Capítulo 4

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Capítulo 4 
 
 
 
 
 
Espectroscopia de Fluorescência Molecular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
 
4.1 - LUMINESCÊNCIA MOLECULAR 
���� Fotoluminescência 
- excitação ⇒ absorção de fótons 
- geralmente a radiação emitida tem comprimento de onda maior do que o da 
radiação absorvida na excitação 
���� Fluorescência 
- tempo médio de vida no estado excitado 10-5 s 
- não há alteração no spin do elétron 
���� Fosforescência 
- tempo médio de vida no estado excitado >10-5 s 
- inversão de spin do elétron 
 
���� Quimiluminescência 
- emissão de radiação por parte de espécies excitadas formadas durante uma reação 
química 
- número de reações químicas que produzem quimiluminescência é pequeno ⇒ 
técnica aplicada a um número pequeno de substâncias 
- método simples, seletivo e com alta sensibilidade 
- aplicação à química analítica é recente 
 
4.1.1 - CARACTERÍSTICAS DAS TÉCNICAS LUMINESCENTES 
- alta sensibilidade 
- limites de detecção ⇒ três ordens de grandeza melhores do que os da absorção 
molecular (nível de ppb) 
- sujeitos a interferências de espécies presentes na matriz 
- faixa linear de concentrações mais amplas 
- menos acurados e precisos que absorção molecular no UV/VIS 
- campo de aplicação menor ⇒ número de espécies que possuem propriedades 
luminescentes é pequeno 
 
 122
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
4.2 - TEORIA DA FLUORESCÊNCIA E DA FOSFORESCÊNCIA 
Molécula no estado fundamental 
- todos os elétrons emparelhados → estado eletrônico singlet 
- não há desdobramento de energia dos níveis eletrônicos em presença de campo 
magnético externo 
Radicais livres 
- presença de elétron desemparelhado → estado eletrônico dublet 
- desdobramento de energia → duas orientações do spin eletrônico em presença de 
campo magnético externo 
Moléculas no estado excitado 
- par eletrônico excitado 
∗ Singlet ⇒ não há inversão de spin eletrônico 
∗ Triplet ⇒ inversão de spin → elétrons excitados → não emparelhados 
 
 
 
 
 
↑↓ 
 
fundamental ⇒ singlet 
 ↓ 
↑ 
 
 
excitado ⇒ singlet 
 
 ↑ 
↑ 
 
 
excitado ⇒ triplet 
 
���� Transição singlet ↔↔↔↔ triplet é menos provável que a singlet ↔↔↔↔ singlet 
↓↓↓↓ 
tempo médio de vida no estado excitado triplet é maior (>10-4 s) do que no singlet (10-5 
a 10-8 s) 
 
4.3 - PROCESSOS DE RELAXAÇÃO 
���� relaxação não radiativa 
���� relaxação radiativa ⇒ fluorescência ou fosforescência 
���� processo predominante ⇒ minimizar o tempo de vida no estado excitado 
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Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.1 – Diagramas de energia para sistema fotoluminescente 
 
 
4.3.1 - RELAXAÇÃO NÃO RADIATIVA 
4.3.1.1 - Relaxação ou desativação vibracional 
- colisões entre moléculas excitadas e moléculas do solvente 
- excesso de energia vibracional → transferido para moléculas do solvente numa 
série de etapas → pequeno aumento da temperatura do meio 
- processo muito rápido → tempo de vida no estado vibracional excitado < 10-12 s 
↓↓↓↓ 
Se ocorrer fluorescência ⇒ transição do nível vibracional de menor energia do nível 
eletrônico excitado para qualquer nível vibracional do nível eletrônico fundamental 
↓↓↓↓ 
Conseqüência ⇒⇒⇒⇒ banda de fluorescência de uma dada transição eletrônica aparece 
a λλλλ maiores do que os da banda de absorção ⇒⇒⇒⇒ deslocamento de Stokes 
 124
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
4.3.1.2 - Conversão interna 
- relaxação do nível vibracional de menor energia de um nível eletrônico excitado para 
um outro nível eletrônico de menor energia sem emitir radiação 
- processo menos eficiente que a desativação vibracional → tempo de vida no nível 
eletrônico excitado → 10-6 a 10-8 s, mas é mais eficiente que fluorescência 
- mecanismo não completamente conhecido e compreendido 
- processo particularmente eficiente quando os dois níveis de energia são 
suficientemente próximos → sobreposição de energia dos níveis vibracionais 
↓↓↓↓ 
Conseqüência ⇒⇒⇒⇒ Absorção ⇒⇒⇒⇒ bandas centradas em λλλλ1, λλλλ2 ⇒⇒⇒⇒ banda de 
fluorescência ⇒⇒⇒⇒ λλλλ3 
 
