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Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 1 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 1 BIOQUÍMICA 2º Período Medicina UFG Sumário DIAGNÓSTICO MOLECULAR ............................................................................................................... 6 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADOS AO DIAGNÓSTICO CLÍNICO.......................................... 7 PRINCÍPIOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR ................................................................................................................ 7 O PROCESSO BIOLÓGICO DETERMINA O MÉTODO DE DIAGNÓSTICO ............................................................................... 7 A REVOLUÇÃO DA BIOLOGIA MOLECULAR................................................................................................................ 9 TÉCNICAS BASEADAS EM ÁCIDOS NUCLEICOS ............................................................................................................. 9 Técnicas de hibridização .......................................................................................................................... 10 Técnicas baseadas no DNA ...................................................................................................................... 11 Técnicas baseadas no RNA ...................................................................................................................... 13 TÉCNICAS BASEADAS EM PROTEÍNAS...................................................................................................................... 13 TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE ................................................................................................ 15 Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 2 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 2 DIAGNÓSTICO MOLECULAR.................................................................................................................................. 15 TESTE ELISA ......................................................................................................................................... 17 SINALIZAÇÃO CELULAR .................................................................................................................... 18 MECANISMOS DE TRANSDUÇÃO DE SINAL ASSOCIADOS À EXPRESSÃO.................................................. 19 SINALIZAÇÃO CELULAR ........................................................................................................................................ 19 RECEPTOR DE INSULINA – INDUÇÃO DA TRANSCRIÇÃO GÊNICA .................................................................................... 24 REGULAÇÃO PELO CGMP ................................................................................................................................... 24 CÁLCIO ............................................................................................................................................................ 25 ENZIMAS REGULADAS PELO CAMP ....................................................................................................................... 25 FOSFATIDIL-INOSITOL DERIVADOS ......................................................................................................................... 26 TUMORES ........................................................................................................................................................ 26 AÇÃO HORMONAL ............................................................................................................................................. 26 APOPTOSE .......................................................................................................................................... 28 DIVISÃO CELULAR ................................................................................................................................ 31 PRINCIPAIS GRUPOS ........................................................................................................................................... 31 VIAS DE TRANSDUÇÃO DE SINAL .......................................................................................................... 33 ETAPAS DA VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL .............................................................................................................. 33 VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL DA EPINEFRINA ................................................................................... 35 FINALIZAÇÃO DO SINAL DA EPINEFRINA .................................................................................................................. 37 VIA DE SINALIZAÇÃO DE FOSFOINOSITÓIS ............................................................................................ 40 CÁLCIO E CALMODULINA ..................................................................................................................... 42 Calmodulina ............................................................................................................................................. 43 VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL DA INSULINA ....................................................................................... 44 AÇÃO SECUNDÁRIA DA INSULINA .......................................................................................................................... 46 VIA DE TRANSDUÇÃO DE SINAL DO EGF ............................................................................................... 48 PROPRIEDADES COMUNS ÀS VIAS DE SINALIZAÇÃO .............................................................................. 51 SINALIZAÇÃO CRUZADA DA CÓLERA E PROTEÍNA G .............................................................................. 53 APOPTOSE (MORTE CELULAR PROGRAMADA) ...................................................................................... 55 Via intrínseca da apoptose ...................................................................................................................... 55 Via extrínseca da apoptose ..................................................................................................................... 56 Fator indutor de apoptose ....................................................................................................................... 56 Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 3 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 3 CÂNCER E FINALIZAÇÃO DAS VIAS DE SINALIZAÇÃO .............................................................................. 57 METABOLISMO ................................................................................................................................. 59 INTRODUÇÃO AO METABOLISMO ........................................................................................................ 60 CATABOLISMO E ANABOLISMO ............................................................................................................................. 62 METABOLISMO ENERGÉTICO................................................................................................................................ 64 CARBOIDRATOS................................................................................................................................ 66 METABOLISMO DE CARBOIDRATOS ..................................................................................................... 67 TRANSPORTADORES DE GLICOSE ........................................................................................................................... 67 METABOLISMO DA GLICOSE .................................................................................................................................70 GLICÓLISE ........................................................................................................................................... 73 DETALHAMENTO DAS ETAPAS DA GLICÓLISE ............................................................................................................ 74 VIAS ALIMENTADORAS DA GLICÓLISE ..................................................................................................................... 79 Galactose ................................................................................................................................................. 80 manose .................................................................................................................................................... 81 Frutose ..................................................................................................................................................... 81 Polissacarídeos e dissacarídeos ............................................................................................................... 83 PIRUVATO ........................................................................................................................................... 85 DESTINOS DO PIRUVATO ..................................................................................................................................... 