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Brasília-DF. Micro-organisMos na Área dos aliMentos Elaboração Bruna Pippi Produção Equipe Técnica de Avaliação, Revisão Linguística e Editoração Sumário APRESENTAÇÃO ................................................................................................................................. 4 ORGANIZAÇÃO DO CADERNO DE ESTUDOS E PESQUISA .................................................................... 5 INTRODUÇÃO.................................................................................................................................... 7 UNIDADE I INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS ............................................................................... 9 CAPÍTULO 1 IMPORTÂNCIA DOS MICRO-ORGANISMOS NOS ALIMENTOS ..................................................... 9 CAPÍTULO 2 FATORES INTRÍNSECOS E EXTRÍNSECOS DOS ALIMENTOS QUE INTERFEREM NO CRESCIMENTO MICROBIANO ........................................................................................................................ 15 UNIDADE II MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS ................................................................................... 25 CAPÍTULO 1 EFEITOS BENÉFICOS DOS MICRO-ORGANISMOS ..................................................................... 25 CAPÍTULO 2 DETERIORAÇÃO MICROBIANA DE ALIMENTOS ......................................................................... 33 CAPÍTULO 3 DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR ......................................................................................... 41 UNIDADE III CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS ............................................................. 60 CAPÍTULO 1 CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO MICROBIANO NOS ALIMENTOS ........................................ 60 CAPÍTULO 2 MICRO-ORGANISMOS INDICADORES E ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS EM ALIMENTOS ............ 69 CAPÍTULO 3 SISTEMA APPCC E A SEGURANÇA DOS ALIMENTOS ................................................................. 80 REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 88 4 Apresentação Caro aluno A proposta editorial deste Caderno de Estudos e Pesquisa reúne elementos que se entendem necessários para o desenvolvimento do estudo com segurança e qualidade. Caracteriza-se pela atualidade, dinâmica e pertinência de seu conteúdo, bem como pela interatividade e modernidade de sua estrutura formal, adequadas à metodologia da Educação a Distância – EaD. Pretende-se, com este material, levá-lo à reflexão e à compreensão da pluralidade dos conhecimentos a serem oferecidos, possibilitando-lhe ampliar conceitos específicos da área e atuar de forma competente e conscienciosa, como convém ao profissional que busca a formação continuada para vencer os desafios que a evolução científico-tecnológica impõe ao mundo contemporâneo. Elaborou-se a presente publicação com a intenção de torná-la subsídio valioso, de modo a facilitar sua caminhada na trajetória a ser percorrida tanto na vida pessoal quanto na profissional. Utilize-a como instrumento para seu sucesso na carreira. Conselho Editorial 5 Organização do Caderno de Estudos e Pesquisa Para facilitar seu estudo, os conteúdos são organizados em unidades, subdivididas em capítulos, de forma didática, objetiva e coerente. Eles serão abordados por meio de textos básicos, com questões para reflexão, entre outros recursos editoriais que visam a tornar sua leitura mais agradável. Ao final, serão indicadas, também, fontes de consulta, para aprofundar os estudos com leituras e pesquisas complementares. A seguir, uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos Cadernos de Estudos e Pesquisa. Provocação Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto antes mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para o autor conteudista. Para refletir Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma pausa e reflita sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em seu raciocínio. É importante que ele verifique seus conhecimentos, suas experiências e seus sentimentos. As reflexões são o ponto de partida para a construção de suas conclusões. Sugestão de estudo complementar Sugestões de leituras adicionais, filmes e sites para aprofundamento do estudo, discussões em fóruns ou encontros presenciais quando for o caso. Atenção Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam para a síntese/conclusão do assunto abordado. 6 Saiba mais Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/conclusões sobre o assunto abordado. Sintetizando Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando o entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos. Para (não) finalizar Texto integrador, ao final do módulo, que motiva o aluno a continuar a aprendizagem ou estimula ponderações complementares sobre o módulo estudado. 7 Introdução O Caderno de Estudos e Pesquisa “Microbiologia dos Alimentos” foi elaborado com a perspectiva de fornecer conhecimento sobre a importância e aplicações dos micro-organismos na área de alimentos e demonstrar como os micro-organismos podem influenciar nas características dos produtos alimentícios de consumo humano. Esta é uma área bastante abrangente que envolve as alterações nos alimentos provocadas pelos micro-organismos, as quais levam a deterioração do produto, bem como o estudo de doenças bacterianas, fúngicas e virais e ocasionadas por alimentos contaminados; e também o estudo de vantagens que certos micro-organismos podem oferecer na indústria alimentícia e na saúde do consumidor. No decorrer desta disciplina, o foco do nosso trabalho será entender que a qualidade microbiológica dos alimentos está condicionada à quantidade e aos tipos de micro-organismos presentes e que a multiplicação desses organismos pode ser controlada no intuito de obter alimentos mais seguros. O aluno, ainda, será levado a refletir sobre fatores relacionados com as características próprias do alimento e fatores relacionados com o ambiente em que o alimento se encontra e como estes têm influência no desenvolvimento dos micro-organismos. Por fim, iremos destacar aspectos sobre o sistema Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) de gestão de segurança de alimentos, para que os alunos tenham informações sobre a importância deste sistema e de como fortes conhecimentos em microbiologia dos alimentos são essenciais para sua implementação. Uma vez que atividades microbianas podem ter consequências desejáveis ou indesejáveis, o estudo na microbiologia de alimentos tem sido bastante necessário em indústrias de alimentos, laboratórios de biotecnologia, estabelecimentos de alimentação e órgãos fiscalizadores. Não há qualquer campo do saber humano, seja na indústria, na agricultura, no preparo de alimentos, em conexão com problemas de habitação ou de vestuário, na preservação da saúde humana ou de animais e no combate às doenças, em que o micro-organismo não desempenhe um papel importante e, às vezes, dominante. (SELMAN, 1942), 8 Objetivos » Conhecer os grupos de micro-organismos que desempenham diferentes papéis na área de alimentos. » Compreender o que são fatores intrínsecos e extrínsecos e entender como esses influenciam no crescimento microbiano e como podem ser úteis na conservação de alimentos. » Estudar os micro-organismos importantes na produção de alimentos e entender a diferença entre probióticos, prebióticos e simbióticos. » Estudar os contaminantes de carnes, frangos, pescados, leites ederivados, ovos e produtos de origem vegetal. » Estudar os principais micro-organismos causadores de infecções e intoxicações alimentares. » Entender os métodos de controle da multiplicação dos micro-organismos no alimento, visando diminuir a deterioração e eliminar os riscos para a saúde do consumidor. » Conhecer os micro-organismos indicadores de contaminação fecal e de condições inadequadas de manipulação de alimentos. » Conhecer o sistema APPCC e como é feito a sua implementação em uma indústria de alimentos. 9 UNIDADE I INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS Para dar início a essa disciplina, a Unidade I irá abordar brevemente como surgiu o estudo da microbiologia dos alimentos e quais os principais grupos de micro-organismos que serão estudados ao longo da disciplina. Também estudaremos aqui os fatores que influenciam na capacidade de sobrevivência e multiplicação dos micro-organismos. CAPÍTULO 1 Importância dos micro-organismos nos alimentos Aspectos históricos É extremamente difícil determinar quando foi o início preciso em que a humanidade se conscientizou da existência e do papel dos micro-organismos nos alimentos. Há 1 milhão de anos até 8 mil anos atrás, os homens eram carnívoros e os alimentos vegetais foram introduzidos em sua dieta no final desse período. Após essa fase, em que a alimentação era baseada em recursos naturais, o homem passou a produzir seu próprio alimento. Pressupõe-se que com o surgimento dos alimentos preparados, aliado à inadequada conservação, iniciaram-se os problemas relacionados à deterioração, bem como ocorrências relacionadas com doenças transmitidas pelos alimentos. Há relatos que em 7000 a.C. já se fabricava cerveja na antiga Babilônia e em 3500 a.C. já se tinha conhecimento sobre a produção de vinhos. Os sumérios, em 3000 a.C., foram os primeiros a fabricar manteiga. Além disso, leite, manteiga e queijo também eram utilizados pelos egípcios em 3000 a.C., mesma época em que o sal era utilizado para conservação de alimentos por judeus, chineses e gregos. Em 1000 a.C., carnes e frutos do mar eram conservados em neve pelos romanos e técnicas de defumação de carnes também já estavam sendo aprimoradas nesta época. Entretanto, pouco se 10 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS sabe se as pessoas compreendiam a natureza das técnicas de conservação e se tinham conhecimento sobre o papel dos alimentos na transmissão de doenças. A evolução sobre esses conhecimentos era bastante lenta. Na Idade Média, milhares de pessoas morreram de uma intoxicação conhecida como ergotismo, contudo não se sabia que era uma doença causada