 
Figura 4.2 – Espectros de absorção e fluorescência de solução de quinina 
 
4.3.1.3 - Conversão externa 
- processo também pouco conhecido 
- interação e transferência de energia entre a molécula excitada e moléculas do 
solvente ou outro soluto 
- evidências do processo ⇒ influência da T, do tipo de solvente e da sua viscosidade 
nas características da fluorescência 
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Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
 
4.3.1.4 - Cruzamento intersistema 
- processo que provoca inversão de spin no estado excitado 
S1 →→→→ T1 (S0 → T1 é transição proibida) 
- processo eficiente quando há sobreposição de energia dos níveis vibracionais de S1 
e T1 
- favorecido pela presença de átomos pesados (iodo, bromo) na molécula 
 
 
4.3.2 - RELAXAÇÃO RADIATIVA 
4.3.2.1 - Fluorescência 
- retorno da molécula de um nível eletrônico excitado do tipo singlet para o nível 
fundamental com emissão de radiação eletromagnética 
- como podem retornar para qualquer nível vibracional do nível eletrônico fundamental 
→ espectro fluorescência molecular → bandas formadas por uma série de 
linhas próximas cuja resolução é difícil 
∗∗∗∗ Linhas de ressonância 
- radiação emitida → mesma energia (mesmo λ) que a radiação absorvida 
∗∗∗∗ Deslocamento de Stokes 
- radiação emitida → menor energia (maior λ) que a radiação absorvida 
- parte da energia da absorção é dissipada por processo de relaxação não 
radiativa (relaxação vibracional) que ocorre a taxa elevada 
- se a conversão interna é pouco importante → espectros de absorção e 
fluorescência → imagens especulares aproximadas e se sobrepõem pela 
linha de fluorescência de ressonância 
 
 
 
 
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Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.3 – Espectro de fluorescência para solução 1 ppm de antraceno em álcool. 
(a) absorção; (b) emissão. 
 
4.3.2.2 - Fosforescência 
- retorno da molécula de um nível eletrônico excitado do tipo triplet para o estado 
fundamental com emissão de radiação eletromagnética 
- transição T1 → S0 ⇒ baixa probabilidade ⇒ tempo médio no estado excitado T1 é 
relativamente grande (>10-4 s) 
- compete, com pouco sucesso, com os processos de conversão interna e externa ⇒ 
no de espécies fosforescentes é muito pequeno 
- fosforescência ⇒ temperaturas baixas, meio viscoso, moléculas adsorvidas em 
sólidos ⇒ características que dificultam os processos de conversão interna e 
externa 
 127
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
4.4 - FLUORESCÊNCIA MOLECULAR 
4.4.1 - EFICIÊNCIA QUÂNTICA OU RENDIMENTO QUÂNTICO (ΦΦΦΦ) 
teoricamente todas as espécies que absorvem radiação UV/VIS deveriam fluorescer 
↓↓↓↓ 
na prática só poucas são fluorescentes 
↓↓↓↓ 
estrutura molecular favorece a relaxação por processos não radiativos que ocorrem a 
taxas maiores do que a fluorescência 
 