85 DESCARBOXILAÇÃO DO PIRUVATO EM ACETILCOENZIMA A ......................................................................................... 87 CICLO DE KREBS................................................................................................................................... 89 DETALHAMENTO DAS ETAPAS DO CICLO DE KREBS .................................................................................................... 89 ANABOLISMO DOS INTERMEDIÁRIOS DO CICLO DE KREBS ........................................................................................... 92 INTERAÇÃO DO CICLO DE KREBS COM OUTRAS VIAS .................................................................................................. 94 REGULAÇÃO DO CICLO DE KREBS .......................................................................................................................... 95 CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS ............................................................................................ 98 LANÇADEIRAS DE COENZIMAS .............................................................................................................................. 99 CONSTITUINTES DA CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS ................................................................................... 101 DETALHAMENTO DA CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS .................................................................................. 103 FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA ................................................................................................................106 REGULAÇÃO DA CADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS/FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA ................................................... 107 Desacoplamento .................................................................................................................................... 108 Verificação do comportamento da cadeia transportadora .................................................................. 110 Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 4 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 4 SALDO DA RESPIRAÇÃO CELULAR ........................................................................................................112 GLICONEOGÊNESE ..............................................................................................................................114 GLICONEOGÊNESE A PARTIR DE PIRUVATO ............................................................................................................ 114 Via principal ........................................................................................................................................... 115 Via secundária ....................................................................................................................................... 117 REGULAÇÃO DA GLICÓLISE/GLICONEOGÊNESE ....................................................................................................... 118 VIA DAS PENTOSES FOSFATO ..............................................................................................................121 DETALHAMENTO DAS ETAPAS ............................................................................................................................ 124 Saldo da via das pentoses fosfato ......................................................................................................... 126 FORMAÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO.................................................................................................... 127 METABOLISMO DO GLICOGÊNIO .........................................................................................................130 ESTRUTURA DO GLICOGÊNIO .............................................................................................................................. 130 DEGRADAÇÃO DE GLICOGÊNIO ........................................................................................................................... 131 Glicogênio fosforilase ............................................................................................................................ 132 SÍNTESE DE GLICOGÊNIO ................................................................................................................................... 133 Efeito da insulina sobre o metabolismo do glicogênio .......................................................................... 134 REGULAÇÃO DO METABOLISMO DO GLICOGÊNIO ................................................................................................... 135 No fígado ............................................................................................................................................... 135 No músculo ............................................................................................................................................ 135 LIPÍDIOS ...........................................................................................................................................136 DEGRADAÇÃO DE LIPÍDIOS .................................................................................................................137 TRIACILGLICEROL ............................................................................................................................................. 137 METABOLISMO ENERGÉTICO DE ÁCIDOS GRAXOS ................................................................................................... 139 Detalhamento das etapas da beta-oxidação de ácidos graxos de número par de carbonos ............... 140 Saldo da beta-oxidação de ácidos graxos ............................................................................................. 141 FORMAÇÃO DE CORPOS CETÔNICOS .................................................................................................................... 141 METABOLISMO DO ETANOL ................................................................................................................143 SÍNTESE DE LIPÍDIOS ...........................................................................................................................144 Detalhamento das etapas da síntese de ácidos graxos ........................................................................ 144 Saldo da síntese de ácido palmítico ......................................................................................................145 Regulação da síntese de ácidos graxos ................................................................................................. 145 Modificações do ácido palmítico ........................................................................................................... 146 SÍNTESE DE TRIACILGLICERÓIS............................................................................................................................. 147 Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 5 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 5 METABOLISMO DO COLESTEROL .........................................................................................................148 SÍNTESE DE COLESTEROL ................................................................................................................................... 150 PROTEÍNAS ......................................................................................................................................152 METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS ......................................................................................................153 REMOÇÃO DO GRUPO AMINO DOS AMINOÁCIDOS.................................................................................................. 154 CICLO DA UREIA .............................................................................................................................................. 155 Balanço energético da bicicleta de Krebs .............................................................................................. 156 DEGRADAÇÃO DA CADEIA CARBÔNICA ................................................................................................................. 156 SÍNTESE DE AMINOÁCIDOS ................................................................................................................................ 157 BIOSSÍNTESE A PARTIR DE AMINOÁCIDOS.............................................................................................................. 158 REGULAÇÃO METABÓLICA ..............................................................................................................159 REGULAÇÃO METABÓLICA ..................................................................................................................160 NÍVEIS DE REGULAÇÃO ..................................................................................................................................... 160 REGULAÇÃO DO METABOLISMO ENERGÉTICO DA GLICOSE ........................................................................................ 