por uma toxina produzida pelo fungo Claviceps purpurea, o qual estava presente em cereais. O reconhecimento da importância da higiene na produção de alimentos foi um processo demorado. No século XIII foram publicadas as primeiras normas relacionadas à inspeção de carnes e abatedouros, porém acredita-se que ainda era desconhecida a relação entre a qualidade deste alimento e os micro-organismos. Provavelmente, Kircher, em 1658, foi a primeira pessoa a sugerir uma ligação dos micro-organismos na deterioração de carnes e leite, após identificar “vermes” invisíveis a olho nu. Em 1765, Spallanzani provou que a fervura do caldo de carne seguido de armazenamento em recipiente selado garantia que o produto não se deteriorasse, o que derrubou a teoria da geração espontânea. Em 1809, Appert conservou carnes em recipientes de vidro com água fervente por distintos períodos de tempo, conseguindo a patente desta técnica, em 1810, e dando início ao processo de enlatamento de alimentos. Apesar das descobertas anteriores terem relevante significância, de fato, foi Pasteur o primeiro cientista a entender o papel dos micro-organismos nos alimentos. Em 1837, esse pesquisador conseguiu comprovar que o azedamento do leite era provocado por micro-organismos e, em 1860, com o uso do calor conseguiu destruir micro-organismos indesejados nos alimentos, dando origem ao processo conhecido como pasteurização. Papel dos micro-organismos nos alimentos Os micro-organismos desempenham diversos papéis nos alimentos e podem ser classificados em três grupos distintos de acordo com a interação existente com o alimento: » Micro-organismos benéficos. » Micro-organismos deterioradores. » Micro-organismos patogênicos. Micro-organismos benéficos São aqueles que modificam beneficamente as características originais do alimento com o intuito de transformá-lo em um novo alimento. 11 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS │ UNIDADE I » São naturalmente presentes nos alimentos ou intencionalmente adicionados aos alimentos e conduzem à realização de determinadas reações químicas. » Neste grupo estão todos os micro-organismos utilizados na fabricação de alimentos fermentados, como queijos, vinhos, cervejas e pães. Micro-organismos deteriorantes São aqueles que causam alterações químicas prejudiciais levando à deterioração do alimento. » A deterioração resulta em alteração da cor, odor, sabor, textura e aspecto do alimento. » As alterações são consequência da atividade metabólica natural dos micro-organismos que utilizam o alimento como fonte de nutrientes e energia. Micro-organismos patogênicos São aqueles que causam risco e prejuízo à saúde humana ou animal. » A presença de micro-organismos patogênicos no alimento está associada a condições precárias de higiene, bem como armazenamento, distribuição e manipulação inadequados. » Além disso, as características das doenças dependem de fatores relacionados ao alimento, ao micro-organismo patogênico e também a fatores do indivíduo afetado. Fontes de contaminação dos alimentos Durante toda a cadeia alimentar, do produtor ao consumidor, os micro-organismos contaminantes podem infectar os alimentos e consequentemente danificar o produto ou causar danos à saúde humana. As principais fontes que contaminam os alimentos são: » Água: é indispensável na área alimentar, uma vez que a sua utilização é necessária desde a produção até ao consumo dos alimentos, tornando-se nesse sentido uma potencial fonte de contaminação. Os maiores riscos 12 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS associados são a contaminação com excrementos de animais. Isto torna fundamental o tratamento e manutenção da água. » Solo: possui matéria orgânica em diferentes estados de decomposição, além de raízes de plantas, água e outros componentes. É um habitat ideal para inúmeros micro-organismos e, juntamente com a água, é uma forte fonte de contaminação de frutos e legumes. » Ar e poeira: representam uma fonte de contaminação bastante prejudicial em alguns locais, como balcões de exposição e durante o armazenamento. Bactérias gram-positivas e os fungos são os mais encontrados. » Utensílios: superfícies de corte, bancadas de preparação de alimentos, “tábuas”, facas e outros utensílios quando mal higienizados, podem ser potenciais fontes de contaminação. » Manipuladores de alimentos: a vestimenta externa do manipulador, a microbiota das mãos, cavidade nasal e bucal, e a pele em geral podem ser fontes de contaminação dos alimentos quando há práticas higiênicas precárias. » Trato gastrintestinal: a biota de animais e do homem é transferida para os alimentos quando se utiliza água poluída para lavar alimentos crus. Micro-organismos importantes são provenientes desta fonte de contaminação, como Salmonella. » Pele de animais: importante fonte de contaminação, principalmente no leite. Os micro-organismos que contaminam o leite podem ser os mesmos do úbere e da pele das vacas, quando a ordenha não é realizada com higiene adequada. Micro-organismos de interesse em microbiologia dos alimentos No quadro 1, sãodemonstrados os principais micro-organismos em relação à deterioração e produção de alimentos. Os micro-organismos responsáveis pelas doenças transmitidas por alimentos serão estudados na próxima unidade. Os principais grupos de micro-organismos estudados serão bactérias, fungos (bolores e leveduras) e vírus. 13 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS │ UNIDADE I » Bactérias: são organismos procariontes, unicelulares e apresentam grande diversidade morfológica. As bactérias com interesse na área de alimentos podem ser gram-positivas ou gram-negativas, cocos ou bacilos, e produzem ou não esporos. » Bolores: é formada por filamentos denominados hifas. O conjunto de hifas é denominado micélio. O micélio promove a fixação do bolor ao substrato e também é responsável pela reprodução por meio da produção de esporos. As colônias podem ter aspecto cotonoso, ser secas, úmidas, aveludadas, com diversas colorações. » Leveduras: é um fungo com forma predominantemente unicelular. Podem ser esféricas, ovoides, cilíndricas ou triangulares. Algumas podem ser alongadas, formando segmentos semelhantes às hifas. » Vírus: são parasitas intracelulares obrigatórios, portanto, para seu desenvolvimento é necessário que estejam hospedados em uma célula viva. Nos alimentos estão na sua forma inativa. Quadro 1. Principais micro-organismos deteriorantes e úteis na produção alimentos. Grupo Micro-organismo Alimento associado Bactérias Gram-positivas Streptococcus Utilização em produtos lácteos fermentados e vegetais fermentados, indicador de contaminação fecal. Leuconostoc Utilização de produtos lácteos fermentados e vegetais fermentados. Pediococcus Utilização de produtos lácteos fermentados e vegetais fermentados. Lactobacillus Produção de leites fermentados, queijos, vegetais fermentados e também deterioração de alimentos e bebidas. Micrococcus Deterioração de produtos lácteos e carnes processadas. Bactérias Gram-negativas Aeromonas Deterioração de carnes, pescados e ovos. Halobacterium Deterioração do charque. Alcalígenes Deterioração do leite, carne e aves. Acinetobacter Deterioração de carnes e aves. Moraxella Deterioração de carnes e pescado. Escherichia Indicador de contaminação fecal. Citrobacter Indicador de contaminação fecal. Enterobacter Indicador de contaminação fecal. Klebsiella Indicador de contaminação fecal. Proteus Deterioração de ovos, leite, carnes, pescados e aves. Serratia Deterioração de vegetais e carnes refrigeradas. Erwinia Deterioração de frutas e hortaliças. Pseudomonas Deterioração de pescado, carnes, aves e leites. Acetobacter Produção de vinagre e também deterioração de vinho, cerveja e frutas. Flavobacterium Deterioração de vegetais, pescados e carnes. 14 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS Grupo Micro-organismo Alimento associado Bolores Alternaria Deterioração de tomates, pimentões, maça e frutas cítricas. Aspergillus Produção de shoyu (molho de soja) e deterioração de frutas, legumes e queijos. Aureobasidium Deterioração de carnes, frutas e hortaliças. Botrytis Podridão de maçãs, peras, morangos e frutas cítricas. Cladosporium Deterioração de frutas e hortaliças. Fusarium Deterioração de frutas e hortaliças. Mucor Produção de queijo, deterioração de frutas e vegetais. Penicillium Produção de queijo, deterioração de pães e bolos. Leveduras Candida Deterioração de frutas, vegetais, derivados lácteos, bebidas alcoólicas e refrigerante. Rhodotorula Deterioração de carnes, bebidas lácteas, produtos fermentados e bebidas não alcoólicas. Saccharomyces Produção de pães e bebidas e deterioração de frutas, maionese, mel. Pichia Deterioração de cervejas, vinhos, bebidas lácteas e frutas. Zygosaccharomyces Deterioração de maionese, molhos de saladas, frutas e refrigerante. Torulospora Deterioração de frutas, refrigerante, cervejas, pães e queijo. Fonte: Melo; Landgraf (2008). 15 CAPÍTULO 2 Fatores intrínsecos e extrínsecos dos alimentos que interferem no crescimento microbiano A capacidade de sobrevivência e a multiplicação dos micro-organismos dependem de fatores relacionados com as características próprias do alimento (fatores intrínsecos) e de fatores relacionados com o ambiente em que o alimento se encontra (fatores extrínsecos), os quais estão esquematizados na figura 1. O conhecimento destes fatores é essencial para o entendimento dos princípios básicos que conduzem a alteração e conservação dos alimentos. Figura 1. Fatores intrínsecos e extrínsecos dos alimentos. Fonte adaptado de: <http://docplayer.com.br/12238128-Fatores-intrinsecos-e-extrinsecos-que-interferem-no-crescimento- microbiano-em-alimentos.html>. Acesso em: 20/3/2016. Fatores intrínsecos Entre os fatores intrínsecos encontram-se: » Atividade de água (Aa). » Acidez (pH). » Potencial de oxirredução (Eh). 