•••• Eficiência ou rendimento quântico 
excitadas moléculas de total n
fluorescem que moléculas de n
=Φ
o
o
 ou 
rf
f
k+k
k
=Φ 
sendo: kf = constante da taxa de relaxação por fluorescênciakr = soma das constantes das taxas de relaxação por processos não 
radiativos 
 
4.4.2 - FLUORESCÊNCIA E ESTRUTURA 
���� Principais moléculas fluorescentes: 
- presença de anéis aromáticos 
- outras: compostos carbonílicos 
compostos com duplas ligações conjugadas 
↓↓↓↓ 
Transições pi ↔ pi* ⇒ maior eficiência na fluorescência 
 
ΦΦΦΦ ↑↑↑↑ no de anéis aromáticos ↑↑↑↑ 
grau de condensação dos anéis ↑↑↑↑ 
⇓⇓⇓⇓ 
heterocíclicos simples não fluorescem 
N
 
piridina 
O
 
furano 
S
 
tiofeno 
N
H
 
pirrol 
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Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
exibem fluorescência 
N
 
quinolina 
N
 
isoquinolina 
N
H
 
indol 
 
���� presença de substituintes no anel → deslocamento das bandas de fluorescência e 
influência sobre a eficiência de fluorescência 
 
Tabela 4.1 – Efeito dos grupos substituintes na fluorescência do anel benzênico 
Substância λλλλ (nm) ΦΦΦΦ Substância λλλλ (nm) ΦΦΦΦ 
Benzeno 270-310 10 Fenolato 310-400 10 
Tolueno 270-320 17 Anisol 285-345 20 
Propilbenzeno 270-320 17 Anilina 310-405 20 
Fluorbenzeno 270-320 10 Anilínio - 0 
Clorobenzeno 275-345 7 Ac. Benzóico 310-390 3 
Bromobenzeno 290-380 5 Benzonitrila 280-360 20 
Iodobenzeno - 0 Nitrobenzeno - 0 
Fenol 285-365 18 
 
4.4.2.1 - Efeito da rigidez da estrutura 
- Fluorescência ⇒ favorecida por moléculas com estruturas rígidas 
 
Ex 1) 
 
Φ = 1 
 
Φ = 0,2 
⇓⇓⇓⇓ 
aumento da rigidez da estrutura pela ponte metilênica entre os dois anéis aromáticos 
↓↓↓↓ 
redução na taxa de relaxação não radiativa e a fluorescência acaba ocorrendo a taxa 
maior 
 129
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
Ex 2) Agentes complexantes orgânicos 
 
N
OH
 
 não fluorescente 
Zn
N
O
2
 
fluorescente 
 
Ex. 3) 
Espécies fluorescentes adsorvidas em sólidos ⇒ eficiência de fluorescência 
aumentada 
 
4.4.2.2 - Efeito da temperatura 
T ↑↑↑↑ ΦΦΦΦ ↓↓↓↓ ⇒⇒⇒⇒ aumento da probabilidade de colisões favorecendo aos 
processos de relaxação não radiativa (conversão 
externa) 
 
4.4.2.3 - Efeito do solvente 
Viscosidade ↓↓↓↓ ΦΦΦΦ ↓↓↓↓ ⇒⇒⇒⇒ aumento da probabilidade de colisões 
intermoleculares 
 
Presença de 
átomos 
pesados 
ΦΦΦΦ ↓↓↓↓ ⇒⇒⇒⇒ favorecimento ao cruzamento inter-sistema 
(S1 → T1) favorece à fosforescência 
 
4.4.2.4 - Presença de O2 dissolvido 
- redução na intensidade da fluorescência 
∗ oxidação fotoquimicamente induzida da espécie fluorescente 
- propriedades paramagnéticas do O2 ⇒ promoção do cruzamento intersistema ⇒ 
favorece transição S1 → T1 reduzindo a fluorescência 
 130
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
4.4.2.5 - Efeito do pH na fluorescência 
- anéis aromáticos com substituintes com caráter ácido ou básico ⇒ fluorescência é 
afetada pelo pH do meio 
 
posição da banda 
intensidade da radiação emitida ⇒⇒⇒⇒ diferentes nas formas ionizada e não 
ionizada 
 