161 REGULAÇÃO DA VIA DAS PENTOSES FOSFATO ........................................................................................................ 164 Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 6 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 7 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 7 Métodos de biologia molecular aplicados ao diagnóstico clínico Princípios de diagnóstico molecular • O diagnóstico molecular pode ter sua análise baseada tanto no DNA e RNA quanto em proteínas. A escolha por uma dessas biomoléculas deverá levar em conta a eficiência, a sensibilidade e os custos do método diagnóstico em questão. • O objetivo do diagnóstico molecular é identificar/analisar a expressão/presença de genes para fins diagnósticos, terapêuticos e biotecnológicos. • O processo de montagem de um diagnóstico molecular segue uma rota padrão, a saber: o Definição do organismo alvo (que pode ser bactéria, vírus, etc.); o Conhecimento do processo biológico e parasitológico do organismo alvo; o Desenvolvimento de processos de diagnóstico de ácidos nucleicos ou proteínas; o Desenvolvimento de processos de tratamento do resultado. • Os processos de tratamento do resultado são essenciais para a compreensão correta daquilo que está sendo analisado pelo método diagnóstico, para que não se incorra em erros de interpretação dos dados obtidos. o Ex.: não se pode associar a mera presença de um patógeno no organismo à sua capacidade de infecção nesse mesmo organismo. Por exemplo, por mais que um vírus seja detectado em um determinado organismo, não se pode afirmar que este sofrerá infecção, apenas baseando-se nessa detecção. Pode ser que o vírus esteja inócuo devido a erros em seu processo de transcrição, para os quais os vírus não têm meios de correção de erros, anulando, portanto, sua capacidade infecciosa (virulência). O processo biológico determina o método de diagnóstico • O conhecimento do processo biológico da maioria dos patógenos é basicamente o conhecimento de sua ação infecto-parasitária, permitindo que sejam estabelecidos meios adequados para sua detecção, quantificação, análise, etc. em organismos afetados. o Na maioria dos casos, a ação infecto-parasitária por patógenos segue o esquema: gene → proteína → infecção → colonização. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 8 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 8 o O conhecimento do processo biológico é capaz de determinar aquilo que será essencial para que o método diagnóstico seja eficiente. Ex.: uma infecção viral normalmente se expressa no meio intracelular, portanto, métodos diagnósticos para esse vírus deverão ser capazes de transpor obstáculos como a membrana celular das células do organismo. • A detecção de proteínas frequentemente passa pelo uso de anticorpos marcados, como ocorre em testes como o ELISA. Anticorpos são proteínas produzidas por células de defesa dos organismos capazes de reconhecer proteínas de patógenos, dessa forma recrutando outras células para combatê-los. Com isso, a produção de anticorpos acaba sendo dependente do repertório genético do próprio organismo e da forma com que o patógeno expressa suas proteínas. o Nesse caso, entretanto, alguns obstáculos se interpõem: a produção de anticorpos específicos para a proteína patogênica pode não acontecer devido à insuficiência do repertório; ou essa produção pode acontecer em quantidade muito diminuta; ou o anticorpo produzido pode não ter interação suficientemente forte com a proteína patogênica. ▪ Para superar estes obstáculos, os métodos de diagnóstico podem se valer de técnicas como: induzir a produção de anticorpos em outro organismo; ou induzir a maximização da produção de anticorpos no mesmo organismo; ou produzir anticorpos sintéticos. o Outro obstáculo seria o fato de que os vírus podem ter várias proteínas sendo expressas, mas o corpo pode produzir anticorpos contra apenas uma delas – favorecendo a ocorrência de testes falso-positivos no caso daquela proteína específica, para o qual o anticorpo foi produzido, estar ausente ou em mutação. ▪ Organismos patogênicos, aliás, têm alta taxa de mutação, o que também é outro grande obstáculo à detecção de suas proteínas. • Para que um gene forme proteínas, as etapas são DNA → transcrição → tradução. Assim, os métodos de diagnóstico podem focar em uma dessas etapas, a depender do comportamento do patógeno. o Ex.: Durante a transcrição, ocorre a produção de RNA, por isso, uma das técnicas de diagnóstico é promover a transcrição reversa do RNA, produzindo um DNA complementar (cDNA) que possa ser replicado ou Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 9 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 9 traduzido para identificaro patógeno. Como ele foi produzido a partir de RNA, este cDNA não possui os íntrons, ou seja, a parte que não é expressa. o Microarray e leitura robotizada: em um painel eletrônico, são posicionadas moléculas de cDNA controle conhecidas em locais fixos. Depois, elas são hibridizadas com cDNA do organismo que se está experimentando, estando este cDNA experimental marcado com fluorescência. É aplicado laser sobre o painel, capaz de excitar os cDNA e torná-los fluorescentes. Assim, os cDNA que o organismo possuir estarão visíveis, e, como os locais de cada cDNA controle e conhecido são fixos, as proteínas deles derivadas serão conhecidas. A Revolução da Biologia Molecular • 1970: enzimas de restrição e Southern Blotting. Tornou possível digerir o DNA de maneira específica. • 1980: uso de sequências gênicas e clonagem. Tornou possível a hibridização do DNA para visualização. • 1990: inovação da PCR, vetores de expressão. Tornou possível a maximização do DNA com menos custos, a transferência de genes, e a identificação de bandas de DNA em técnicas como a RAPD. • 2000: técnicas automatizadas, kits e softwares de sequenciamento. Permitiu o sequenciamento de DNA a partir de pequenos fragmentos. • 2010: genômica e proteômica: estudo e análise de qualquer gene e suas interações. Permitiu o sequenciamento completo de DNA íntegro, o sequenciamento de DNA a partir do sequenciamento de proteína, e qualquer expressividade do DNA. Técnicas baseadas em ácidos nucleicos • Para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico baseados em ácidos nucleicos, é preciso ter a informação acerca das sequências alvo do material genético que estejam relacionadas a doenças genéticas e patógenos: o Se a sequência alvo é DNA codante, ela é um gene, estando relacionada a íntrons e éxons. Este gene pode determinar a doença estando normal, alterado ou em mutação. o A sequência alvo também pode ser DNA não codante, nesse caso podendo ser pseudogenes, repetições tandem (VNTR), satélites, regiões controladoras, etc. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 10 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 10 o Se a sequência alvo for um RNA, ela estará relacionada a eventos transcricionais e sinalização molecular. • Diferentemente de quando se usa proteínas, a detecção de ácidos nucleicos (especialmente DNA) durante a infecção permite a quantificação de patógenos com mais eficiência. Isso ocorre porque um único DNA circulante de um único patógeno pode produzir proteínas em larga escala, assim, a quantificação de proteínas não pode quantificar o patógeno. o Por outro lado, há exceções a essa regra, como é o caso das proteínas que são produzidas em menor escala e apenas em alguns momentos a depender da fase da infecção do patógeno. Nesses casos, a quantificação de proteína pode ser útil para a quantificação do patógeno. Técnicas de hibridização Figura 1: Esquematização do processo de hibridização do DNA a partir de duas amostras distintas. • Conforme visto anteriormente, a hibridização de ácidos nucleicos requer sondas moleculares formadas a partir de uma região do DNA molde, chamada template. Para isso, a sequência alvo a ser analisada não pode ser muito variável entre o organismo, sob o risco de incompatibilidade com as sondas já preparadas. • A similaridade ou não da sequência alvo com a sonda determinará temperaturas de melting semelhantes, que, nos processos de hibridização, são usualmente elevadas. Com isso, a hibridização pode ser usada para se detectar mutações na sequência de DNA. Neste processo, uma sequência normal de DNA é hibridizada com uma sonda e sua temperatura melting (estringência) é calculada. Depois, caso a sonda Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 11 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 11 seja hibridizada com uma sequência mutante de DNA, sua estringência será alterada. o Quanto menos variar a temperatura necessária para separar o resultante híbrido com o mutante, menor será o tamanho da mutação, ficando a estringência ainda a temperaturas elevadas. o Quanto mais variar a temperatura necessária para separar o resultante híbrido com o mutante, maior será o tamanho da mutação, ficando a estringência em baixas temperaturas. Isso é explicado porque a hibridização de uma sonda com um mutante fará com que menos pontes de hidrogênio sejam formadas. ▪ Exemplo prático: uma DNA saudável tem temperatura melting de 50°C. Ele sofreu uma mutação e essa temperatura passou a ser 48°C, ou seja, variou pouco, apenas 2°C. Isso significa que a mutação foi pequena e a estringência permaneceu elevada. Se ele sofrer uma mutação e esse temperatura passar a ser 30°C, ou seja, variar muito, de 20°C, isso significa que a mutação foi grande, e a estringência diminuiu. o Desta forma, o uso de sondas não é muito adequado para identificar pequenas alterações na DNA, estando a estringência do mutante muito próxima da estringência do normal. • Nas técnicas de hibridização, as sondas podem ser feitas a partir de DNA ou RNA. • A análise pode ser: o Direta, com a visualização direta dos genes, o que pode ser feito com gel PAGE ou agarose. Depende da singularidade e do tamanho da sequência. o Indireta, com sonda ou anelamento, ou marcação a frio ou a quente, em que só é possível visualizar usando algum outro artifício. Técnicas baseadas no DNA • Genes são melhores analisados pela técnica da PCR. o Genes de alto peso molecular podem ser analisados por cópia direta. É o caso de procariotos. É possível apenas analisar a presença, mas não quantificar. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 12 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 12 o Genes de baixo peso molecular precisam ser analisados por cópia de regiões específicas como éxons. É possível tanto analisar a presença quanto quantificar. o A análise direta pode ser feita em gel PAGE ou agarose, dependendo do tamanho. Nesse caso vai requerer marcadores de massa molecular, para análise por comparação e pelo peso molecular. • Restrições: o Os genes (ou regiões) precisam ter sequências estáveis para cada cópia. o Os iniciadores precisam ser iguais ao template • Assim, técnicas baseadas em DNA podem ser aplicadas para avaliar as seguintes modificações sofridas pelo DNA: transição, transversão, translocação, inversão, inserção, deleção, duplicação e supressão. • As principais técnicas nesse caso são: o Análise de cariótipo: detecta a integridade e a presença de cromossomos. Podem ser detectadas doenças que mudam a contagem de cromossomos, como síndromes de Down, de Edwards, Klinefelter, etc. o Hibridação com sondas moleculares: ▪ Técnica fish: combinação do teste do cariótipo com sondas de DNA. Podem ser detectadas alterações em cromossomos inteiros (como translocações) que causam doenças como a leucemia mieloide crônica, câncer pancreático e HPV. ▪ RFLP: uso de enzimas de restrição com sondas de DNA. Podem ser detectadas regiões específicas de mutação do DNA, que guardam relação com a paternidade e com isoenzimas. o PCR com primers específicos: ▪ PCR convencional ▪ Nested-PCR ▪ RFLP-PCR ▪ LAMP-PCR: técnica quantitativa para avaliar a amplificação do cDNA. É utilizado um primer especial que permite a amplificação do cDNA sem que seja necessário variar a temperatura. o Testes de paternidade com VNTR rearranjados; o Testes de doenças com VNTR rearranjados. Guilherme de Matos Abe – Acadêmicode Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 13 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 13 o Banco genético: útil apenas para procariotos, cuja expressão diferencial do DNA é pouco diversa. Nos eucariotos, a expressão do DNA é muito diversa, inviabilizando a existência desse banco de genes. Técnicas baseadas no RNA • A análise de RNA é útil para analisar o estado metabólico imediato das células, podendo se fazer comparações temporais do RNA que aquela célula estará transcrevendo. • As principais técnicas são: o qPCR: uso da transcriptase reversa e de primers de RNA. É possível fazer tanto a detecção quanto a quantificação de vírus de RNA, por exemplo. o Macroarray e microarray: no macroarray, a membrana contém moléculas de RNA a serem hibridizadas no maior tamanho possível, devido à dificuldade técnica em fazer isso com ferramentas convencionais. No microarray, o uso do biochip permite a colocação de moléculas de RNA a serem hibridizadas nos menores locais possíveis, pois há precisão robótica do processo. o Banco de expressão: é mais eficiente do que um banco genético, pois ele irá listar apenas a parte efetivamente expressa do DNA. • Ex.: teste de viroses transmitidas pelo Aedes aegypti. Em um tubo de ensaio, existem primers para o cDNA dos vírus da dengue, chikungunya e zika. Colhe-se uma amostra do RNA do vírus que está infectando o paciente e produz-se o cDNA a partir de transcriptase reversa. Esse cDNA será então amplificado por PCR a partir do primer apropriado que está dentro do tubo de ensaio. Com o cDNA amplificado, podem ser usadas outras técnicas para identificar a qual vírus pertence. Técnicas baseadas em proteínas • São técnicas que possuem a vantagem de seus alvos serem mais abundantes do que os ácidos nucleicos. • Por mais que entre organismos de mesma espécie possuam proteínas cuja expressão deve ser idêntica, existem algumas proteínas que podem ser expressas de maneira diferencial (isoenzimas). Essa expressão é regulada por diversos fatores, por isso, é possível identificar a influência deles por meio da análise de alguns parâmetros das proteínas, como sua performance. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 14 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 14 • A detecção de proteínas exógenas nos organismos indica a possível presença de patógenos nesses organismos, sendo uma das formas mais comuns de diagnóstico. o Tipicamente, a detecção de proteínas exógenas é feita com a avaliação de anticorpos (testes sorológicos), produzidos por células de defesa do organismo em resposta a proteínas produzidas pelos patógenos. ▪ Existem ainda técnicas capazes de quantificar essas proteínas exógenas. É o caso do teste ELIZA com diluição. o Técnicas baseadas em anticorpos são úteis porque os anticorpos são altamente sensíveis e específicos no reconhecimento de proteínas, e a visualização das proteínas é indireta (mas a do anticorpo é direta), a partir da identificação da reação do anticorpo com a proteína e da análise colorimétrica, que dá informações qualitativas e quantitativas. A limitação dessa técnica é uma exigência por uma grande pureza do material. ▪ O mesmo não acontece com análises de eletroforese, que envolve a análise visual individual de várias proteínas separadas no gel. • Assim, técnicas baseadas em proteínas podem ser aplicadas para avaliar os seguintes parâmetros biológicos e bioquímicos das proteínas: o Níveis de expressão; o Isoformas; o Modificações pós-traducionais; o Tempo de vida média e degradação; o Localização intracelular. • As principais técnicas são: o Teste sorológico (com anticorpos) para patógenos virais de DNA e RNA ▪ ELIZA: tubos com anticorpos primários ligados a uma amostra proteína que se quer testar, dentro dos quais então se coloca anticorpos secundários marcados com fluorescência. Se o tubo brilhar, então, é porque a proteína específica dele está presente. ▪ Luminex ▪ Teste rápido em tiras o dot blot: hibridização em fitas de nylon o imunodifusão o Kits de teste rápido: teste de gravidez. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 15 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 15 Tecnologia de DNA recombinante • O campo da biotecnologia emergiu do entendimento dos ácidos nucleicos, como eles funcionam e como são usados por sistemas biológicos (células e vírus). • A biotecnologia fornece meios de criar e manipular ácidos nucleicos e proteínas. Existem vários fatores essenciais que fazem o campo da biotecnologia possível. 1. Enzimas de restrição são usadas para clivar ácidos nucleicos em locais específicos. As enzimas de restrição são proteínas que podem cortar molécula de DNA em fragmentos menores que podem então ser manipulados. Muitas enzimas de restrição existem na natureza. 2. Sequenciamento de moléculas de DNA. É possível hoje determinar a sequência exata de nucleotídeos ao longo de moléculas de DNA. Isso fornece informações sobre a estrutura dos genes, como eles são expressos e quais proteínas formam. 3. Síntese precisa de ácidos nucleicos via método estado sólido. É possível criar um ácido nucleico específico de interesse do zero. Pode-se então estudá-lo ou amplificá-lo caso necessário. 4. Reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser usada para a amplificação do DNA. É possível criar muitas cópias de um fragmento de DNA de interesse. A PCR permite um processo de formar milhões e bilhões de cópias de um único segmento de DNA. É possível usar este método para detectar moléculas de DNA específicas, que podem ser úteis para determinar a presença de uma doença ou detectar e comparar o DNA deixado em uma cena de crime. 5. Southern e northern Blotting: essas duas técnicas podem ser usadas para detectar e isolar moléculas de DNA. 6. Avanços da computação moderna: a computação permite uma maneira de armazenar e acessar sequências de DNA, RNA e proteínas que são descobertas diariamente. Diagnóstico molecular • O diagnóstico molecular é uma coleção de técnicas usadas para analisar marcadores biológicos no genoma e no proteoma – o código genético de um indivíduo e como suas células expressam seus genes em proteínas – ao se aplicar a biologia molecular aos testes médicos. As técnicas são usadas para diagnosticar e monitorar doenças, detectar riscos e decidir quais terapias irão funcionar melhor para pacientes individualmente. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 16 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 16 o Por meio da análise das especificidades do paciente e de suas doenças, os diagnósticos moleculares oferecem o prospecto da medicina personalizada. • Tais testes são úteis em uma gama de especializações médicas, incluindo doenças infecciosas, oncologia, tipagem antigênica leucocitária humana (que investiga e prediz funções humanas), coagulação e farmacogenômica – a predição genética de quais drogas funcionarão melhor. Eles se justapõem à química clínica (testes médicos em fluidos corporais) Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 17 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 17 Teste ELISA • O ensaio de imunoabsorção enzimática (enzyme-linked immunosorbent assay) ou simplesmente ELISA é um método que utiliza anticorpos para determinar e quantificar a presença de alguma proteína específica. • ELISA indireto • Este método é usado para detectar a presença de um anticorpo específico.1. A superfície do poço é coberta com um antígeno específico. 2. Uma mistura de anticorpos é adicionada ao poço. Se o anticorpo de interesse estiver presente, ele irá se ligar ao antígeno. 3. Anticorpos de ligação enzimática que podem se ligar ao anticorpo de interesse são adicionados dentro do poço. Se o anticorpo de interesse estiver ligado ao antígeno, o anticorpo de ligação enzimática irá ligar ao complexo anticorpo-antígeno. 4. Anticorpos não ligados são removidos por lavagem. O substrato específico da enzima é então adicionado. Se a enzima está presente, o substrato irá reagir e causar uma mudança de cor. Isso significa a presença do anticorpo de interesse. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 18 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 18 SINALIZAÇÃO CELULAR Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 19 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 19 Mecanismos de transdução de sinal associados à expressão • Transmissão de sinal: as proteínas que agem no citoplasma são reguladas por meio de um processo chamado de sinalização. Então, os mecanismos de sinalização são responsáveis por ativar ou inativar essas proteínas. Entre esses mecanismos, tem-se, por exemplo: o Transporte em membranas: o impulso nervoso, o transporte ativo e o transporte passivo das substâncias podem interferir na performance das proteínas. Por isso, é uma ação direcionada ao citoplasma. o Regulação metabólica: sinalizadores extracelulares, como os hormônios, são mensageiros capazes de ampliar ou reduzir a ação celular, por meio da indução ou inibição da transcrição gênica, por exemplo. Por isso, é uma ação direcionada ao núcleo. • A sinalização é uma via de mão dupla: sempre depende que exista um agente sinalizador e um receptor desse agente na célula-alvo. Além disso, uma vez reconhecida a sinalização, também é essencial que a célula disponha de componentes para realizar aquilo que foi sinalizado (provocando uma cascata de sinais); caso contrário a sinalização será truncada, produzindo proteínas anômalas, que podem até mesmo provocar a apoptose da célula ou sua destruição por células de defesa. • Proteínas sinalizadoras: as proteínas envolvidas no processo de sinalização são 3: o Substrato receptor de insulina 1, o IRS-1; o Monofosfato guanosina cíclico, ou GMP cíclico (cGMP); o Proteína G. Sinalização celular • Sinalização por moléculas secretadas (sinalização parácrina): uma célula sinalizadora é capaz de liberar moléculas sinalizadoras, que serão então captadas por um receptor específico dessas moléculas presente na membrana de uma célula- alvo. Assim, uma célula pode ser mais ou menos sensível à molécula sinalizadora, a depender da quantidade de receptores que ela possui. Nesse caso, a ação sinalizadora se processa contanto haja esse contato molécula-receptor. Dessa forma, uma única célula sinalizadora pode afetar várias células-alvo devido à difusão das moléculas. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 20 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 20 • Sinalização por moléculas ligantes na membrana plasmática (sinalização contato- dependente): uma célula sinalizadora expressa, em sua membrana, uma molécula sinalizadora. Dessa forma, a célula sinalizadora precisa se aproximar do receptor da célula-alvo para provocar a sinalização, o que é menos eficiente do que a sinalização parácrina. • Sinalização endócrina: semelhantemente à sinalização parácrina, mas com a presença de um condutor da molécula sinalizadora até células-alvo em regiões mais distantes do local onde ela se encontra. • Sinalização sináptica: a sinalização sináptica se processa com a transmissão de um impulso elétrico através da membrana para só então haver a liberação de moléculas em células-alvo específicas. • Assim, existe uma gama de diversos sinais que podem iniciar a sinalização celular, fatores de crescimento, neurotransmissores, morfógenos, matriz extracelular, moléculas sinalizadoras na membrana de outras células, hormônios, citocinas, etc. • Erros de sinalização, como a ausência de fatores impeditivos para a sinalização terminem, podem provocar disfunções das mais variadas, como o câncer, doença na qual está ausente a sinalização para que a replicação celular seja interrompida. • Uma mesma molécula de sinalização pode, entretanto, provocar respostas diferentes em células-alvo diferentes. Isso vai depender do tipo de receptor que estiver sendo expresso pela célula-alvo. o Ex.: a acetilcolina, quando ligada ao receptor da célula muscular cardíaca, provoca diminuição de frequência e força de contração; quando ligada ao receptor da célula muscular esquelética, provoca contração; quando ligada ao receptor da célula glandular salivar, provoca secreção. o Certas moléculas de sinalização, como os morfógenos, também são capazes de provocar respostas diferentes a depender da concentração com a qual atingem a célula-alvo. Nesse caso, também serão relevantes a duração da sinalização e a exposição a múltiplos sinais (neste último caso, determinando a sensibilidade dos indivíduos). • Combinações de sinais podem induzir respostas celulares diferentes. Ex.: sozinha, uma determinada molécula sinalizadora é responsável pela manutenção da célula viva. Quando combinada a uma segunda molécula sinalizadora, é responsável por fazer a célula crescer e dividir. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 21 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 21 • Os tipos de resposta ao sinal são muito variáveis: o Ativação enzimática. Ex.: ativar a via da glicólise para obtenção de energia. o Alteração da organização do citoesqueleto. Ex.: projeção de pseudópodes pelo macrófago para fagocitar patógenos. o Alteração da permeabilidade aos íons o Ativação da síntese de DNA o Ativação da síntese de RNA o Morte celular ▪ Assim, a comunicação (sinalização) celular é capaz de afetar todos os aspectos da estrutura e função celular, servindo para regulação do crescimento e divisão celular. • O fim da resposta pode ocorrer por destruição/inativação da molécula sinalizadora, ou por diminuição do nível do estímulo extracelular (isto é, diminuição da concentração da molécula sinalizadora). • Tradução/conversão do sinal: o sinal recebido na superfície celular é diferente do sinal transmitido ao interior da célula. o Mais comumente, a ativação ou inativação de proteínas no interior da célula é feita através da adição de fosfato por proteínas quinases, e desfosforilação por proteínas fosfatases. • As vias de sinalização compostas por diferentes proteínas geralmente funcionam por alteração da conformação da proteína substrato, ativando ou inativando essa proteína substrato. Assim, o sinal fica mais forte, pois uma sinalização é capaz de afetar várias proteínas, maximizando a ação coletiva delas, que podem ser enzimas, canais iônicos, fatores de transcrição ou vários tipos de unidades de regulação. o Ex.: sinalização por fosforilação: em que normalmente uma proteína quinase, dependente de ATP, ativa uma proteína, ligando-a ao fosfato do ATP (e consequentemente convertendo-o em ADP). Já a fosfatase inativa a proteína ao remover seu fosfato. o Ex.2: sinalização por ligação de GTP: a ligação de GTP a uma proteína a torna ativa. Já a hidrólise desse GTP o converte em GDP após remover seu fosfato, o que inativa a mesma proteína. Para que ela possase ligar a GTP novamente, ela precisa remover a GDP. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 22 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 22 • Existe também comunicação cruzada entre vias de sinalização, ou seja, compartilhamento de componentes entre diferentes vias metabólicas, o que torna o metabolismo celular bastante intrincado. Isso garante o sucesso de vias metabólicas mais importantes (como a ativação de proteínas regulatórias de genes), pois a ocorrência dessas primeiras vias indica a presença dos componentes necessários para as vias importantes. • Sinais distintos reconhecem receptores específicos. Por exemplo, tem-se um sinal A, um sinal B, um sinal C1, um sinal C2, um receptor 1, um receptor 2 e um receptor 3. o O sinal A é reconhecido apenas pelo receptor 1. o O sinal B é reconhecido pelo receptor 2, mas influencia o receptor 1. o Os sinais C1 e C2 são apenas reconhecidos pelo receptor 3. • Esquema geral da sinalização: um sinal (ligante), no ambiente extracelular, se liga a um receptor na membrana plasmática. Isso faz com que uma cascata de moléculas sinalizadoras intracelulares seja ativada, permitindo a ativação de: o Proteínas reguladoras da expressão gênica, podendo assim alterar a expressão gênica por meio da alteração da transcrição gênica; o Enzimas metabólicas, podendo assim alterar o metabolismo intracelular, sendo um mecanismo independente da transcrição gênica; o Proteínas estruturais, podendo assim alterar a morfologia da célula, sendo também um mecanismo independente da transcrição gênica. • Curso temporal da sinalização: as vias de sinalização intracelular (desencadeadas pela ligação de uma molécula sinalizadora extracelular à sua proteína receptora de membrana) podem seguir para o citoplasma, alterando a função de uma proteína; ou para o núcleo, alterando a expressão gênica (e, portanto, a síntese proteica). Embora em ambos os casos haja alteração da maquinaria citoplasmática (e, consequentemente, do comportamento celular), no citoplasma, a ação é rápida, demorando de menos de segundos a minutos; já no núcleo, a ação é lenta, demorando de minutos a horas. • Segundos-mensageiros: segundos-mensageiros são moléculas sinalizadoras intracelulares. Seus níveis são alterados após a ativação do receptor pelo ligante, que é chamado de primeiro-mensageiro. Os exemplos mais importantes (e mais Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 23 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 23 fortes) são: Ca2+, cAMP, cGMP, DAG e IP3. Possuem diversos efeitos biológicos no interior da célula. o Certos receptores, entretanto, dispensam os segundos-mensageiros, sendo capazes de promover a mesma ação que eles diretamente. • Em algumas vias, a ativação do receptor resulta em indução de atividades enzimáticas específicas. o Ex.: moléculas sinalizadoras intracelulares, cuja atividade é regulada por uma alteração pós-traducional, como fosforilação (por quinases que adicionam fosfato) e desfosforilação (por fosfatases que removem fosfato), têm esses processos desencadeados pela ativação ou não de um determinado receptor específico de membrana por seu ligante. o As regiões onde ocorre a fosforilação e a desfosforilação dos receptores de membrana que precisam de ativação, esses casos, normalmente são os seus resíduos de tirosina e serina. • Por que processos que ocorrem nas vias de transdução de sinal não são cruzados? o Em primeiro lugar, o padrão conformacional da porção extracelular do receptor é atraente para a molécula sinalizadora. Quando eles se ligam, há mudança conformacional no receptor, o que faz com que sua porção intracelular seja atraente para uma proteína quinase. A ação dessa proteína quinase será fosforilar a porção intracelular do receptor, alterando novamente sua conformação, desta vez tornando-a atraente para uma molécula efetora inativa. A ligação do receptor fosforilado com a molécula efetora é capaz de ativar essa molécula, que passa a agir sobre outras moléculas na célula. ▪ A cascata de eventos provocada pela molécula efetora também é capaz de provocar a inibição da fosfatase (que seria capaz de inativa o receptor). Entretanto, com o progresso temporal da sinalização, eventualmente essa capacidade de inibição da fosfatase começará a ser estancada, deixando a fosfatase ativa para inibir o receptor. o O receptor será capaz de promover essa ativação de moléculas efetoras durante todo o tempo que estiver ligado à molécula sinalizadora. ▪ Assim, a intensidade geral sinal promovido pela molécula sinalizadora não vai depender somente da concentração desta Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 24 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 24 molécula, mas também do tempo que ela permanecerá ligada ao seu receptor. o A insulina, caso tenha uma ligação prolongada no receptor, vai provocando efeitos cada vez mais gradativos: primeiro, a captação de glicose; depois, a síntese de glicogênio para poder captar mais glicose; depois, a síntese de lipídios para captar mais glicose; depois, a síntese de proteínas sintetizadoras de lipídio e glicogênio (alcança o núcleo, na transcrição gênica). o Respostas envolvendo proteínas G são mais lentas do que respostas envolvendo ATP, que são mais rápidas. Isso ocorre porque a proteína G não é ativa, ela depende da ligação com uma outra proteína substrato, formando um complexo ativado funcional. Já o ATP (cAMP) é capaz de ativar uma enzima por si próprio. Assim, para reverter a ação da proteína G, basta desfazer o complexo ativado. Para reverter a ação do ATP, é necessário desfosforilar a proteína que ele ativou com uma fosfatase. • Dupla ação da insulina: o Ativação da via PI-3K-PKB que afeta o metabolismo do glicogênio, no sentido de sintetiza-lo (as quinases ativam a glicogênio sintetase). o Ativação da via GRB2-Sos-Ras-MAPK que afeta a regulação gênica incentivando a transcrição de vários genes. o Outros efetores: adenilato ciclase (cAMP). • Mais comumente, a ativação de receptores provoca a seguinte cascata de eventos: ativação do cAMP, ativação do IP3, ativação do cGMP e então transcrição gênica. Receptor de insulina – indução da transcrição gênica • As proteínas receptoras parecem conter 2 subunidades (dímeros). • Possuem atividade de tirosina quinase, ativando IRS-1, ou de fosfatase, podendo agir sobre proteínas de membrana. Regulação pelo cGMP • Age de modo diferente em diferentes tecidos (rins, intestino, coração, cérebro, etc.). • As proteínas G possuem, assim, receptores diferentes para gerar sinais diferentes. De maneira geral, suas características comuns são: o Receptor na membrana plasmática; o Semelhante ao receptor beta-adrenérgico, que ativa cAMP. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 25 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 25 o Susceptível a 4 tipos: agonistas e antagonistas; o Medeiam respostas diferentes à adrenalina. • No rim, a proteína G promove regulação iônica. • No intestino, a proteína G promove a retenção de água. • No coração, a proteína G promove relaxamento. • No cérebro, a proteína G promove desenvolvimento e maturação. Estímulo Receptor Efetor Resposta fisiológica Epinefrina Receptor beta- adrenérgico Adenilato ciclase Degradação de glicogênio Serotonina Receptor de serotonina Adenilato ciclase Sensibilização comportamental e aprendizado Luz Rodopsinafosfodiesterase cGMP Excitação visual Complexos de antígenos IgE Receptor celular de IgE do mastócito fosfolipase C Secreção • Doenças graves também podem ser causadas por alterações nas proteínas G. Cálcio • É um potente segundo mensageiro. Ele provoca: o Divisão celular o Secreção o endocitose o Fertilização o Transmissão sináptica o Metabolismo o Movimento celular • Por isso, os níveis citoplasmáticos de cálcio devem ser mantidos baixos, por isso tem-se: o Membrana impermeável a cálcio o Sistemas de transporte removem cálcio do citoplasma o Necessidade de canais iônicos ou transportadores de cálcio regulados Enzimas reguladas pelo cAMP Enzima Rota Glicogênio sintase Síntese de glicogênio fosforilase b quinase Degradação de glicogênio Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 26 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 26 piruvato quinase (fígado de rato) Glicólise Complexo piruvato desidrogenase (tipo L) Conversão de piruvato em acetil-CoA Fosfofrutoquinase-2 / Frutose 2,6- bifosfato Glicólise / gliconeogênese Tirosina hidroxilase Síntese de L-DOPA, dopamina, noradrenalina, adrenalina Histona H1 e H2B Condensação de DNA fosfolamban cardíaca Regulação de íons cálcio intracelular Proteína fosfatase-1 inibidor-1 Regulação de desfosforilação de proteínas CREB Regulação cAMP de expressão gênica • Alguns sinais que usam cAMP como segundo-mensageiro: corticotrofina (ACTH), hormônio liberador de corticotrofina (CRH), dopamina, epinefrina, hormônio folículo-estimulante (FSH), prostaglandina. fosfatidil-inositol derivados • Sinais que possuem fosfatidil-inositol derivados como segundo-mensageiros (que atuam através da fosfolipase C e IP3): acetilcolina, agonistas alfa-adrenérgicos, angiotensina. Tumores • Aparecimento de tumores: alterações nos mensageiros intracelulares e/ou de suas cascatas. • Existem promotores de tumores que precisam ser suprimidos. Ação hormonal • O hormônio é carregado para o tecido-alvo em proteínas ligantes de soro, se difunde pela membrana plasmática, e se liga a proteínas receptoras específicas no núcleo. • Dentro da célula, o hormônio vai para o núcleo. A ligação do hormônio muda a conformação da proteína receptora específica. Forma homodímeros ou heterodímeros com outros complexos receptores de hormônios e se liga a regiões regulatórias específicas chamadas elementos de resposta hormonal (HREs) no DNA adjacente a genes específicos. • A ligação regula a transcrição de genes adjacentes, aumentando ou diminuindo a taxa de formação de mRNA. • Níveis alterados do produto do gene regulado por hormônio produzem a resposta celular ao hormônio. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 27 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 27 • Os hormônios podem também ativar o cAMP. Entretanto, como hormônios são liberados em pequena quantidade, a energia gerada na rota de sinalização não é significativa. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 28 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 28 Apoptose • A célula possui sistemas de sinalização externa, que permitem a comunicação do meio externo; e de sinalização interna, que é o sistema housekeeping, para manter a célula íntegra. • As vias de sinalização externa precisam ter mecanismos próprios para que não haja confusão de sinais no interior. Assim, vias específicas ativam proteínas e enzimas específicas. o Usualmente, as proteínas do sistema constitutivo possuem menos afinidade por moléculas que sejam comuns (como o cAMP) às proteínas de vias externas. Isso permite que, em uma via externa, possam ser geradas menos moléculas de cAMP, que terão muita afinidade pelas proteínas dessa via. Também pode ser que proteínas moduladoras inibam as vias constitutivas para permitir maior eficiência das vias externas. • Erros nessa cadência precisam ser detectados pela célula para impedir o prolongamento dos erros. Isso ocorre de duas formas: o Os próprios erros das vias podem ser letais à célula, devido à produção errônea e inadequada de proteínas que podem ser apoptóticas; o Os erros da célula ativarem enzimas apoptóticas programadas para esse fim. • Funções da apoptose: o Elimina células danificadas/prejudiciais; o Fisiologicamente ocorre: ▪ Na renovação de células epiteliais e hematopoiéticas ▪ Mantém número constante de células nos tecidos adultos (ex.: células do sangue eliminadas por morte celular programada por dia, em adultos) ▪ Colapso endometrial durante a menstruação ▪ Deleção de células nas criptas intestinais ▪ Regressão de tumores o Papel importante no desenvolvimento embrionário: ▪ Eliminação do tecido larval durante metamorfose (anfíbios e insetos) ▪ Eliminação da membrana interdigital (animais) ▪ Eliminação de neurônios em excesso (em excesso, provoca doenças neurodegenerativas) Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 29 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 29 o Mecanismo de defesa: ▪ Células infectadas por vírus ▪ Células com danos no DNA ▪ Células cancerosas • Células apoptóticas são bioquimicamente reconhecíveis: durante a apoptose, uma endonuclease cliva o DNA cromossomial em fragmentos de diferentes tamanhos, que podem ser observados por gel de eletroforese ou por TUNEL (marcação de extremidades de dUTP mediada por um TdT). • Necrose: processo patológico (autólise das células). É resultado de uma lesão maciça no tecido. Caracterizada por: o Inchaço citoplasmático o Ruptura da membrana celular e vazamento do plasma celular o Resposta inflamatória e reação de tecido patológico com grande extensão de células afetadas simultaneamente o Resulta da alteração súbita de um ou mais intervalos fisiológicos (pH, temperatura, concentração iônica, etc.) o O citoplasma “incha” o Resulta da inviabilização metabólica da célula o Não tem funções homeostáticas o Fenômeno coletivo a todas as células vizinhas o Resulta na perda de integridade da membrana o O derramamento do fluido celular inicia processos de inflamação que duram horas ou dias e originam marcas duradouras • Apoptose: evento fisiológico (processo de eliminação celular controlado). É uma sequência de eventos que levam à morte celular em uma variedade de diferentes sistemas. o Determinada geneticamente o Ocorre dentro dos intervalos fisiológicos o A célula fica extremamente compactada, não extravasa citoplasma o Resulta de diversos passos intrinsecamente regulados o Participa no equilíbrio homeostático do organismo o Fenômeno individual celular (suicídio celular) o Nunca ocorre perda de integridade da membrana Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 30 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 30 o As vesículas formadas são removidas por fagocitose, num processo muito rápido que não deixa vestígios • Autofagia: “canibalismo próprio” da célula. Degradação de organelas e citoplasmas pelos lisossomos e vacúolos. Há liberação de vacúolos com proteases que provocam lise. • Mecanismo extrínseco: um sinal extracelular é capaz de ativar as caspases diretamente, e de maneira irreversível. A caspase fica ligada no receptor do sinal extracelular, assim, o sinal irreversivelmente provoca a apoptose. • Mecanismo intrínseco: problemas internos na célula maissérios ativam caspases iniciais, que permitem ainda um tempo para o problema ser contornado. Se o problema não for corrigido, são ativadas caspases finais, e a apoptose é induzida. Assim, a ativação das caspases é gradual. o Quando a p53 aumenta sua concentração, ela dispara o mecanismo intrínseco. o A via intrínseca da apoptose depende da mitocôndria. Proteínas da membrana mitocondrial normalmente se mantêm separadas umas das outras por componentes proteicos. A ação da caspase é destruir esses componentes proteicos (proteína BAD – promotor de morte associado a Bcl-2) e provocar a aglutinação dessas proteínas, que perfura a membrana e provoca o extravasamento do conteúdo da mitocôndria, como o citocromo C. O citocromo C forma o complexo apoptossomo, sequestrando caspase para induzir apoptose. ▪ Na via extrínseca, a proteína BAD é removida diretamente. Na via intrínseca, a remoção da proteína BAD é removida após um longo processo de ativação de caspases iniciais, desencadeado por um erro na replicação, em que são produzidas proteínas p21 e p53. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 31 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 31 Divisão celular • As ciclinas são uma família de proteínas que controlam a progressão das células através do ciclo celular ao ativar enzimas quinases ciclina-dependentes (Cdk). • As ciclinas são proteínas ativadoras dos eventos da replicação celular. Um dos elementos finais da cascata desencadeada pela ciclina é inativar proteínas que poderiam abortar o processo. Atuação das proteínas p21 e p53. • A atuação das ciclinas é sequencial. Assim, a primeira ciclina atua durante um tempo, sendo posteriormente inativada pela produção da segunda ciclina, que passa a ter sua atuação, e assim por diante. • As ciclinas precisam, na fase G1 ativar vias para a produção de energia para que a célula consiga replicar (sintetizando RNAs e proteínas relacionadas a essas vias). Elas também promovem a replicação de todos os componentes celulares que serão ativos nas próximas fases do ciclo celular e que serão distribuídos nas duas novas células. • O hormônio do crescimento desencadeia a replicação celular. • Na fase S, as ciclinas induzem a replicação do material genético por polimerização do DNA. • Na fase G2, as ciclinas ativam proteínas fiscalizadoras para verificar se o DNA produzido até aquele instante está correto. Se elas verificarem erros, elas enviam sinais para induzir a inativação do ciclo celular para que haja reparação do DNA. Se o erro não for reparado, a célula entra em apoptose. • Para começar a mitose, as ciclinas precisam ativar a síntese de histonas para promover a condensação de DNA. No final, ela ativa a citocinese. • A ciclina é ativada por fosforilação, e é inativada pelo proteassomo. Principais grupos • Existem dois grupos principais de ciclinas: o Ciclinas G1/S: essenciais para o controle do ciclo celular na transição da fase G1 para a fase S, durante a intérfase. ▪ Ciclina A / CDK2: ativa na fase S ▪ Ciclina D / CDK4; ciclina D / CDK6; ciclina E / CDK2: regulam a transição da fase G1 para a fase S. o Ciclinas G2/M: essenciais para o controle do ciclo celular na transição da fase G2 da intérfase para o começo da mitose. As ciclinas G2/M se Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 32 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 32 acumulam de forma constante durante a fase G2 e são abruptamente destruídas no momento em que a célula sai da mitose. ▪ Ciclina B / CDK1: regulam a progressão da fase G2 para a fase de mitose. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 33 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 33 Vias de transdução de sinal • Mudanças químicas no ambiente ao redor das células podem influenciá-las a realizar processos que terminam por levar a algum tipo de resposta fisiológica. O conjunto de eventos que começa com a presença da molécula sinalizadora e termina com uma resposta fisiológica real é chamado de via de transdução de sinal. • Alguns exemplos de moléculas sinalizadoras são a epinefrina, a insulina e o fator de crescimento epidérmico. Etapas da via de transdução de sinal 1. Liberação da molécula sinalizadora apropriada. O órgão ou glândula específico deve liberar a molécula sinalizadora, também chamada de primeiro-mensageiro. Esta liberação é induzida por algum tipo de estímulo. 2. Ligação do primeiro-mensageiro a seu receptor. O primeiro mensageiro localiza e se acopla em um receptor, que normalmente são proteínas transmembrana. Estes receptores possuem um componente extracelular e um intracelular. A ligação do ligante do primeiro-mensageiro no componente extracelular leva a mudanças estruturais na proteína de membrana. 3. Aumento da concentração de um segundo-mensageiro. Uma vez que a informação seja transduzida pela membrana celular, a célula reage aumentando a produção de algum tipo de molécula intracelular chamada de segundo-mensageiro (ex.: cAMP, Ca2+, etc.). a. Isso resulta na amplificação do sinal. Assim, uma baixa concentração do primeiro-mensageiro é capaz de, após se ligar ao receptor, induzir a produção de uma alta concentração de segundos-mensageiros intracelulares. b. Segundos-mensageiros são livres para se mover pela célula; isso significa que eles podem influenciar diferentes processos em diferentes compartimentos da célula. 