16 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS » Nutrientes. » Constituintes antimicrobianos. » Estruturas biológicas. » Interação entre micro-organismos. Cada um desses fatores será discutido a seguir, relacionando seus efeitos sobre os micro-organismos presentes nos alimentos. Atividade de água (Aa) Os micro-organismos necessitam de água para sobreviver. Eles exigem a presença de água na forma disponível para seu metabolismo e multiplicação, pois a água que está ligada a macromoléculas por forças físicas não está livre para reações químicas e, portanto, não pode ser aproveitada pelos micro-organismos. “Atividade de água” é um parâmetro que indica esta disponibilidade de água em um alimento. Atividade de água de um alimento é definida como a relação entre a pressão parcial de vapor da água contida no alimento (P) e a pressão de vapor da água pura (P0). Ou seja: Aa = P/ P0 Os valores de Aa variam de 0 a 1 e a água pura possui Aa igual a 1. A adição de algumas substâncias, como sais e açúcar, reduz o valor de Aa de um alimento por reduzir o valor de P. A remoção de água (desidratação) e o congelamento também levam a essa redução. Os valores de Aa de alguns alimentos estão relacionados no quadro 2. Os micro-organismos possuem valor máximo, mínimo e ótimo de Aa para sua multiplicação, sendo que o limite máximo para o crescimento microbiano é um pouco menor do que 1. Os valores de Aa mínimos para o crescimento de alguns micro-organismos são apresentados no quadro 3. Pode-se observar que, em geral, as bactérias necessitam de maiores valores de Aa para se multiplicarem. Tabela 2. Valores aproximados de Aa de alguns alimentos. Valores de Aa Alimentos > 0,98 Carne e pescado frescos; leite; frutas e hortaliças frescas; hortaliças enlatadas em salmoura; frutas enlatadas em pouca concentração de açúcar. 0,93 - 0,97 Queijo processado; pasta de tomate; pão; carnes curadas enlatadas; embutidos; frutas enlatadas em alta concentração de açúcar. 0,85 – 0,92 Leite condensado, queijo cheddar maturado; linguiça fermentada; carne seca; presunto cru; bacon. 0,60 – 0,84 Farinha; cereais; nozes; frutas secas; vegetais secos; leite em pó; geleias; peixe fortemente salgado; alguns queijos maturados. < 0,60 Chocolate, vegetais fermentados, mel, macarrão seco, biscoitos e batata chips. Fonte: Jay (2005). 17 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS │ UNIDADE I Quadro 3. Valores mínimos de Aa para multiplicação de alguns micro-organismos importantes na área de alimentos. Micro-organismos Aa Grupos Bactérias deteriorantes 0,90 Leveduras deteriorantes 0,88 Bolores deteriorantes 0,80 Bactérias halofílicas 0,75 Bolores xerofílicos 0,65 Leveduras osmofílicas 0,61 Micro-organismos específicos Clostridium botulinum tipo E 0,97 Pseudomonas spp. 0,97 Acinetobacter spp. 0,96 Escherichia coli 0,96 Enterobacter aerogenes 0,95 Bacillussubtilis 0,95 Clostridium botulinum tipos A e B 0,94 Candida utilis 0,94 Vibrio parahaemolyticus 0,94 Botrytis cinérea 0,93 Rhizopus stolonifer 0,93 Mucor spinosus 0,93 Candida scottii 0,92 Trichosporon pullulans 0,91 Candida zeylanoides 0,90 Staphylococcus aureus 0,86 Alternaria citri 0,84 Penicillium patulum 0,81 Zygosaccharomyces rouxii 0,62 Xeromyces bisporus 0,61 Aspergillus echinulatus 0,64 Fonte: Jay (2005). Existem algumas relações entre temperatura, atividade de água e disponibilidade de nutrientes. A qualquer temperatura, o micro-organismo diminui sua capacidade de crescimento com a redução de Aa. O intervalo de Aa no qual o micro-organismo se multiplica é maior em sua temperatura ótima de crescimento, assim como a presença de nutrientes também amplia a faixa de Aa em que o crescimento é possível. Micro-organismos halofílicos: são aqueles incapazes de se desenvolver em meios sem cloreto de sódio e frequentemente exigem altos teores dessa substância para seu desenvolvimento. Geralmente são bactérias. Micro-organismos xerofílicos: são aqueles que se desenvolvem mais rapidamente sob condições relativamente secas. Geralmente, são bolores e leveduras. 18 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS Micro-organismos osmofílicos: são aqueles capazes de se desenvolver em ambientes de alta pressão osmótica. O termo é mais comumente utilizado para leveduras tolerantes ao açúcar. Acidez (pH) Os micro-organismos possuem valores de pH mínimo, ótimo e máximo para sua multiplicação. A maioria deles cresce melhor em valores de pH em torno da neutralidade (6,5-7,5), sendo que alguns micro-organismos conseguem se multiplicar em pH abaixo de 4,0 (figura 2). As bactérias tendem a ser mais exigentes em termos de pH comparadas aos fungos filamentosos e leveduras, sendo as bactérias patogênicas as mais exigentes. Sobre o pH mínimo e máximo de crescimento dos micro-organismos, os limites representados na figura 2 não são precisos, visto que esses valores são dependentes de outros parâmetros de crescimento que agem simultaneamente. Figura 2. Faixa de pH aproximada de crescimento de alguns micro-organismos encontrados nos alimentos. Fonte: <https://encrypted-bn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTrXhxAm0G_WS8W4XxWzMFGU7xkyz4cx6zn8-ZVJa- eHPf3hvqk>. Acesso em: 22/3/2016. Em relação ao pH, os alimentos podem ser subdivididos em três grupos: » Alimentos de baixa acidez (pH > 4,5): são os alimentos mais sujeitos à multiplicação microbiana, tanto de espécies patogênicas quanto de deteriorantes. 19 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS │ UNIDADE I » Alimentos ácidos (pH entre 4,0 e 4,5): nesses alimentos há predominância de crescimento de leveduras, de bolores e de algumas espécies bacterianas. » Alimentos muito ácidos (pH < 4): nesses alimentos o crescimento microbiano é restrito a bolores e leveduras. Frutas, refrigerantes, vinhos e viangres apresentam pH inferior à proliferação bacteriana, portanto, esses alimentos geralmente se deteriorizam pela ação de bolores e leveduras. Já a maioria das carnes e frutos do mar possui pH em torno de 5,6 ou mais elevado, assim, acabam sendo bastante suscetíveis a bactérias, bolores e leveduras. O quadro 4 apresenta os valores de pH de alguns alimentos. Quadro 4. pH aproximado de alguns alimentos. Grupos Alimentos pH Vegetais Abóbora 5,0 - 5,4 Alface 6,0 Azeitona 3,6 – 3,8 Batata 5,3 – 5,6 Brócolis 6,5 Cebola 5,3 – 5,8 Cenoura 4,9 – 6,0 Feijão 4,6 – 6,5 Milho 7,3 Repolho 5,4 – 6,0 Tomate 4,2 – 4,3 Frutas Ameixa 2,8 – 4,6 Banana 4,5 - 4,7 Lima 1,8 – 2,0 Maçã 2,0 – 3,3 Melancia 5,2 – 5,6 Uva 3,4 – 4,5 Carnes Bovina 5,1 – 6,2 Frango 6,2 – 6,4 Presunto 5,9 – 6,1 Pescado Atum 5,2 – 6,1 Camarão 6,8 – 7,0 Peixe fresco (maioria) 6,6 – 6,8 Laticínios Creme de leite 6,5 Leite 6,3 – 6,5 Manteiga 6,1 – 6,4 Queijo 4,9 – 5,9 Fonte: Franco; Landgraf (2008). 20 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS Potencial de oxirredução (Eh) O potencial de oxirredução(Eh), de modo geral, é a facilidade com que determinado substrato ganha (redução) ou perde (oxidação) elétrons. A oxidação também pode ocorrer pela adição de oxigênio. Um substrato que doa elétrons é chamado de agente redutor e aquele que recebe é chamado de agente oxidante. Quando ocorre transferência de elétrons de um composto para outro, é criada uma diferença de potencial entre eles. Essa diferença pode ser medida com instrumentos apropriados e é expressa em milivolts (mV). Quanto mais oxidado é um composto, mais positivo é seu Eh; e quanto mais reduzido é um composto, mas negativo é esse potencial. Para sua multiplicação, alguns micro-organismos necessitam de Eh negativo (inferior a -150 mV), ou seja, condições redutoras para iniciar o crescimento. Isso acontece com as bactérias anaeróbicas, sendo o gênero Clostridium um exemplo desta categoria. Já os micro-organismos aeróbios requerem Eh positivo (entre +350 e +500 mV), como a maioria dos bolores, leveduras oxidativas e muitas bactérias, entre elas alguns membros do gênero Bacillus. Existem também as bactérias microaerófilas, as quais são bactérias aeróbias que se multiplicam melhor em condições ligeiramente reduzidas, como é o caso dos lactobacilos e estreptococos. Há, ainda, os micro-organismos que se multiplicam bem em condições aeróbicas e anaeróbicas, os quais são denominados anaeróbios facultativos, como as bactérias da família Enterobacteriaceae. A maior parte dos mofos e leveduras encontrados em alimentos é aeróbica e alguns são anaeróbicos facultativos. Determinar o valor de Eh de um alimento é muito difícil, devido às interações da tensão de oxigênio que envolve o alimento com compostos químicos que agem sobre o valor de Eh. De maneira geral, alimentos de origem vegetal apresentam Eh entre +300 e +400 mV, explicando porque bactérias aeróbicas e bolores são as causas mais comuns de deterioração desses produtos. Carnes em pedaços possuem valores de Eh em torno de -200mV, enquanto que nas carnes moídas esse valor pode subir para +200mV. Os queijos variam o Eh entre -20 até -200mV. Nutrientes Para que os micro-organismos se multipliquem, é necessário que alguns nutrientes estejam disponíveis nos alimentos: » Água – como já discutimos anteriormente, os micro-organismos exigem a presença de água na forma disponível para seu metabolismo e multiplicação. 