Ex : anilina e íon anilínio 
 
N
 
N
_
 
N
_
 
N +
 
estruturas de ressonância da anilina Íon anilínio 
 
 
4.4.3 - EFEITO DA CONCENTRAÇÃO NA INTENSIDADE DA FLUORESCÊNCIA 
F = K’(P0 – P) (1) (K’depende de Φ) 
 
Sendo bc-
0
10
P
P εεεε
==== (2) 
Substituindo-se (2) em (1) 
F = K’P0 (1 – 10-εεεεbc) (3) 
Pela expansão do termo potencial em série de Maclaurin 
(((( )))) (((( )))) (((( )))) ......... -
! 3
bc 2,3-
 -
! 2
bc 2,3-
 -bc 2,3- P 'KF
32
0
εεεεεεεε
εεεε==== 
Quando εεεεbc = A < 0,05 
F = 2,3 K’ εεεεbc P0 
 131
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
Sendo P0 = constante 
 
F = K c 
 
Representação gráfica 
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0
2
4
6
8
10
12
14
16
 
 
In
te
n
si
da
de
Concentração
 
 
- baixas concentrações → dependência linear 
- concentrações elevadas → A > 0,05 → perda de linearidade 
 
aumento das colisões entre moléculas 
excitadas 
↓↓↓↓ 
favorecimento dos processos de relaxação 
não radiativa (conversão externa ou interna) 
↓↓↓↓ 
auto supressão 
próprias moléculas absorvem a radiação 
emitida por fluorescência 
↓↓↓↓ 
redução na intensidade da radiação emitida 
por fluorescência 
↓↓↓↓ 
auto absorção 
 
 
 132
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
4.4.4 - INSTRUMENTOS PARA MEDIDA DE FLUORESCÊNCIA 
���� Componentes 
- os mesmos da espectrometria de absorção molecular no UV/VIS 
 
���� Fluorômetros → filtros para seleção dos λ 
 
���� Espectrofluorômetros 
- filtro ou monocromador ⇒ limitar a radiação de excitação 
- redes de difração ⇒ dispersar a radiação de fluorescência 
↓↓↓↓ 
obtenção dos espectros de fluorescência 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.4 - Componentes de um fluorômetro ou de um espectrofluorômetro 
 
 
���� Características 
� Feixe duplo → compensar flutuações em P0 
 133
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
� Feixe de amostra 
• filtro ou monocromador primário → transmitir a radiação que vai excitar a amostra 
e limitar os λ correspondentes à fluorescência 
• radiação de fluorescência emitida pela amostra em todas as direções → medida 
num ângulo de 90o com o feixe incidente → reduzir ou eliminar o efeito do 
espalhamento da radiação na solução e nas paredes da célula 
• filtro ou monocromador de emissão 
- dispersar a radiação de fluorescência 
- selecionar a banda de fluorescência de interesse 
 
� Feixe de referência 
• Atenuador → reduzir a intensidade a um nível similar ao da radiação fluorescente 
 
� Comercialmente vários modelos 
grau de sofisticação ↑ preço ↑ 
 
� Fluorômetros 
• mais adequados para análises quantitativas → maior sensibilidade 
• simples e de fácil utilização 
• custo baixo 
 
���� Componentes 
� Fontes 
• maior intensidade que as da espectrometria de absorção no UV/VIS 
• Fluorômetros 
- Lâmpada de vapor de Hg ⇒ linhas de excitação ⇒ 254 – 302 – 313 – 546 – 578 – 
691 e 773 nm → isoladas pelos filtros de absorção 
- Compostos fluorescentes → fluorescência é induzida por diferentes λ e pelo 
menos um destes será adequado 
 134
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
• Espectrofluorômetros 
- Lâmpada de arco de Xe → espectro contínuo de 300 a 1300 nm 
 
� Filtros e monocromadores 
• idênticos aos dos instrumentos para medida da absorção no UV/VIS 
 
� Células e Compartimentos para amostras 
• Células cilíndricas ou retangulares 
vidro ou sílica fundida 
• Compartimento de célula 
- design adequado de modo a reduzir a incidência d radiação espalhada 
 
� Detetores 
• Sinal de luminescência baixa intensidade detetor altamente sensível 
- Tubos fotomultiplicadores (operação sob resfriamento) 
- Rede de diodos 
 
���� Instrumentos típicos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.5 – Representação esquemática de um fluorômetro. 
 135
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4.6 – Reperesentação esquemática de um espectrofluorômetro. 
 
