompimento ou retardamento desse processo 
de decomposição. Podendo assim dividir tais procedimentos em dois tipos: físicos e 
químicos. 
 Os métodos físicos trabalham com o fator temperatura no desaceleramento 
ou inibição da atividade metabólica dos microrganismos. Pode-se utilizar métodos de 
redução ou até mesmo aumento de temperatura, levando à secura. Essas alterações podem 
ser leves, intensas ou extremamente intensas, que conforme aumenta-se o grau de 
alteração, consequentemente, seu grau de eficácia de eliminação de microrganismos é 
maior. 
1) Refrigeração – é um método físico mais prático e natural, onde 
normalmente as amostras são liquidas, e essas amostras possuem uma perspectiva de 
analisa a curto prazo. Nesse método trabalham-se temperaturas bem baixas (em torno de 
5ºC) e não há destruição de microrganismos, mas sim uma desaceleração de sua atividade 
metabólica, ela retarda o processo de decomposição das amostras. 
 
2) Congelação – é um método onde o material continua praticamente intacto. 
Nesse método trabalham-se temperaturas em torno de -20ºC, onde microrganismos são 
mortos, mas a estrutura básica da amostra fica intacta. Nesse tipo de conservação não há 
a necessidade de analisar a amostra rapidamente. 
Em sala, foi mostrado à classe uma espécie de alga rodózea congelada e explicado que 
esse método possui algumas falhas. Observou-se que dentro do saco plástico, onde se 
encontrava a alga, havia um líquido no fundo (FICOERITRINA – pigmento 
fotossintético). Aquele líquido foi resultado da ruptura do material intracelular. Já que o 
congelamento leva à formação de cristais de gelos, fazendo com que haja uma expansão, 
levando assim a ruptura de células e consequentemente ao extravasamento de conteúdo. 
Por isso é de extrema importância que os métodos de conservação sejam escolhidos de 
acordo com o que quer ser analisado. Nesse exemplo em questão, se quiséssemos analisar 
as células e tecidos da alga ele não seria adequado, devido à perda de material intracelular. 
 
3) Criopreservação – é um método onde se utiliza temperaturas ultrabaixas, 
em torno de -150ºC. Existem dois recursos, o primeiro é a utilização de freezers 
científicos, onde alguns chegam a temperaturas extremamente baixas (-130ºC) e o prazo 
de conservação é indeterminado. Como a qualidade da conservação de amostras em 
freezers depende de uma fonte de energia eficaz, são instalados geradores como forma de 
precaução em casos de perda de energia. O segundo recurso é o uso de botijões 
criogênicos, que utilizam nitrogênio líquido, chegando a –196ºC. Esse recurso não 
danifica as amostras, deixando elas vivas e viáveis para utilização, se seguirmos um passo 
a passo rigoroso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Imagem 1 – Botijão criogênico. 
FONTE: Imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço. 
 
Um detalhe importante para esse recurso de conservação é a disponibilidade 
de nitrogênio. O nível de nitrogênio no botijão tem que estar cobrindo as amostras, para 
total conservação das amostras. 
Para a utilização desse método devem ser seguidos vários procedimentos 
protocolares. 
- As amostras devem ser colocadas em recipientes especiais que suportem 
essa temperatura, por isso são utilizados os tubos criogênicos, que são feitos de um 
material plástico nobre chamado de polipropileno; 
- Além disso elas devem estar em pequenos volumes, (células em suspensão, 
fragmentos de tecido); 
- Há também a utilização de crioprotetores, que é uma substância utilizada 
para proteger o tecido biológico de danos de congelamento. (MARTINS & JUSTINO, 
2015) Podem ser usados metanol, sais de manganês ou glicerol, para a extração do 
excesso de água nas células, por exemplo. 
-Nesse processo precisa-se adicionar substancias que irão desidratar as 
amostras, em seguida diminuir a temperatura em níveis consideráveis para aí então serem 
levadas para dentro do botijão criogênico. E depois de retiradas dessas conservas elas 
deverão ser reidratadas. 
Esses protocolos são muitos específicos e devem ser feitos cuidadosamente, 
variando de acordo com a natureza das amostras. 
A vitrificação é um método utilizado em que o citoplasma da célula fica no 
estado sólido, contribuindo assim para sua conservação. Vale a pena destacar que isso só 
acontece se a célula for desidratada e depois levada a temperaturas ultrabaixas. Ela fica 
em um estado de extrema rigidez, mas não é danificada, suas funções vitais ficam intactas. 
Como se o tempo e seu metabolismo “parassem”. 
4) Exsicatas – é uma técnica muito de método físico de conservação que é 
aplicada em amostras botânicas, algáceas e fúngicas. Durante a aula, algumas peças foram 
mostradas e foi ensinado como confeccionar exsicatas de algas. 
 
