Enzymology class 6

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Fernando Segato 
Lorena - 2014 
Enzimologia – LOT2017 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Ensaio 
!
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Homogenato 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Homogenato 
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-  Solubilidade; 
-  Tamanho; 
-  Carga; 
-  Afinidade de ligação específica. 
Purificação de proteínas com base em suas características 
Métodos preliminares de purificação 
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Salting out 
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Boiling 
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Diálise 
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Diálise 
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Diálise 
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-  Solubilidade; 
-  Tamanho; 
-  Carga; 
-  Afinidade de ligação específica. 
Purificação de proteínas com base em suas características 
Cromatografia 
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Mikhail Semyonovich Tsvet 
(1872-1919) 
Botânico Russo 
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C
on
ce
nt
ra
çã
o 
Tempo ou volume 
Coletor de 
frações 
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica 
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou 
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), 
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. 
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: 
Tempo 1 
Mais tampão é 
colocado na 
coluna, 
forçando os 
componentes 
da amostra a 
interagirem 
com a resina 
Componentes da 
amostra se 
separam e saem 
da coluna com 
diferentes 
volumes de 
tampão 
Tempo 2 Tempo n 
Líquido 
que sae 
da coluna 
é 
recolhido 
em tubos 
de um 
coletor de 
frações 
 
Os componentes da mistura são 
separados por interação diferenciada 
com a resina, com base em 
propriedades moleculares como: 
 
•  massa molecular 
•  carga elétrica 
•  solubilidade 
•  afinidade 
 
Amostra com 
diferentes 
componentes 
Resina 
embebida 
em 
tampão 
Tempo zero 
Um cromatograma, como o 
gráfico ao lado, é a maneira 
usual de se representar o 
resultado de uma 
cromatografia. 
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Tipos de cromatografia 
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TLC 
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Colunas 
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Colunas 
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FPLC system 
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Colunas 
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FPLC system 
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Cromatograma 
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Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular 
 grãos (beads) da 
resina com poros 
grão da resina poroso 
proteína grande 
proteína pequena 
Tampão 
“empurra” 
moléculas 
através da 
resina 
tubos 
 Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes 
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os 
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o 
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. 
 Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com 
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de 
volume morto (Vo). 
 Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um 
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel). 
Moléculas com massas diferentes 
Fluxo do tampão 
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 Resinas para Gel-Filtração 
Sephadex G - 10 Dextrana 0.05 - 0.70 
Sephadex G - 25 Dextrana 1 - 5 
Sephadex G - 50 Dextrana 1 - 30 
Sephadex G - 100 Dextrana 4 - 150 
Sephadex G - 200 Dextrana 5 - 600 
Bio - Gel P - 2 Poliacrilamida 0.1 - 1.8 
Bio - Gel P - 6 Poliacrilamida 1 - 6 
Bio - Gel P - 10 Poliacrilamida 1.5 - 20 
Bio - Gel P - 30 Poliacrilamida 2.4 - 40 
Bio - Gel P - 100 Poliacrilamida 5 - 100 
Bio - Gel P - 300 Poliacrilamida 60 - 400 
Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000 
Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000 
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO 
(kD) 
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio - Rad Laboratories 
Moléculas pequenas 
Moléculas pequenas 
Proteínas 
Proteínas 
Células, partículas sub-celulares 
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o 
tipo de moléculas ou partículas a serem separadas 
indica quais os tamanhos das 
partículas que podem entrar 
nos poros da resina e serem 
fracionados. Acima ou abaixo 
da faixa, não há separação. 
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A
bs
or
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 a
 2
80
 n
m
 
volume 
M
ed
id
a 
da
 a
tiv
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io
ló
gi
ca
 Moléculas 
maiores 
Moléculas 
menores 
Kav 
M
as
sa
 m
ol
ec
ul
ar
 (k
D
) 
 20 40 60 80 100 120 mL 
 25 50 75 100 125 mL 
volume de eluição 
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma 
proteína em seu estado nativo 
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica 
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a 
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo. 
 
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa 
molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. 
 
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular. 
Curva de calibração 
traçado da medida de atividade 
biológica nas frações 
Medir o volume de eluição 
da fração mais ativa. 
Transportar para a curva de 
calibraçao. 
Ler a massa 
correspondente 
Observar a 
escala log 
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Cromatografia de troca iônica 
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou 
negativa, em uma ampla faixa de pH. 
Trocadora de ânions Trocadora de cátions 
DEAE CM 
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), 
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem 
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose 
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- - 
- 
- - - - 
DEAE-celulose - pH < 10 
CM-celulose - pH > 4 
Cromatografia de troca iônica 
Proteína P.I. 
Pepsina <1,0 
Ovalbumina galinha 4,6 
Albumina sérica humana 4,9 
Tropomiosina 5,1 
Insulina bovina 5,4 
Fibrinogênio humano 5,8 
Gama-globulina 6,6 
Colágeno 6,6 
Mioglobina equina 7,0 
Hemoglobina humana 7,1 
Ribonuclease A bovina 7,8 
Citocromo C equino 10,6 
Histona bovina 10,8 
Lisozima, galinha 11,0 
Salmina, salmão 12,1 
 
PI ácido 
+ 
básico 
- neutro 
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas 
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Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica 
Adsorção 
Eluição 
+
+
+
+
+
+
+
+
Moléculas com a mesma carga, 
ou sem carga, não interagem com a resina,sendo as primeiras a sair da coluna 
Adição de sal ao tampão resulta em 
competição entre os íons em solução e 
as moléculas adsorvidas na resina. 
Na+Cl- + 
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: 
 
1)  adsorção das proteínas com carga contrária à 
resina, e saída da coluna das proteínas com a 
mesma carga; 
2)  eluição das proteínas adsorvidas. 
+
+
+
+
+
+
+
+
+ 
+ + 
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou 
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): 
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna 
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a 
interação entre as proteínas e a resina. 
 