21 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS │ UNIDADE I » Fonte de energia – os micro-organismos utilizam açúcares, álcoois e aminoácidos como fonte de energia. Alguns micro-organismos são capazes de utilizar carboidratos complexos (amido e celulose) como fonte de energia, degradando-os em açúcares menores. Uma minoria de micro-organismos utiliza lipídios como fonte de energia. » Fonte de nitrogênio – os aminoácidos são as principais fontes de nitrogênio, mas outros compostos nitrogenados também podem ser utilizados. Em geral, os aminoácidos são usados por praticamente todos os micro-organismos antes da utilização de fontes de nitrogênio mais complexas, como proteínas de alto peso molecular. » Vitaminas – as vitaminas mais importantes são as do complexo B, a biotina e o ácido pantotênico. Essas vitaminas fazem parte de diversas coenzimas envolvidas em reações metabólicas e por isso são importantes fatores de crescimento. » Sais minerais – apesar da necessidade de doses muito pequenas, os minerais são essenciais para a multiplicação microbiana, pois estão envolvidos em muitas reações enzimáticas. Entre os minerais mais importantes estão: sódio, potássio, cálcio, magnésio, ferro, cobre, zinco, entre outros. Constituintes antimicrobianos Os alimentos apresentam algumas substânciasnaturais com propriedades antimicrobianas. Estas substâncias dão certa estabilidade aos alimentos frente ao ataque de micro-organismos. A seguir, são citados alguns exemplos de alimentos e seus antimicrobianos naturais: » Condimentos: contêm vários óleos essenciais que apresentam atividade antimicrobiana. Entre eles estão o eugenol, presente no cravo, alicina, no alho, timol e isotimol, no orégano, e alil-isotiocianato, na mostarda. » Ovo: a clara do ovo é rica em lisozima, uma enzima capaz de destruir a parede celular bacteriana. » Leite: possui substâncias antimicrobianas naturais específicas como imunoglobulinas, fator complemento, macrófagos e linfócitos; e inespecíficas, como o sistema lactoperoxidase (age pela quebra de peróxidos presentes no leite e libera oxigênio, o qual promove a oxidação 22 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS de grupos SH de enzimas vitais ao micro-organismo), lactoferrina, lisozima, nisina. » Frutas e vegetais: o ácido hidroxicinâmico e taninos encontrados em muitos alimentos desse grupo apresentam importante ação antibacteriana e antifúngica. Além dos antimicrobianos naturalmente presentes nos alimentos, há compostos químicos (conservantes) que são adicionados aos alimentos para aumentar seu tempo de vida útil. Estruturas biológicas A cobertura natural de alguns alimentos funciona como barreira mecânica, fornecendo proteção contra a entrada e posterior degradação por micro-organismos. Nesta categoria, estão a casca das nozes, frutas e ovos, bem como a película que envolve as sementes e também a pele dos animais. Interação entre micro-organismos Alguns micro-organismos presentes em alimentos produzem metabólitos inibidores ou letais a outros micro-organismos presentes nesse alimento. As bactérias láticas podem diminuir o pH do alimento, tornando o meio muito ácido para o crescimento de outros micro-organismos. Por outro lado, a formação de aminas pela ação de descarboxilases produzidas por muitos micro-organismos, aumenta o pH do alimento e torna o meio propício para o crescimento dos micro-organismos anteriormente inibidos pelo meio ácido. Outras bactérias produzem substâncias com atividade bactericida, denominada de bacteriocinas. Como exemplo, tem-se a Colicina que é produzida por determinadas cepas de E. coli e enterobactérias. Além disso, algumas bactérias produzem metabólitos que são essenciais para o crescimento de outras. A Pseudomonas aeruginosa produz tiamina e triptofano, os quais são essenciais para o Staphylococcus aureus. Fatores extrínsecos Entre os fatores extrínsecos, os mais importantes são: » temperatura do ambiente; 23 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS │ UNIDADE I » umidade relativa do meio; » composição química da atmosfera que envolve o alimento. Esses fatores são discutidos a seguir. Temperatura do ambiente Os micro-organismos são capazes de multiplicarem-se em uma ampla faixa de temperatura. Costuma-se classificar os micro-organismos em grupos, conforme sua temperatura ideal de crescimento: » Micro-organismos psicrófilos: se multiplicam na faixa de temperatura entre 0°C e 20°C e possuem temperatura ótima de multiplicação entre 10ºC e 15ºC. Multiplicam-se em alimentos refrigerados e são os principais agentes deteriorantes de carnes, pescados, ovos, frangos e outros. » Micro-organismos psicrotróficos: possuem temperatura ótima de multiplicação entre 0ºC e 7ºC. Assim como os psicrófilos, possuem a característica de multiplicarem-se em alimentos refrigerados. » Micro-organismos mesófilos: possuem temperatura ótima de multiplicação entre 25ºC e 40ºC. Correspondem a maioria dos micro-organismos de importância nos alimentos, inclusive os patógenos, os quais geralmente tem sua temperatura ótima de crescimento em torno de 37 °C. » Micro-organismos termófilos: possuem temperatura ótima de multiplicação entre 45ºC e 65ºC. Bactérias patogênicas e deteriorantes pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium são exemplos importantes presentes em alimentos. OBS: esta classificação varia conforme a literatura, porém, hoje, esta é a mais aceita. Umidade relativa do meio A atividade de água e a Umidade Relativa (UR) do meio se correlacionam. É importante que o alimento seja estocado sob condições de UR que não permitam que o alimento absorva umidade do ar, para, desta forma, evitar aumento da atividade de água (o que levaria a uma maior multiplicação microbiana). Isso ocorre quando alimentos com baixa Aa são armazenados em locais com alta UR, onde os alimentos absorvem água 24 UNIDADE I │ INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS até entrar em equilíbrio com o meio. Da mesma maneira, alimentos que apresentam alta Aa perdem umidade quando são estocados em ambientes com UR baixa. Composição gasosa da atmosfera que envolve o alimento A composição gasosa do ambiente em que um alimento for armazenado pode selecionar os tipos de micro-organismos que irão predominar nele. A presença de oxigênio favorece o desenvolvimento de micro-organismos aeróbios, enquanto a sua ausência propicia a multiplicação de micro-organismos anaeróbios. Modificações na composição gasosa do ambiente são tecnologias utilizadas para causar alterações nos micro-organismos que vivem em um alimento. A “atmosfera modificada” é um destes recursos, em que o oxigênio é parcialmente ou totalmente substituído por outros gases, com a intenção de aumentar a vida útil do alimento. Embalagens a vácuo e atmosferas contendo CO2 também são bastante empregadas para prolongar o armazenamento de frutas e carnes vermelhas. 25 UNIDADE IIMICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Para dar continuidade à disciplina de Microbiologia dos Alimentos, estudaremos, nesta unidade, a importância dos micro-organismos na produção de alimentos e sua aplicação como promotores de saúde. Também estudaremos os efeitos indesejados de deterioração microbiona nos alimentos e os danos que diversos micro-organismos podem causa a saúde humana. CAPÍTULO 1 Efeitos benéficos dos micro-organismos Papel dos micro-organismos na produção de alimentos No final do século XIX, os micro-organismos usados na produção de alimentos foram cultivados puros pela primeira vez, dando início a microbiologia industrial dos alimentos. No momento em que foi compreendido que o crescimento de certos micro-organismos sob condições específicas produzia determinado alimento e que outros micro-organismos podiam estragá-lo, foi mais fácil controlar a qualidade dos produtos. Hoje, os micro-organismos são utilizados em diferentes processos na indústria alimentícia. A fabricação industrial de produtos microbianos normalmente envolve fermentação. A fermentação industrial é um cultivo em larga escala de micro-organismos para produzir substâncias de valor comercial. A seguir discutiremos o papel dos micro- organismos na produção de alguns alimentos. Queijo Várias etapas estão envolvidas na conversão do leite em queijo: 26 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS » Uma cultura iniciadora ou starter de bactérias láticas é adicionada ao leite, que pela fermentação, converte a lactose em ácido lático. » Depois, ocorre a coagulação enzimática do leite, que é provocada pelas enzimas do coalho ou coagulantes. Todos os tipos de queijo necessitam da formação de um coalho. A formação do coalho dá-se por ação de uma enzima chamada quimosina (ou renina) que pode ser produzida por micro-organismos, e esta enzima é favorecida pelas condições ácidas produzidas pelas bactérias láticas. Podem ser usados vários tipos e combinações diferentes de cultura iniciadora e coalho, dependendo do tipo de queijo a ser produzido. » Após, o coalho é separado da fração líquida (soro), ocorre a acidificação eeste é transportado para os moldes de queijo onde é prensado. » O próximo passo é a etapa de salga. » Por último ocorre o processo de maturação, em que ocorrem várias transformações biológicas dando sabores e aromas característicos. » Além disso, ainda há as culturas ou fermentos secundários, as quais são micro-organismos adicionados que não têm a função específica de produção de acidez, mas sim a obtenção de alguma característica particular desejável. Por exemplo, uma espécie de Propionibacterium produz gás e provoca o aparecimento de buracos nos queijos Suíços; os mofos azuis e brancos são utilizados para a fabricação dos queijos como Gorgonzola, Camembert e Brie. Iogurte O iogurte é um produto lácteo obtido pela fermentação do leite. A cultura mista de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii bulgaricus é responsável pela transformação da lactose em ácido lático. Na fermentação, os Streptococcus thermophilus desenvolvem-se inicialmente com grande intensidade para dar ambiente favorável aos Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, os quais intensificam seu desenvolvimento em seguida. Assim, as duas culturas se completam, mas é preciso que estejam sempre em equilíbrio. Elas contribuem não apenas para a produção do ácido, mas também para a produção do aroma e sabor. 