Imagem 2 – exsicata apresentada em sala de aula 
FONTE: Imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço 
 
Depois das amostras serem devidamente coletadas, devemos seguir para 
parte da herborização, que é uma técnica extremamente especial em fazemos uma peça 
do material coletado ser aderida e prensada numa peça de papel. Feito isso, o material 
deve passar por uma secagem, para só assim serem registradas e incorporadas nos acervos 
dos herbários – ambientes com temperaturas extremamente controladas para preservação 
e conservação das exsicatas. (FIDALGO & BONONI, 1989) . 
 
 
 
 Já os métodos químicos são aqueles em que há adição de substâncias que 
vão inibir o crescimento e o desenvolvimento de microrganismos. Nesses processos, a 
decomposição fica muita lenta ou até mesmo é interrompida. 
 Uma forma de conservação química é a utilização de um formaldeído, mais 
conhecido popularmente como formol (CH2O), tendo como nome sistemática (IUPAC) 
methanal .Ele consiste em um gás extremamente volátil e ativo, produzido a partir do 
metanol, que é comercializado em forma líquida (misturado à água e álcool) para tornar 
seu manuseio mais prático. (INCA, s.d.) Seu preço é bem mais barato em comparação 
aos outros materiais, mas um contato constante pode causar danos à saúde, doenças 
cardiorrespiratórias ou até mesmo câncer. O professor relatou que a compra desses 
produtos químicos que são nocivos, são mais reguladas. Normalmente, pela polícia 
federal ou por órgãos públicos. 
 A aplicação desses produtos também varia de acordo com a natureza das 
amostras. Amostras pequenas necessitam de concentrações mais baixas, enquanto 
amostras maiores precisam relativamente de uma concentração maior. 
 O tempo de conservação é indeterminado, dependendo apenas algumas 
variáveis, tais como a abertura dos frascos onde se encontram as amostras, a renovação 
dessas substancias, etc. 
 Quando falamos dessas substâncias químicas existe também o fator de 
fragilidade. Algumas amostras não combinam com certos elementos,e podem acabar 
levando à danificação das mesmas. Amostras com carbonato de cálcio por exemplo 
reagem diretamente com o formol. 
 Outros conservantes químicos podem ser utilizados, tais como o glicerol 
(C3H8O3), que é quimicamente um tri-álcool, tendo como nome sistemático (IUPAC), 
1,2,3-propanotriol, é um líquido incolor mais viscoso que deixa os microrganismos menos 
ativos (BEATRIZ, ARAÚJO, & DE LIMA, 2011), cloreto de mercúrio (HgCl2), 
glutaraldeido, entre outros. Porém esses conservantes são bem mais caros. 
O lugol por exemplo é uma solução utilizada, onde mistura-se vários 
componentes (água, iodo molecular, iodato de potássio, ácido acético), que é 
extremamente cara e volátil. A conservação com o lugol é bastante eficaz, mas devemos 
sempre prestar atenção se o princípio ativo de conservação ainda está presente na solução. 
Uso de corantes 
Algumas amostras são muito pálidas e por isso precisam ser coradas para uma 
melhor análise. Os corantes, são substâncias que absorvem certos comprimentos de onda 
da luz visível e têm afinidade por determinados constituintes celulares. (INSTITUTO DE 
BIOCIÊNCIAS - USP, s.d.) Esses corantes atuam fixando-se eletiva ou seletivamente em 
determinadas estruturas celulares, ligando-se com o peptidoglicano, reagindo com 
carboidratos, interagindo com substâncias ácidas da célula, conferindo a elas diferentes 
graus de absorção de luz incidente. (UFG, 2011). Esses corantes utilizados podem ser 
divididos em Vitais e Não-vitais. 
Os corantes vitais normalmente são aplicados em materiais vivos e não 
matam os organismos, pois se ligam a eles quimicamente durante apenas um certo período 
de tempo. Temos como exemplo o azul de metileno, que normalmente é utilizado para 
observação de protozoários. 
Já os corantes não-vitais fazem essas ligações químicas permanentemente, 
levando assim à morte do material biológico. A utilização desses corantes deve ser feita 