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da 
concentração do sal no tampão, pois alterações de pH 
podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar 
dentro da coluna. 
 
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Carboximetil~celulose 
(trocadora de cátions) 
Dietilaminoetil~celulose 
(trocadora de ânions) 
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica 
 Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com 
a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus pIs e o pH do tampão de 
eluição. 
 As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo 
simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina). 
_ 
= 
= 
_ 
+ 
+ + 
+ + 
(+) 
(+) 
(+) 
(+) 
0. 10 M 
0. 15 M 
0. 20 M 
Eluição NaCl 
Não retidas 
DEAE 
+ + 
0. 10 M 
0. 15 M 
0. 20 M 
Eluição NaCl 
+ 
(-) 
(-) 
(-) 
+ + + 
_ = 
= _ (-) 
Não retidas 
CM 
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Tipos de Resina de troca Iônica 
 Tipos de Resina de troca iônica 
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES 
Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH 2 N+(CH 3 ) 3 Troca aniônica 
resina de polistireno 
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3 -H Troca Catiônica 
resina de polistireno 
DEAE - celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas 
- CH 2 CH 2 N+(C 2 H 5 ) 2 ácidas e neutras 
CM - celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas 
- CH 2 COOH básicas e neutras 
 Q-Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração 
básico e troca iônica de proteínas 
ácidas e neutras 
SP -Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração 
ácido e troca iônica de proteínas 
básicas e neutras 
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sepharose e Source: GE LifeSciences Bio - Gel: Bio Rad Laboratories 
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado. 
−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3
 
—CH2-SO3- 
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Troca iônica – adsorção das moléculas 
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Troca iônica – eluição das moléculas 
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Troca iônica – eluição das moléculas e equilíbrio das colunas 
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Resina usada AGAROSE – polímero de 
açúcares de algas ao qual se liga um 
composto qual a enzima tem afinidade. 
 
-  Enzima – o ligante é o seu substrato 
-  Anticorpo – o ligante é o antígento 
-  Receptor de hormônios – ligante é o 
hormônio 
* Mais específica de todas 
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Cromatografia de afinidade: 
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao 
 ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou 
 por competição com o ligante livre 
Desprezar 
proteínas não 
retidas 
Lavagem 
Eluição 
pH 2,0 ou sal 
Antígeno A 
puro 
Anti-A 
interage 
apenas 
com a 
proteína A 
- 
Mistura de proteínas 
Coluna 
empacotada 
com ess gel 
Partículas de 
gel recobertas 
de anticorpos 
anti-A 
Adsorção 
Complexo 
Ag-AC é 
desfeito 
Um dos métodos mais 
eficientes para a 
purificação de proteínas, 
possibilitando um alto 
rendimento com número 
reduzido de etapas. 
 
A separação de 
moléculas tem como 
base a interação 
específica do analito 
(molécula-alvo) com um 
ligante imobilizado na 
matriz. Forças 
envolvidas nessa 
interação podem ser não 
covalentes 
(eletrostáticas, 
hidrofóbica, pontes de H) 
ou covalentes (p.e., ponte 
dissulfeto). 
Ex: cromatografia de imunoafinidade 
Pode ter o antígeno ou o anti-corpo ligado 
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Afinidade - níquel 
Imidazol Histidina 
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Colunas 
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Ligante 
grupo-específico 
Especificidade 
Proteína A Região Fc de IgG 
Proteína G Região Fc de IgG 
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil- 
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina 
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal 
arginina proteinases tipo tripsina 
benzamidina proteinases tipo tripsina 
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina 
heparina Fatores de coagulação, lipases, 
hormônios, receptores estoróides, etc 
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos 
de His expostos 
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo 
 - análogos de substratos ou inibidores de enzimas 
 - agonistas ou antagonistas de receptores 
 - haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos 
 - ligantes com “tag” ou “marcação” 
 - glutationa-S-transferase 
 - poli-Histidina 
 
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: 
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade 
8-AEA-cAMP 
 
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic 
monophosphate 
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP 
ou cGMP) 
 Sítios de ligação das proteínas 
A, G e L à imunoglobulina, que 
permitem a purificação de 
anticorpos por cromatografia 
de afinidade 
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Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento 
estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade 
ou impede sua ligação à resina. 
 
 A introdução de um braço espaçador diminue esse risco. 
Estratégias para acoplamento de ligantes à resina 
 Reagente Alvo no ligante 
Braço espaçador covalente entre 
a resina e o ligante 
Ligação reversível não covalente 
ligante 
Molécula-alvo (analito) 
Preparo da resina de afinidade: 
 
Passo 1. Ativação da resina 
 
 
 Passo 2. Acoplar 
 o ligante 
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L""""""1"""""""2"""""""3""""""4""""""5"""""""6""""""L"""""""""""""""""""""""""""L""""""""7"""""""8"""""""9""""""10"""""11""""12""""""""
A.#niveus# M.#thermophila#
97 
66 
45 
31 
20 
14 
KDa 
Identificação e Estudos Moleculares de Enzimas Produzidas pelos Fungos 
Termofílicos Aspergillus niveus e Myceliophtora termophila 	
  
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Fermentação 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Ultra-filtração 
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Industrial Purification 
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Industrial Purification 
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Industrial Purification 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Separação 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Separação 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
Enzimologia – LOT2017 – aula 6 
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