27 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II Outras fermentações Os micro-organismos também são utilizados na fabricação de pães. Os açucares da massa do pão são fermentados por leveduras. A espécie utilizada para a produção de pães é Saccharomyces cerevisiae. Essa também é utilizada na produção de cervejas a partir de grãos e na fermentação de vinhos a partir de uvas. Diversas linhagens de S. cerevisiae se desenvolveram ao longo dos anos e são altamente adaptadas para utilizações em processos industriais. Probióticos – aplicação de micro-organismos como promotores de saúde O desenvolvimento de novos produtos alimentícios é um desfio, visto que o consumidor está cada vez mais exigente, requerendo alimentos que sejam simultaneamente saudáveis e atrativos. Há muito tempo já se sabe os efeitos benéficos de determinados alimentos. Entretanto, o estudo desses alimentos – denominados alimentos funcionais – tornou-se intenso nos últimos anos. Alimentos funcionais são aqueles que, além de fornecerem nutrição básica, contêm substâncias que podem ser consideradas biologicamente ativas, produtoras de benefícios clínicos ou capazes de promoverem saúde. Esses alimentos possuem potencial para promover a saúde por mecanismos não previstos na nutrição convencional, e deve-se ressaltar que esse efeito se restringe à promoção da saúde e não à cura de doenças. Além disso, a fisiologia intestinal, bem como a composição e atividade do ecossistema microbiano responsável pela sua colonização, tem atraído um grande interesse para o desenvolvimento de alimentos funcionais, o que é demonstrado pelo crescimento no mercado de probióticos, prebióticos e simbióticos. Microbiota intestinal O termo microbiota intestinal refere-se ao ecossistema formado de micro-organismos que reside normalmente no intestino do homem. Este ecossistema possibilita o desempenho normal das funções fisiológicas do hospedeiro, a menos que micro-organismos prejudiciais e patogênicos dominem a microbiota. A maior concentração de micro-organismos e atividade metabólica é encontrada no intestino grosso, onde até 500 espécies de bactérias podem estar presentes. A microbiota gastrointestinal humana exerce um papel fundamental na nutrição e saúde. Por meio da fermentação, as bactérias do intestino metabolizam vários substratos resultando em 28 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS ácidos graxos de cadeia curta e gases. Este metabolismo contribui para a geração de energia para o hospedeiro. Normalmente, o organismo hospedeiro está em harmonia com a microbiota do intestino. Porém, sob certas circunstâncias, como ingestão de antimicrobianos, pode haver um desequilíbrio desta microbiota. Com alterações na microbiota, pode ocorrer proliferação de patógenos, com consequente infecção bacteriana. Mesmo sem desequilíbrio, a contaminação por patógenos pode ocorrer, levando a alteração na colonização normal e resultando em desordens intestinais. O conhecimento da microbiota intestinal e das suas interações levou ao desenvolvimento de estratégias alimentares que mantém e estimulam as bactérias normais ali presentes. Com os probióticos presentes na alimentação, há um aumento do número de micro-organismos promotores da saúde no trato gastrintestinal. Os prebióticos também podem aumentar esse número, visto que podem levar a seleção da composição microbiana. Conceitos gerais sobre probióticos, prebióticos e simbióticos Probióticos A palavra probiótico tem origem grega e significa “para a vida”. Foi inicialmente usada para descrever compostos que estimulavam o crescimento microbiano. Atualmente, probiótico é definido como um suplemento alimentar que contêm micro-organismos vivos e quando são ingeridos em quantidades adequadas, apresentam efeito benéfico sobre a saúde e bem-estar do hospedeiro. São capazes de melhorar o equilíbrio microbiano intestinal produzindo efeitos positivos à saúde do indivíduo. O uso de probióticos introduz micro-organismos benéficos e causam diminuição, por competição, de outras espécies de bactérias que podem ser prejudiciais. Dessa maneira, melhoram a ecologia específica da microbiota intestinal. Os principais critérios para um micro-organismo ser utilizado como célula probiótica são: » Não deve apresentar patogenicidade. » Depois de ingerido, deve ser capaz de sobreviver às condições de estresse presentes no trato gastrointestinal, ou seja, ser resistente ao suco gástrico, sais biliares e enzimas digestivas. 29 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II » Adesão às células da mucosa intestinal. » Manter sua viabilidade e atividade metabólica no intestino para exercerem os efeitos benéficos aos hospedeiros. » Deve possuir habilidade para sobreviver aos processos tecnológicos que o alimento é submetido. » Deve manter-se estável e viável em níveis satisfatórios durante todo o prazo de validade do produto. » Apresentar comprovadamente benefícios à saúde. Os benefícios já relatados à saúde do hospedeiro atribuídos à ingestão de culturas probióticas são: » Controle da microbiota intestinal. » Estabilização da microbiota intestinal após o uso de antibióticos. » Promoção da resistência gastrintestinal à colonização por patógenos. » Diminuição da concentração dos ácidos acético e lático de bacteriocinas e outros compostos antimicrobianos. » Promoção da digestão da lactose em indivíduos intolerantes à lactose. » Estimulação do sistema imune. » Efeito hipocolesterolêmico. » Efeito anticarcinogênico. » Alívio da constipação. » Aumento da absorção de minerais e vitaminas. Os probióticos podem ser comercializados contendo um único micro-organismo ou uma combinação deles. Podem apresentar-se na forma de preparações farmacêuticas (cápsulas ou sachê) ou naturais (leite fermentado ou iogurte). Atualmente, os alimentos probióticos existentes são sobremesas a base de leite, leite fermentado, leite em pó, sorvete, iogurte e diversos tipos de queijo. 30 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Prebióticos São ingredientes alimentares não digeríveis, porém, fermentáveis, que afetam de forma benéfica o organismo por estimular seletivamente o crescimento ou atividade de bactérias desejáveis no cólon, tais como as Bifidobactérias e os Lactobacillos. É uma substância que modifica a composição da microbiota de tal forma que as bactérias com potencial de promoção de saúde tornam-se predominantes. Adicionalmente,os prebióticos podem inibir a multiplicação de patógenos, garantindo benefícios adicionais à saúde do hospedeiro. Os prebióticos podem incluir féculas, fibras, outros açucares não absorvíveis, álcoois do açúcar e oligossacarídeos. Os oligossacarídeos são encontrados como componentes naturais de vários alimentos, como frutas, vegetais, leite e mel. Entre as características de um prebiótico, ressalta-se: » Ser de origem vegetal. » Formar parte de um conjunto heterogêneo de moléculas complexas. » Resistir às enzimas salivares, pancreáticas e intestinais. » Resistir ao ácido estomacal. » Não deve sofrer hidrólise enzimática ou absorção no intestino delgado. » Ser parcialmente fermentada por bactérias. » No cólon deve ser metabolizado seletivamente por número limitado de bactérias benéficas. » Ser capaz de alterar a microbiota para uma microbiota mais saudável. » Induzir efeito fisiológico importante para a saúde. Alguns efeitos benéficos dos prebióticos: » Estímulo do crescimento das Bifidobactérias no intestino, as quais intensificam o sistema imunológico do hospedeiro. » Melhora da flora intestinal, prevenindo a diarreia e constipação intestinal. 31 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II » Redução do desenvolvimento do câncer. » Melhora dos níveis de lipídios séricos. » Controle da tolerância à glicose. Simbiótico São aqueles resultantes da combinação entre bactérias probióticas e substâncias prebióticas. Essa combinação deve possibilitar a sobrevivência da bactéria probiótica, devido ao seu substrato específico estar disponível para fermentação na forma de prebiótico. Assim, os efeitos destes ingredientes podem ser adicionais ou sinérgicos. Os alimentos simbióticos estão representados principalmente pelos produtos lácteos fermentados. Micro-organismos probióticos Entre os probióticos, dois grupos microbianos têm maior relevância e são bastante comercializados: as bactérias lácticas (principalmente dos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus) e as leveduras (Saccharomyces). Gênero Bifidobacterium As bifidobactérias são micro-organismos gram-positivos, não formadores de esporos, desprovidos de flagelos, catalase-negativos e anaeróbios. Bifidobactérias são habitantes naturais do trato gastrintestinal humano. Recém-nascidos são colonizados por bactérias bífidas durante os dias após o nascimento e a população parece se manter relativamente estável até idade avançada, quando ocorre um declínio. Atualmente, o gênero Bifidobacterium inclui trinta espécies, dez das quais são de origem humana, 17 de origem animal, 2 de águas residuais e 1 de leite fermentado. Essa última tem a particularidade de apresentar uma boa tolerância ao oxigênio. Somente cinco espécies de Bifidobacterium de origem humana têm atraído a atenção da indústria para a produção de produtos lácteos fermentados com finalidade probiótica. São elas: B. longum, B. bifidum, B. breve, B. infantis e B. adolescentes. 32 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Gênero Lactobacillus Estes micro-organismos são geralmente gram-positivos, não esporulados e desprovidos de flagelos. São aerotolerantes ou anaeróbios. O gênero Lactobacillus apresenta cinquenta e seis espécies reconhecidas, dezoito delas são presentes na microbiota intestinal de humanos, entretanto, as mais utilizadas para fins probióticos são L. acidophilus, L. rhamnosus e L. casei. Levedura Saccharomyces boulardii É uma levedura termotolerante, insensível à ação dos sucos digestivos e a antibacterianos. Essa última característica é importante, visto que algumas terapias podem associar probióticos com antibacterianos em infecções gastrointestinais. 