 
���� Padronização dos instrumentos 
• Fluorômetros / espectrofluorômetros ⇒ potência da fonte e sensibilidade do detetor 
→ podem variar de um dia para outro 
↓↓↓↓ 
padronização dos instrumentos de modo a obter-se um nível de sensibilidade 
reprodutível 
 
 
Solução padrão de sulfato de quinina 10-5 
mol/L(excitada a 350 nm → fluoresce a 450 nm) 
Perkin Elmer 
↓↓↓↓ 
kit com 6 padrões 
 
 
 
 136
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
 
4.4.5 - APLICAÇÕES DA FLUORESCÊNCIA MOLECULAR 
���� Espécies inorgânicas 
���� cátion ou ânion → extraído para solução orgânica imiscível com agente quelante 
→ fluorescência da solução orgânica é medida 
 
���� Métodos diretos 
- analito + agente quelante → complexo com propriedades fluorescentes 
- determinação de cátions 
 
���� Métodos indiretos 
- redução na emissão de fluorescência de um dado reagente em função da sua 
reação com o analito 
- determinação de ânions 
 
���� Estruturas dos agentes quelantes mais comuns 
 
N
OH
 
8-hidróxi-quinolina 
HO N N
OH HO
SO3Na
 
alizarina garnet R 
 
O
O
OH
 
flavanol 
 
C C
H
OHO
 
benzoína 
 
 
 
 
 
 137
Capítulo 4 – Espectroscopia de fluorescência molecular 
 
Tabela 4.2 – Métodos fluorométricos selecionados para espécies inorgânicas 
Íon Reagente λλλλ (nm) S (µµµµg/mL) Interferentes 
Abs F 
Al3+ alizarina garnet R 470 500 0,007 
Be, Co, Cr, Cu, F-, 
NO3-, Ni, PO43-, Th, Zr 
F- 
auto-supressão do 
complexo acima 470 500 0,001 
Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, 
PO43-, Th, Zr 
B4O7- benzoína 370 450 0,04 Be, Sb 
Cd2+ 2-(o-hidróxifenil-benzoxazola) 365 azul 2 NH3 
Li+ 8-hidróxiquinolina 370 580 0,2 Mg 
Sn4+ flavanol 400 470 0,1 F-, PO43-, Zr 
Zn2+ benzoína - verde 10 
B, Be, Sb e íons 
corados 
 
OBS: 
• Íons de metal de transição 
- formação de complexos que absorvem no UV/VIS → relaxação não radiativa é tão 
rápida (eficiente) ⇒ não fluorescem 
- muitos são paramagnéticos → favorece os cruzamentos intersistemas para estado 
excitado triplet ⇒ fluorescência pouco provável (aumenta a tendência a 
fosforescência) 
• Íons de metais não de transição → não formam complexos que absorvam radiação na 
região UV/VIS, mas seus complexos com quelantes org6anicos adequados ⇒ 
fluorescentes 
⇓⇓⇓⇓ 
FLUORESCÊNCIA MOLECULAR + ABSORÇÃO MOLECULAR NO UV/VIS 
⇓⇓⇓⇓ 
complementares para determinação de cátions 
 
���� Substâncias orgânicas/ bioquímicas 
• Fluorescência ⇒ campo de aplicação amplo 
- seletividade e sensibilidade elevadas 
Ex: hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, adenina, guanidina, indol, naftol, 
proteínas, aminoácidos, produtos alimentares e farmacêuticos, produtos naturais.