Relatório contagem em placas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Fellipe Carvalho
Nayara Louise 
Contagem de bactérias totais
Relatório acadêmico apresentado como requisito parcial de avaliação da disciplina de Laboratório de Microbiologia de Alimentos I, ministrada pela Prof.ª Dr.ª Janeeyre Ferreira, no 2º semestre de 2014. 
Fevereiro de 2015
Contagem em placas
Introdução
O método de contagem de microrganismos em placa é um método geral, que pode ser utilizado, tanto para a contagem de grandes grupos microbianos, como os aeróbios mesófilos, os aeróbios psicrotróficos, os bolores e as leveduras e os clostrídios sulfito redutores, como também para a contagem de gêneros e espécies em particular, como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens, por exemplo. 
Essa versatilidade é decorrente do princípio do método, que se baseia na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado, uma colônia visível e isolada. Variando o tipo de meio (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio seletivo-diferencial) e as condições de encubação (temperatura e atmosfera), é possível selecionar o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar. 
O método convencional de contagem de microrganismos consiste basicamente no plaqueamento de alíquotas do produto homogeneizado e de suas diluições em meios de cultura sólidos, adequadamente selecionados em função do microrganismo a ser enumerado. O plaqueamento pode ser feito por semeadura na superfície do meio de cultura previamente distribuído em placas de Petri estéreis (semeadura em superfície), ou então o meio de cultura pode ser adicionado após a transferência das alíquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em profundidade). As placas são então incubadas a uma combinação de tempo e temperatura adequada para a determinação a ser feita, durante a qual os microrganismos se multiplicam formando as colônias visíveis, que podem ser enumeradas manualmente ou com o auxílio de contadores automáticos.
Apesar da aparente simplicidade dessa técnica, ela é bastante trabalhosa e sujeita a erros, levando em consideração que: os microrganismos estão arranjados em pares, tétrades, cadeias e cachos, consequentemente, o número de colônias que aparece na placa não corresponde ao número de células individuais presentes, além disso, quando muitas diluições precisam ser plaqueadas também pode haver erros, bem como algumas partículas de alimentos podem ser confundidas com colônias, levando a um falso resultado positivo, sendo a leitura dos resultados bastante difícil, pois pode variar de acordo com o analista, além de ser cansativa e imprecisa, mesmo quando contadores automáticos são empregados.
Como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, tétrades, cachos, cadeias, etc), não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de células. A relação correta é feita entre o número de colônias e o número de “unidades formadoras de colônias (UFC)”, que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de certos microorganismos. 
Para o cálculo da quantidade de bactérias, utilizamos a seguinte equação: número de colônias na placa ÷ diluição da amostra = nº de bactérias/mL
Quando essa metodologia é empregada, deve-se utilizar o método da diluição seriada para garantir que o número de colônias na placa permaneça na faixa desejada, exemplo: uma amostra de leite com 10 mil bactérias / mL. A inoculação de 1 mL dessa amostra em uma placa com meio de cultivo resultará no crescimento de 10 mil colônias e não será impossível fazer a contagem. Mas se 1 mL de leite for transferidos para um turbo contendo 9 mL de água peptonada, cada mL da amostra deste tubo conterá 1000 bactérias. Esse número ainda é grande para fazer a contagem. Portanto, uma nova diluição seriada deverá ser realizada, transferindo 1 mL (com 1000 bactérias) para um novo tubo com 9mL de água peptonada; nesse último tubo, cada mL conterá 100 bactérias, que quando inoculado deverá originar 100 colônias, que podem ser facilmente contadas.	
Objetivos
Determinar o número de colônias de bactérias presente na suspensão através dos métodos de contagem em placa.
2.0 Metodologia
Para preparação da amostra em estudo, no nosso caso, uma bebida láctea, e para as diluições seriadas, foi separado quatro tubos de ensaio com cerca de 9mL de água peptonada, previamente identificados com as seguintes marcações: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Para dissolução da bebida, utilizamos 225mL de água peptonada, para 25 mL da bebida em estudo. Pipeta automática de 1mL.