33 CAPÍTULO 2 Deterioração microbiana de alimentos Os alimentos são facilmente contaminados com micro-organismos na natureza, durante a manipulação, o processamento e o armazenamento do produto. Após contaminação, o alimento serve como meio de crescimento microbiano e a atividade metabólica do micro-organismo resulta em alterações físicas e químicas do alimento, podendo levar a deterioração do produto. Além disso, os micro-organismos no alimento também podem ser responsáveis por intoxicações e infecções, com danos à saúde, como será discutido posteriormente. Portanto, a presença de micro-organismos está fortemente associada com a qualidade do alimento para consumo humano. As bactérias, bolores e leveduras são os principais agentes deteriorantes de alimentos, assim como também são aqueles com maior destaque como eventuais patógenos ao homem. Em geral, as bactérias são os micro-organismos predominantes nos alimentos, pois apresentam tempo de geração bastante reduzido, são capazes de utilizar diversos substratos como fonte de energia e seus diferentes gêneros apresentam ampla variação de comportamento frente a fatores ambientais. A seguir, vamos discutir a deterioração de alguns dos principais grupos de alimentos. Deterioração de carnes e derivados A carne é o mais perecível de todos os alimentos importantes. Ela é abundante em nutrientes necessários para o crescimento microbiano e, além disso, esses nutrientes estão disponíveis nas carnes frescas. Apresenta alta atividade de água, é um alimento rico em substâncias nitrogenadas, minerais e fatores de crescimento, e, ainda, seu pH é favorável para o crescimento da maioria dos micro-organismos. Os micro-organismos que alteram a carne chegam até ela por contaminação exógena (invasão post mortem) e, também, com menos frequência, por contaminação endógena (infecção do animal vivo). Entre os principais itens de fontes e rotas de contaminação de carnes frescas por micro-organismos estão: » faca da sangria; » pele e pelos do animal; » trato gastrointestinal do animal; 34 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS » mãos dos manipuladores; » recipientes utilizados no acondicionamento da carne; » ambiente de manuseio e armazenamento; » nódulos linfáticos do animal. Os tipos de deterioração de carnes podem ser classificados de acordo com a atmosfera que envolve o produto e por quais tipos de micro-organismos são provocados. A temperatura é outro fator importante que tem influência sobre o tipo de deterioração: carne refrigerada é deteriorada por micro-organismos que crescem nessas temperaturas, sendo muitos deles capazes de produzir limosidade superficial, alteração na cor e pontos de crescimento superficial; já os micro-organismos putrefativos requerem temperaturas mais elevadas. Algumas alterações em condições de aerobiose: » Limosidade superficial – os gêneros de micro-organismos responsáveis por essa deterioração estão relacionados com a temperatura e com a quantidade de água disponível. Pseudomonas e Alcaligenes desenvolvem-se em alimentos com alta atividade de água que são armazenados em temperaturas de refrigeração, já alimentos como salsicha e linguiças, os quais apresentam uma atividade de água menor, a limosidade é ocasionada por micrococos e leveduras. » Alteração na cor – os pigmentos da carne são constituídos principalmente por duas proteínas: hemoglobina (pigmento do sangue) e mioglobina (pigmento dos músculos), sendo que a última constitui 80 a 90% do pigmento total. A porção heme do pigmento é importante para determinar a cor da carne. Os pigmentos da carne podem reagir com diversos substratos e, dessa forma, alterar a cor. Isso dependerá da forma que o ferro se encontra no anel heme. Em sua forma oxidada (íon férrico – Fe+++), o ferro não tem capacidade de reagir, já em sua forma reduzida (íon ferroso – Fe++) reage rapidamente com a água e oxigênio, originando a cor vermelha desejada na carne. Por isso é importante que o tecido muscular se mantenha em condições reduzidas. A cor vermelhada carne pode adquirir tons de verde, marrom ou cinza, devido à presença de bactérias que podem produzir H2S e compostos oxidantes. 35 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II Em carnes vermelhas processadas, pode ocorrer esverdeamento causado por H2S ou por H2O2. O micro-organismo mais comum associado ao esverdeamento por H2O2 é Lactobacillus viridescens, porém, outros podem também estar envolvidos como Leuconostocs, Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis. No esverdeamento relacionado a H2S, os principais micro-organismos que estão envolvidos são: Pseudomonas mephitica, Shewanella putrefaciens e Lactobacillus sake. Além disso, podem estar presentes na carne bactérias e leveduras produtoras de pigmentos. Serratia marcescens é uma bactéria que provoca o surgimento de pontos vermelhos na carne e Pseudomonas Syncyane transmite cor azul à superfície do produto. As leveduras, devido aos pigmentos que produzem, provocam o aparecimento de cor branca, creme, rosa ou marrom. Já os bolores, como Sporotrichum carnis, podem deixar pontos brancos visíveis devido ao seu crescimento. » Rancificação – embora a maioria dos problemas relacionados à rancificação da carne não seja de origem microbiana, alguns micro-organismos lipolíticos podem causar tanto lipólise quanto oxidação de gorduras presentes na carne, levando a rancificação. Pseudomonas e outras bactérias gram-negativas, Bacillus, leveduras e bolores podem ser responsáveis por essas alterações. Há também bactérias aeróbicas facultativas e anaeróbicas que crescem no interior da carne. A seguir são destacadas algumas alterações em condições de anaerobiose. » Acidificação – resultante do acúmulo de ácidos orgânicos durante a degradação enzimática bacteriana de moléculas complexas. A proteólise causada por espécies de Clostridium e coliformes pode resultar em acidificação. » Putrefação – decomposição anaeróbia de proteínas com produção de compostos que apresentam aroma desagradável (H2S, indol, escatol etc.). O gênero Clostridium é o principal causador desse tipo de deterioração. » Odores ou sabores estranhos – alteração consequente da acidificação e putrefação. Deterioração de frangos As bactérias são as principais causadoras da deterioração de frangos, sendo o conteúdo intestinal a fonte primária desses micro-organismos. A maioria delas cresce na superfície, com os produtos de decomposição difundindo-se vagarosamente para o interior da 36 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS carne. Quando as aves são deterioradas, odores desagradáveis normalmente aparecem quando a contagem bacteriana atinge 2,5 milhões de UFC/cm2. Quando a deterioração ocorre sob baixas temperaturas, os principais micro-organismos envolvidos pertencem ao gênero Pseudomonas. Acinetobacter, Flavobacterium e Corynebacterium também são gêneros de bactérias importantes na deterioração desse tipo de alimento. Os fungos têm menor importância na deterioração de aves, exceto quando antibióticos são utilizados para suprimir o crescimento bacteriano. Quando estes são usados, os bolores se tornam os principais agentes deteriorantes. Entre as leveduras, os gêneros mais importantes são: Candida, Rhodotorula, Debaryomyces e Yarrowia. Deterioração de pescados A qualidade sanitária da água de onde os animais são retirados é crucial para obter um produto final com boa qualidade microbiológica. Além disso, a contaminação microbiológica também pode ocorrer durante o processamento, como no momento da descamação, evisceração e empanamento do produto. O pescado é uma das mais importantes fontes de proteína para o ser humano. Contudo, é um dos alimentos com maior tendência a deterioração, visto que apresenta alta atividade de água, teor de gorduras insaturadas facilmente oxidáveis, pH próximo à neutralidade e também devido à sua composição química, a qual pode variar conforme a espécie, época do ano e alimentação do animal. Tanto os peixes de água doce como os de água salgada contêm altos teores de proteínas e outros constituintes com nitrogênio (aminoácidos livres, óxido de trimetilamina, ácido úrico e ureia, entre outros). O conteúdo de carboidrato é desprezível. Por isso, a deterioração desses produtos é caracterizada pela utilização de substância nitrogenadas, principalmente as não proteicas, como fonte de energia para os micro-organismos, o que tem como consequência o aumento do pH. A deterioração de pescados pode ocorrer por autólise (ação dos sucos digestivos e enzimas dos tecidos que, após a morte do pescado, provocam desintegração e decomposição da carne – o que favorece o crescimento microbiano), oxidação (a oxidação das gorduras insaturadas resulta em alterações de aroma e coloração) e desenvolvimento bacteriano (ao lado da autólise e oxidação acelera ainda mais o processo de deterioração). As reações enzimáticas que ocorrem nos tecidos do pescado após sua morte produzem várias substâncias nitrogenadas não proteicas, as quais serão utilizadas pelas bactérias. 37 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II As principais alterações químicas decorrentes da deterioração são a produção de bases nitrogenadas voláteis (trimetilamina) com aroma característico e produção de amônia. Pseudomonas, Moraxella, Shewanella, Flavobacterium, Vibrio e Micrococcus estão presentes na flora natural dos pescados e estão associados à deterioração deste alimento, contudo, Pseudomonas e Shewanella são os gêneros de bactérias de maior importância. Entre as leveduras, podemos destacar os gêneros Candida, Cryptococcus e Rhodutorula e entre os bolores Aspegillus, Aureobasidium (Pullularia) e Penicillium. Deterioração de leite e seus derivados O leite apresenta características intrínsecas que propicia o crescimento microbiano, tais como alta atividade de água, pH próximo à neutralidade e riqueza de nutrientes. No leite cru recém-ordenhado estão presentes substâncias com atividade antimicrobiana, como lectoperoxidase e aglutininas, porém elas são rapidamente inativadas. O leite pode ser contaminado durante a ordenha, como também durante a manipulação, transporte, processamento e armazenamento deste alimento, sendo os utensílios de ordenha e tubulações de coletas as principais fontes de contaminação. Além disso, os micro-organismos presentes na pele do animal, no esterco e no solo também podem contaminar este alimento. Os principais sinais de deterioração do leite são: » Sabores e odores estranhos – geralmente, é decorrente do crescimento de micro-organismos que resistiram à pasteurização ou de resultante de contaminação do produto após o processo térmico. O sabor e odor ácidos são resultantes de reações de fermentação de açucares por bactérias; o sabor amargo é devido à proteólise; o aroma de caramelo pode ser provocado por Lactobacillus lactis var. maltigenes; e o odor de peixe por ser devido à presença de Aeromonas hydrophila. » Alteração de cor – pode ser devido ao crescimento de micro-organismos produtores de pigmentos, tais como Pseudomonas syncyanea, que pode deixar o alimento azul ou amarelo e Serratia marcescens e Micrococcus roseus, que produzem colônias vermelhas/rosas na superfície o alimento. » Rancidez – resultante da hidrólise ou oxidação de gorduras por micro-organismos, tais como Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Proteus, Clostridium e alguns bolores e leveduras. 