4. Ativação ou inibição de moléculas efetoras. Moléculas efetoras são moléculas que são responsáveis por realizar algum tipo de processo celular que ao fim leva à resposta fisiológica. a. Moléculas efetoras podem ser moléculas indutoras de transcrição, enzimas, canais, bombas, etc. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 34 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 34 b. Ex.: uma molécula efetora pode induzir a expressão de um determinado gene, produzindo uma proteína correspondente que realize um certo processo. 5. Finalização da via. As vias devem ser finalizadas em momentos apropriados. A falha em se finalizar pode levar a consequências danosas, como o surgimento de células cancerosas. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 35 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 35 Via de transdução de sinal da epinefrina • Uma importante classe de receptores das vias de sinalização são os receptores hepta-helicoidais transmembrana (7TM). Esses receptores possuem 7 α-hélices que movimentam a membrana em forma de serpente. Dessa forma, são chamados de “receptores serpentina”. Figura 2: Receptor 7TM. • Primeiros-mensageiros como hormônios, neurotransmissores e drogas sintéticas podem se ligar no sítio catalítico pela porção extracelular do receptor. Em alguns casos, o receptor 7TM pode possuir domínios proteicos adicionais acoplados na porção intracelular. • No caso da via de transdução de sinal da epinefrina, ela se liga em um receptor 7TM chamado de receptor β-adrenérgico (β-AR). Figura 3: Receptor β-adrenérgico não ligado à epinefrina. • O receptor β-adrenérgico (β-AR) contém um domínio heterotrimérico na porção intracelular constituído de domínios α, β e γ. O domínio-α é uma proteína G porque se liga a nucleotídeos de guanila, sendo, portanto, chamada de proteína Gα. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 36 Bioquímica – Medicina UFGNúcleo Universitário Cristão 36 • Quando a epinefrina não está ligada ao β-AR, a proteína Gα se liga à guanosina difosfato (GDP). Isso mantém o domínio trimérico intacto e acoplado ao domínio 7TM. • No momento da ligação, a epinefrina induz mudanças conformacionais no 7TM, que agora estimula a proteína G a liberar GDP e se ligar a GTP. Isso também faz com que o domínio βγ se dissocie da proteína Gα. • Uma única epinefrina pode fazer com que muitas proteínas Gα troquem o GDP por GTP. Isso cria um efeito amplificado. Figura 4: Efeito da ligação da epinefrina ao receptor β-adrenérgico. • O domínio Gα dissociado e ligado à GTP se move para se liga a outra proteína transmembrana chamada de adenilato ciclase, estimulando-a a começar a transformar ATP em cAMP. As moléculas de cAMP são segundos-mensageiros. Uma vez que muitas são formadas, isso leva a um segundo nível de amplificação de sinal. Figura 5: Efeito da ativação da adenilato ciclase pela proteína Gα. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 37 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 37 • O cAMP então passa a estimular a ativação da proteína quinase A (PKA, molécula efetora). A PKA passa a fosforilar moléculas-alvo, o que ativa muitos diferentes processos. o Ex.: a PKA ativa enzimas que estimulam a degradação de glicogênio, liberando mais glicose para a célula e para o sangue; e estimula a expressão gênica ao ativar fatores de transcrição. Finalização do sinal da epinefrina Figura 6: Estado das proteínas de membrana ao final da transdução de sinal da epinefrina. • Uma vez que a via de transdução de sinal realiza seu objetivo final de produzir uma resposta fisiológica a um estímulo externo, como as células podem desligar esta via? 1. Enquanto o GTP estiver ligado à proteína Gα, ela permanecerá acoplada à adenilato ciclase, que vai continuar produzindo moléculas de cAMP. a. Se a proteína Gα for desacoplada da adenilato ciclase, o GTP deverá ser substituído por GDP. O que acontece é que a proteína Gα possui a capacidade de hidrolisar GTP em GDP. Isso é chamado de atividade GTPase. b. Esta hidrólise geralmente acontece dentro de poucos segundos a poucos minutos após a proteína Gα ser ativada. Isto a concede bastante tempo para realizar sua função. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 38 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 38 Figura 7: Atividade GTPase da proteína Gα após certo tempo estando ativada. 2. Como as células conseguem inativa o complexo epinefrina-receptor e evitar qualquer ativação adicional de proteínas Gα? a. Um método de inativação envolve a dissociação da epinefrina do sítio catalítico do receptor 7TM. Quando a concentração de epinefrina reduz, a epinefrina fica mais susceptível a dissociar. Figura 8: Dissociação da epinefrina do receptor por queda de sua concentração. b. Em um segundo modo de inativação, a quinase de receptor β-adrenérgico fosforila a extremidade carboxila-terminal do complexo epinefrina-receptor na extremidade intracelular. A β-arrestina subsequentemente se liga, e inativa a capacidade do receptor de estimular proteínas Gα. Inativada pela β- arrestina, o receptor é internalizado por endocitose. Na vesícula resultante dessa endocitose, a β-arrestina se dissocia, o receptor é desfosforilado e retorna à superfície celular. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 39 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 39 Figura 9: Efeito da quinase de receptor β-adrenérgico e da β-arrestina na inativação do sinal da epinefrina. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 40 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 40 Via de sinalização de fosfoinositóis • Outra via de transdução de sinal importante que envolve um receptor 7TM é a via de sinalização de fosfoinositóis. Por exemplo, o receptor de angiotensina II em nosso corpo se liga a um primeiro-mensageiro (hormonal) e utiliza esta via. Figura 10: Efeito da ligação do primeiro-mensageiro ao receptor 7TM. • Quando o primeiro-mensageiro se liga ao receptor 7TM, ele induz uma mudança conformacional que faz com que a proteína Gαq libere GDP e se ligue a GTP. Isso dissocia o domínio Gαq do domínio Gβq. A proteína Gαq agora passa a se ligar em uma proteína de membrana chamada de fosfolipase C. Figura 11: Ação da fosfolipase C sobre o PIP2. • A fosfolipase C ativada degrada o fosfatidil-inositol 4,5-bifosfato (PIP2) em uma molécula hidrossolúvel chamada inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), e em uma molécula lipossolúvel chamada de diacilglicerol (DAG). Ambas estas moléculas são segundos-mensageiros. • O IP3 se dissolve pelo citoplasma e se liga a um canal de Ca2+ ligante-dependente na membrana do retículo endoplasmático. Isso permite o movimento do Ca2+ pelo citoplasma. • O Ca2+: Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 41 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 41 o Se liga a à proteína quinase C, e, com a ajuda do DAG (que permanece dissolvido na membrana), a ativa. A PKC então passa a ativar muitos processos celulares. o Combina com uma proteína chamada calmodulina. Este complexo então passa a ativar proteínas quinases. Figura 12: Ação da IP3 sobre os canais de Ca 2+. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 42 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 42 Cálcio e calmodulina • Íons Ca2+ funcionam como segundos-mensageiros em muitas vias de transdução de sinal, incluindo a via de fosfoinositóis. Mas o que faz dos íons Ca2+ mensageiros intracelulares tão prevalentes? 1. Mudanças mínimas da concentração de Ca2+ citoplasmático podem ser detectadas. Figura 13: Disposição dos íons Ca2+ em condições normais nos diferentes meios celulares. a. Durante condições normais, existe uma concentração intracelular de Ca2+ muito baixa (aproximadamente 100nM). b. Isso se deve ao fato de que íons Ca2+ são capazes de rapidamente se ligarem a regiões negativamente carregadas de proteínas, formando complexos insolúveis que podem ser danosos à célula. c. É por isso que a célula bombeia para fora a maioria do Ca2+ e o armazena no retículo endoplasmático até que seja necessário. Os níveis intrinsecamente baixos de Ca2+ citoplasmático permitem à célula detectar até a menor das mudanças. 2. Íons Ca2+ interagem fortemente com proteínas. Guilherme de Matos Abe – Acadêmico de Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 43 Bioquímica – Medicina UFG Núcleo Universitário Cristão 43 a. Por terem uma carga positiva de 2, os íons Ca2+ podem formar interações fortes com cadeias laterais negativamente carregadas das proteínas, bem como com seus átomos de oxigênio nos grupos carbonila. b. Como resultado, quando o Ca2+ se liga a proteínas, ele pode causar mudanças conformacionais na estrutura proteica que pode acabar ligando diferentes domínios. Isso pode estimular a atividade de uma proteína-alvo. Calmodulina Figura 14: Estrutura terciária da calmodulina. • A calmodulina é uma proteína regulatória que é usada para detectar mudanças nas concentrações de Ca2+. Se a concentração citoplasmática de Ca2+ ficar acima de 500nM, a calmodulina começará a se ligar a esse Ca2+. • Uma única calmodulina é capaz de se ligar a 4 íons Ca2+. Ao se ligar, o Ca2+ induz uma mudança
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