Primeiramente foi feita a diluição da bebida láctea da seguinte forma: com auxílio de uma pipeta, extraímos 25mL da bebida láctea diretamente da embalagem. Em seguida, diluímos em um frasco de diluição com 225mL de água peptonada. Homogeneizamos a mistura em forma de arco várias vezes seguidas. Esta primeira diluição é chamada 10-1.
Para a segunda diluição, com auxílio da pipeta automática, extraímos 1mL dessa primeira solução e colocamos no primeiro tubo de ensaio, nomeado 10-2, já com 9 mL água peptonada. O procedimento é feito perto da chama, para evitar possíveis contaminações. É feita a homogeneização desse tubo, também em forma de arco, cerca de 6 vezes seguidas.
Para terceira diluição, extraímos 1mL do tubo 10-2, e colocamos no tubo 10-3. Foi feita a homogeneização. Repetimos esse processo até atingir o tubo 10-5.
Depois de feita as diluições, é necessária a preparação do meio para cultivar os microrganismos. Utilizamos duas técnicas: Contagem pelo método de plaqueamento em profundidade e método do plaqueamento em superfície. 
2.1 Método de plaqueamento em profundidade
Selecionamos três diluições adequadas da amostra, nesse caso, como a contagem esperada é alta, devido ao fato de ser uma bebida láctea, e por natureza do alimento conter bactérias lácteas, selecionamos os tubos 10-3, 10-4, 10-5 e colocamos 1mL de cada em placas de Petri separadas, esterilizadas e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta. Sempre com o cuidado de manusear o experimento corretamente, evitando possíveis contaminações. 
Foi escolhido o meio PCA para bactérias. Aquecemos o meio em um aparelho de micro-ondas, e esperamos esfriar um pouco, até atingir a temperatura desejada, cerca de 45ºC. Colocamos o meio de cultura nas placas, numa superfície plana, em movimentos de oito ou movimentos circulares, de oito a dez vezes. 
Após adicionar o meio em todas as placas, aguarda-se a solidificação completa do meio de cultura, e em seguida é feita a incubação do material, feito em temperatura por volta de 36ºC.
2.2 Método de plaqueamento em superfície
Para o plaqueamento em superfície, o meio já está previamente preparado e solidificado. Selecionamos as amostras para estudo, e colocamos 0,1mL de cada diluição nas placas previamente preparadas, e usando uma alça de Drigalski, espalhamos o inoculo por toda a superfície do meio, até que todo o excesso de líquido seja absorvido.
Aguardamos a secagem das placas, invertemo-las e foi feita a incubação do material, em temperatura por volta de 36ºC.
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2.3 Contagem
Realizamos a contagem propriamente dita na semana seguinte, após dar o tempo das bactérias se multiplicarem. Bactérias de bebida láctea apresentam maior contagem devido ao fato de serem adicionadas propositalmente bactérias fermentadoras na bebida. 
A contagem tanto para superfície, quanto para profundidade, é feita com auxílio da lupa e canetas marcadoras preta e azul, para diferenciar colônias maiores e menores. 
Resultados
Realizamos a contagem de bactérias em superfície, da placa 10-3. Contamos 158 colônias grandes e 85 colônias pequenas, totalizando um total de 243 colônias. 
Cálculo: 2,43 x 10² x 10³ x 10 = 2,40 x 106 
Logo, observamos que o alimento atendeu às conformidades, por está dentro da legislação brasileiraque tem uma previsão de 1 milhão de bactérias/mL.
Preparamos uma lâmina com uma colônia qualquer da placa de superfície, e fomos checar no microscópio. Foi encontrado Staphylococos, logo, possivelmente o alimento estava contaminado, pois é esperado encontrar bacilos de bactérias lácteas ou Streptococos.