38 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS » Alteração na viscosidade – o aumento de viscosidade na superfície do leite pode ser devido ao desenvolvimento de Alcaligenes viscolatis e em todo o interior do alimento devido ao crescimento de Enterobacter spp., Klebsiella oxytoca, Lactococcus lactis e Lactobacillus spp. » Produção de gás – a formação de espuma no leite é característica da produção de gás. As bactérias dosgrupos dos coliformes são as principais produtoras de gás em leite cru; Bacillus e Clostridium são responsáveis por este problema em leite pasteurizado; bactérias propiônicas em queijos; e leveduras fermentadoras de sacarose em leite condensado. Deterioração de ovos O ovo da galinha é um excelente exemplo de produto bem protegido, sendo a maioria deles estéril em sua parte interna. Externamente, um ovo fresco apresenta três estruturas que impedem a entrada de micro-organismos: a membrana cerosa externa, a casca e a membrana interna da casca. Esse alimento também apresenta a enzima lisozima na clara, a qual é bastante eficaz contra bactérias gram-positivas. Além disso, a clara contém avidina, a qual se complexa com a biotina tornando essa vitamina indisponível para os micro-organismos. Outro fator que desfavorece o crescimento microbiano na clara do ovo é o seu pH elevado, em torno de 9,3. Já os nutrientes contidos na gema e seu pH em torno de 6,8 fazem com que ela seja fonte para o desenvolvimento de muitos micro-organismos. As cascas são fontes de contaminação, a qual pode ocorrer por matéria fecal da ave, pela água de lavagem e pela manipulação ou armazenamento deste alimento. Os micro-organismos podem entrar, crescer e causar a deterioração do ovo. A deterioração do ovo pode ser visualizada pela sua aparência, mas em geral, só é notada se o ovo for quebrado. A deterioração dos ovos é predominantemente de origem bacteriana. Pseudomonas fluorescens provocam o aparecimento de pontos verdes na clara. Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes e alguns coliformes podem causar aparecimento de pontos coloridos na gema e sua desintegração. Proteus spp. estão relacionados a pontos negros que evoluem até escurecimento e desintegração da gema. Além disso, todas essas bactérias também provocam alteração no odor dos ovos. Em atmosferas com alto grau de umidade, pode ocorrer deterioração fúngica superficial e os fungos mais comuns associados a esse problema são espécies de Penicillium, Cladosporium, Sporotrichum, Mucor, entre outros. 39 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II Deterioração de produtos de origem vegetal A grande exposição desses produtos ao meio ambiente propicia a contaminação por micro-organismos. As boas práticas agrícolas são fundamentais para obter um produto de qualidade. O uso inadequado de esterco não curtido na adubação, a água da irrigação e as mãos de manipuladores são as principais fontes de contaminação microbiológica. Contudo, o ambiente físico é difícil de ser controlado, apresentando muitas fontes de contaminação (solo, água, ar etc.). As camadas protetoras de muitas frutas e vegetais, bem como os valores baixos de pH que muitos desses alimentos apresentam, são fatores importantes no controle de micro-organismos. A composição média dos vegetais é 88% de água, 8,6% de carboidratos, 1,9% de lipídios, entre outros componentes. Sua composição, aliada a alta atividade de água, baixa acidez e potencial de oxirredução relativamente alto contribuem para o desenvolvimento microbiológico. A deterioração microbiana pode ser devido a uma infecção que ocorreu enquanto o alimento se encontrava aderido à planta produtora ou após ter sido separado dela, durante a colheita ou nas operações seguintes. A infecção pós-colheita está bastante relacionada a lesões mecânicas sofridas no alimento. Os produtos danificados devem ser retirados do mercado, havendo, portanto, prejuízos econômicos. Erwinia é o gênero mais frequentemente envolvido na deterioração de produtos de origem vegetal, ocasionando podridão mole. Pseudomonas, Clostridium e Bacillus também estão relacionados a este tipo de podridão bacteriana. Os micro-organismos hidrolisam a pectina provocando amolecimento do alimento, odor desagradável e aparência úmida. Vegetais como cebola, alho, cenoura, alface, batata, repolho, melancia e brócolis sofrem esse tipo de deterioração. Em relação à deterioração fúngica, destaca-se o gênero Botrytis, o qual causa podridão em pelo menos 26 tipos de vegetais. Este gênero, por exemplo, invade a flor do morango causando podridão cinza. O gênero Colletotrichum é responsável por causar antracnose nas frutas cítricas, mangas e abacate e o gênero Gloesporium causa esta deterioração na banana, principalmente pós-colheita. A Thielaviopsis fixa-se na haste do abacaxi causando uma deterioração de coloração negra na fruta. Uma grande variedade de gêneros de leveduras pode ser responsável pela deterioração de frutas. As frutas diferem um pouco dos vegetais por apresentarem um conteúdo de água um pouco menor e uma maior quantidade de carboidratos. Além disso, o pH das frutas é menor do que o considerado favorável para o crescimento bacteriano. Muitas leveduras 40 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS são capazes de fermentar os açucares encontrados nas frutas e, como normalmente tem crescimento mais acelerado que os bolores, acabam por iniciar a deterioração desses alimentos. Ainda não está bem explicado se alguns bolores dependem da ação inicial das leveduras para depois entrarem no processo de deterioração, porém a degradação dos constituintes de alto peso molecular das frutas é realizada mais pelos bolores. 41 CAPÍTULO 3 Doenças de origem alimentar Vários agentes causadores de doenças ao homem podem ser transmitidos pelos alimentos, tais como: produtos químicos, toxinas, vírus, parasitas, bactérias e fungos. Entre os micro-organismos patogênicos com interesse na área de alimentos, destacam-se os enteropatogênicos, cuja patologia se expressa no trato gastrointestinal, sendo diarreia o sintoma mais comum. Entretanto, as doenças de origem alimentar podem não se limitar apenas ao trato gastrointestinal, mas afetar outros órgãos, atingindo sistema nervoso, corrente circulatória, fígado, entre outros. As doenças microbianas de origem alimentar são divididas em dois grupos: » Intoxicações alimentares: são doenças causadas pela ingestão de alimentos contendo toxinas microbianas, as quais são pré-formadas no alimento. Neste grupo destacam-se Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus eméticos e fungos produtores de micotoxinas. Os sintomas geralmente aparecem de 1 a 6 horas após a ingestão do alimento contaminado e duram de horas até 2 dias. » Infecções alimentares: são doenças causadas pela ingestão de alimentos contendo células viáveis de micro-organismos patogênicos, os quais se aderem à mucosa do intestino humano e o colonizam. Os micro-organismos podem ser invasivos ou toxigênicos. Os micro-organismos invasivos, após a colonização, penetram e invadem os tecidos como Salmonella, Listeria monocytogenes, Shigella, Escherichia coli invasora e Yersinia enterocolitica. Já os micro-organismos toxigênicos produzem toxinas que alteram o funcionamento das células do trato gastrointestinal. São exemplos de micro-organismos toxigênicos: Vibrio cholerae, Escherichia coli enterotoxigênica e Campylobacter jejuni. De maneira geral, as infecções alimentares apresentam tempos de incubação maiores que as intoxicações alimentares, sendo que os sintomas aparecem de 6 a 24 horas após a ingestão do alimento contaminado e duram de 3 a 7 dias. Surto alimentar é caracterizado pelo aparecimento de sintomas como diarreia, vômito, dores de cabeça, entre outros, após a pessoa ingerir um alimento que estava contaminado. 42 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Você saberia responder quantas pessoas precisam passar mal, após ingerirem um alimento contaminado, para ser considerado um surto alimentar? Os principais micro-organismos causadores de doenças de origem alimentar foram agrupados em quatro categorias: 1. bactérias gram-positivas; 2. bactérias gram-negativas;3. fungos produtores de micotoxinas; 4. vírus. A seguir vamos discutir cada uma desses grupos. Bactérias gram-positivas Clostridium botulinum Características » Bacilos gram-positivos. » Formadores de esporos (o que confere maior resistência). » Anaeróbios estritos. » Flagelados. » Amplamente distribuídos na natureza (solo e água principal). » Capazes de produzir toxinas (toxinas A, B, E e F são causadoras de botulismo no homem). » Produtores de neurotoxina botulínica. » Toxina não é formada em pH<4,5. » Toxinas são termo lábeis: destruídas por aquecimento a 80ºC por 30 minutos ou a 100ºC por pouco minutos. » Resistência térmica dos esporos: 100°C por 360 min ou 120°C por 4 min. 43 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II Doença » Botulismo. » Intoxicação alimentar de extrema gravidade. » Período de incubação: 12 a 36 horas (depende da quantidade de toxina ingerida). » A doença pode iniciar com problemas gastrintestinais (náuseas, vômitos e diarreia). O início da ação da neurotoxina botulínica provoca fadiga e fraqueza muscular, acompanhada de problemas de visão, secura da boca, dificuldade de deglutição e de controle da língua. A musculatura que controla a respiração é progressivamente paralisada podendo levar a parada respiratória e morte. Alimentos associados Alimentos com pH elevado e ambiente anaeróbio (embutidos ou enlatados, hambúrgueres, patês). Medidas de controle » Tratamento térmico adequado. » Acidificação. » Redução da Aa. » Uso de nitratos e nitritos – além de responsáveis pela coloração da carne, também visam o controle do botulismo. Clostridium perfrigens Características » Bacilos gram-positivos. » Formadores de esporos. » Anaeróbios. » Apresentam cápsula. 