em lâminas permanentes. Existem diversas técnicas que podem ser utilizadas para a 
confecção dessas laminas e estas diferem principalmente na escolha da substância 
utilizada na infiltração e suas particularidades. Depois do material ser coletado, ele deverá 
ser fixado, usualmente em soluções de FAA 70º ou glutaraldeído, e desidratado. Depois 
disso passará por processos de infiltração e inclusão, que tornarão a amostra resistente 
para suportas os impactos provenientes do processo de seccionamento. Para seccionar o 
material no micrótomo é preciso unir o material a um bloco de madeira que servira de 
apoio. Depois de todas essas etapas, a amostra irá para o micrótomo, equipamento 
essencial para a montagem de laminas, que secciona as amostras nas espessuras corretas. 
Depois e seccionadas as amostras estão prontas para coloração e montagem nas laminas. 
(UFSC, 2015) É importante ressaltar que elas devem ser preparadas previamente e só 
depois de o material estar completamente aderido à lamina adiciona-se os corantes. 
Foi apresentada uma lâmina contendo uma amostra de sangue corado para ver 
um protozoário incolor. Além disso o professor explicou que existem técnicas para a 
preparação dessas lâminas, tais como: 
-Esfregaço – técnica que consiste em espalhar uma gota de material biológico 
sobre uma lâmina de vidro formando uma fina película para uma melhor observação ao 
microscópio. (GONÇALVES, 2011) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 – Exemplo de técnica de esfregaço. 
FONTE: GONÇALVES (2011) 
-Imprint - essa técnica consiste em pegar uma gota do material, e com o 
auxílio de um bastão dar leves batidas na lâmina. (CAPUTO, MOTA, & GITIRANA) 
-Corte histológico – essa técnica consiste em cortar um pedaço pequeno 
geralmente de algo muito maior. O corte é feito em fatias muito finas para que seja melhor 
analisado no microscópio. Para que o corte seja possível, o material é submetido a um 
tratamento que torna essas células mais rígidas, normalmente é utilizada a parafina que 
endurece, servindo de apoio para o corte nos micrótomos. (TOBOGA & VILAMAIOR, 
2007) 
Alguns dos corantes citados em aula apresentados à classe. Da esquerda para 
a direita temos o Rosa de bengala, Fucsina e Eosina com azul de metileno 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 – corantes apresentados em aula. 
FONTE: Imagem cedida pelo professor Sérgio Lourenço. 
É importante ressaltar que a utilização de corantes sempre irá depender do 
que você vai analisar, pois cada um é utilizado para destacar determinada estrutura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
BEATRIZ, A., ARAÚJO, Y., & DE LIMA, D. (2011). Glicerol: um breve histórico e aplicação 
em sínteses estereosseletivas. Química Nova, vol. 34, nº2. 
CAPUTO, L., MOTA, E., & GITIRANA, L. (s.d.). FIOCRUZ. Fonte: 
http://www.epsjv.fiocruz.br/sites/default/files/capitulo_4_vol2.pdf 
GONÇALVES, R. (10 de março de 2011). Biomedicina Brasil . Fonte: 
http://www.biomedicinabrasil.com/2011/03/esfregaco-sanguineo.html 
INCA. (s.d.). INCA. Fonte: http://www1.inca.gov.br/conteudo_view.asp?ID=795 
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - USP. (s.d.). Introdução aos métodos de estudo da célula. 
Fonte: BIO-0206 - Biologia Celular: 
http://dreyfus.ib.usp.br/bio206/Apostila%20Pratica%20BioCel.pdf 
FIDALGO, O. & BONONI, V. L. R. Técnica de coleta, preservação e herborização de material 
botânico. Capítulo 1 ( Série Documentos) São Paulo. 62p. 1989 
MARTINS, M. I., & JUSTINO, R. (janeiro/março de 2015). Colégio Brasileiro de Reprodução 
Animal. Fonte: CBRA: http://www.cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/v39n1/pag136-
140%20(RB563).pdf 
TOBOGA, S., & VILAMAIOR, P. (2007). A célula (2 ed.). Brasil: Manole. Acesso em 17 de 
maio de 2016 
UFSC. (25 de janeiro de 2015). Laboratório de Anatomia Vegetal. Fonte: Universidade Federal 
de Santa Catarina: http://laveg.paginas.ufsc.br/roteiro-ilustrado/material-e-metodos/