44 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS » Imóveis. » Amplamente distribuídos na natureza e podem habitar o trato intestinal de pessoas e animais (gado, porcos, aves e peixes). » Intensa atividade metabólica em alimentos, produzindo uma grande variedade de enzimas hidrolíticas extracelulares e capazes de fermentar um grande número de carboidratos. » Agrupados em cinco tipos identificados de A até E, de acordo com as exotoxinas produzidas. » Capacidade de multiplicarem-se em altas temperaturas, sendo a temperatura ótima entre 40 e 45 ºC. » Temperatura ótima de esporulação fica entre 35 °C e 40 °C. » Apresentam um dos menores tempos de geração entre as bactérias com interesse em alimentos. » pH ideal de crescimento é entre 6,0 e 7,0 (valores abaixo de 5,0 ou superiores a 8,3 são bastante inibidores). Doença » Ocorre pela ingestão de alimentos contendo alto número de células viáveis, que ultrapassam a barreira gástrica resistindo ao pH ácido e atingem o intestino delgado, onde se desenvolvem e esporulam, liberando a enterotoxina. Essa, por sua vez, necessita da tripsina para ser ativada. » Intoxicação clássica – causada por cepas do tipo A. Os sintomas são dores abdominais agudas, diarreia, náuseas, febre e raramente vômito. » Enterite necrótica – causada por cepas do tipo C. Essa doença é grave e mais rara. Os sintomas são dores abdominais agudas muito intensas, diarreia com sangue, algumas vezes vômito, e inflamação necrótica do intestino delgado. Frequentemente essa doença é fatal. » Período de incubação: em geral de 8 a 12 horas. Alimentos associados Produtos cárneos, molhos, tortas, queijo tipo fresco. A maioria dos surtos é associado à alimentação em estabelecimentos institucionais (restaurantes, hospitais, escolas etc.). 45 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II Medidas de controle » Tratamento térmico adequado – a temperatura de 60°C inativa rapidamente as células vegetativas de C. perfringens. » Resfriamento do alimento – temperaturas abaixo de 15°C inibem o crescimento desse micro-organismo, entretanto, é importante salientar que o resfriamento lento do alimento pode propiciar o desenvolvimento desse micro-organismo. Bacillus cereus Características » Bacilos gram-positivos. » Flagelados. » Formadores de esporos. » Aeróbios. » Capazes de utilizar vários carboidratos. » Produtores de hemolisinas. » Produção de dois tipos de toxina – diarreica (termo lábil – destruída por aquecimento a 55°C por 20 minutos) e emética (termoestável – estável a 126 °C por 90 minutos). » Multiplica-se bem entre 10°C e 48°C, sendo que sua temperatura ótima é entre 28°C e 35°C. » Faixa de pH de sua multiplicação é entre 4,9 e 9,3. » Distribuído na natureza e seu reservatório natural é o solo. Doença A contaminação inicial dos alimentos dá-se através de esporos. Quando o alimento é mantido entre 10 e 50°C, há, então, a germinação e multiplicação microbiana. 46 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Pode causar duas formas de gastroenterite: » Síndrome diarreica – ocorre pela ingestão de alimentos contendo células vegetativas de B. cereus, as quais no intestino delgado irão produzir a toxina diarreica (enterotoxina) responsável pelo quadro diarreico. Os principais sintomas são diarreia intensa, dores abdominais, tenesmos retais, e raramente náuseas e vômito. O período de incubação varia de 8 a 16 horas. » Síndrome emética – causada pela toxina emética. Os principais sintomas são vômitos, náuseas, mal-estar e em alguns casos diarreia. O período de incubação varia de 1 a 5 horas. Alimentos associados » A síndrome diarreica está associada com produtos cárneos, pescados, vegetais crus e cozidos, leite e derivados, ervas secas e especiarias. » A síndrome emética está relacionada com alimentos farináceos, contendo cereais, em especial o arroz. Medidas de controle » Tratamento térmico adequado – cozimento dos alimentos a temperatura superior a 100°C. » Evitar que os alimentos permaneçam em temperatura ambiente após cozidos, uma vez que os esporos de B. cereus podem sobreviver à fervura, germinando e multiplicando-se rapidamente em temperatura ambiente. » As sobras de alimentos devem ser prontamente refrigeradas. Staphylococcus aureus Características » Cocos gram-positivos. » Anaeróbios facultativos, mas com crescimento melhor em aerobiose. » Temperatura de crescimento entre 7°C a 47,8°C. As toxinas são produzidas entre 10°C e 46°C, porém, a temperatura ótima fica entre 40°C e 45°C. 47 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II » Tolerantes a concentrações de 10% a 20% de NaCl e a nitratos. » Crescem na faixa de pH entre 4 a 9,8. » O homem e os animais são os principais reservatórios de S. aureus. A mucosa nasal é o principal habitat no homem, mas também estão presentes na garganta, cabelo e pele. » As intoxicações são associadas a baixas condições de higiene. » Toxina termoestável. Doença » Intoxicação provocada pela ingestão do alimento que apresenta a toxina pré-formada. » Os principais sintomas são: náuseas, vômitos, cãibras abdominais dolorosas, diarreia e sudorese. Também podem ocorrer dores de cabeça, calafrios, queda da pressão arterial e mais raramente febre. » Período de incubação: geralmente de 30 minutos a 8 horas. Alimentos associados Alimentos muito manipulados como pizzas e produtos de confeitaria. Leite, queijos, salada de batata, atum, frango e presunto cozido também estão bastante associados. Medidas de controle » O treinamento de manipuladores é um procedimento de grande importância, incluindo todas as medidas de higiene pessoal, utensílios e instalações. » Refrigeração adequada. » Evitar conservação dos alimentos na faixa de temperatura compreendida entre 7ºC e 60ºC, a fim de impedir a multiplicação do S. aureus e a consequente produção de enterotoxina. 48 UNIDADEII │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Listeria monocytogenes Características » Bacilo gram-positivo. » Anaeróbio facultativo. » Não formador de esporos. » Flagelado. » Crescimento entre 2,5°C e 44°C. » Suporta repetidos congelamentos e descongelamentos. » Pode crescer em pH variando de 5 a 9. » Sobrevive aos níveis recomendados de nitrato de sódio (120 mg/kg) e cloreto de sódio (3%). » Amplamente distribuído na natureza e também nos homens e animais. Doença » L. monocytogenes invade o intestino humano onde são fagocitadas por macrófagos, ficando protegidas contra a ação de leucócitos polimorfonucleares. Após a lise da membrana fagocítica, é liberada no citoplasma da célula do hospedeiro, onde rapidamente se multiplica. » Na fase entérica, a sintomatologia é semelhante a uma gripe, acompanhada de diarreia e febre moderada. » Em gestantes, pode haver invasão do feto, podendo levar ao aborto, parto prematuro, nascimento de natimorto ou septicemia neonatal. Quando o recém-nascido é infectado na hora do parto pode ocasionar meningite. » O sistema nervoso central também pode ser comprometido, com aparecimento de meningite, encefalite e abcessos. » Ainda, não é raro ocorrer bacteremia, apresentando um quadro de febre, fadiga e mal-estar. Náuseas, vômito, dores e diarreia também podem estar presentes. 49 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II » Alta mortalidade em imunodeprimidos, debilitados e recém-nascidos. » Período de incubação: um dia a algumas semanas. Alimentos associados Leite cru e pasteurizado, queijos, carnes de diferentes animais, produtos de origem vegetal e marinha. Medidas de controle » Limpeza e sanificação de equipamentos e utensílios. » Construção das indústrias de modo que impeça a entrada de animais, poeira e insetos. » Evitar contaminação cruzada. Bactérias gram-negativas Escherichia coli patogênica Características » Bacilo gram-negativo. » Anaeróbio facultativo. » Não esporulado. » Os sorotipos desta bactéria são definidos com base nos antígenos: somáticos O; flagelares H; e capsulares K. » Faz parte da flora intestinal de animais de sangue quente. » A presença de E. coli no alimento indica que esse alimento tem uma contaminação de origem fecal, portanto, as condições higiênicas são insatisfatórias. Além disso, diversas linhagens de E. coli são patogênicas ao homem e estão agrupadas em cinco classes: › E. coli enteropatogênica clássica (EPEC). 50 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS › E. coli enteroinvasora (EIEC). › E. coli enterotoxigênica (ETEC). › E. coli entero-hemorrágica (EHEC). › E. coli enteroagregativa (EAggEC). Doença » E. coli enteropatogênica clássica – esse patógeno tem capacidade de aderir à mucosa do intestino e destruir as microvilosidades. É conhecida há décadas como um importante causador de gastrenterite em crianças (acomete principalmente recém-nascidos e lactentes). A diarreia é grave e acompanhada de dores abdominais, vômitos e febre. O período de incubação varia entre 17 e 72 horas. » E. coli enteroinvasora – as cepas de EIEC são capazes de penetrar e romper as células epiteliais, multiplicando-se e invadindo as células vizinhas. A gastroenterite causada por esse micro-organismo causa manifestações clínicas semelhantes às infecções causadas por Shigella e acomete principalmente crianças maiores e adultos. Os sintomas são: disenteria, cólicas abdominais, febre, mal-estar geral e eliminação de sangue e muco com as fezes. O período de incubação varia entre 8 e 24 horas. » E. coli enterotoxigênica – cepas de ETEC são capazes de aderir à mucosa do intestino delgado e produzir toxinas (uma enterotoxina termo lábil e uma termoestável). Provoca diarreia infantil e é considerada um dos principais agentes etiológicos da chamada “diarreia dos viajantes”. A doença caracteriza-se pela diarreia aquosa, febre baixa, dores abdominais e náuseas. Em sua forma mais severa, pode levar à desidratação, o que pode ser muito preocupante em indivíduos desnutridos. O período de incubação varia de 8 a 44 horas. » E. coli entero-hemorrágica – a patogenicidade está relacionada com a produção de citotoxinas (chamadas aqui de verotoxinas). EHEC altera o citoesqueleto das células epiteliais da mucosa intestinal, destruindo as microvilosidades e acumulando actina no local de adesão. A colite hemorrágica é caracterizada por dores abdominais severas, ausência de febre e diarreia aguda, seguida de diarreia sanguinolenta (há grande 51 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II quantidade de sangue nas fezes). Pode evoluir para uma doença grave chamada Síndrome Urêmica Hemolítica (HUS). Acomete principalmente crianças e idosos. O período de incubação varia de 3 a 9 dias. » E. coli enteroagregativa – a adesão desse micro-organismo ocorre principalmente no cólon, mediada por fímbrias. EaggEC interfere no metabolismo celular do enterócito, com ação na absorção de sais e eletrólitos. Estas cepas de E. coli perecem estarem associadas com casos crônicos de diarreia. Alimentos associados Água contaminada com despejos de esgotos e qualquer alimento exposto à contaminação fecal. A carne bovina moída (hambúrguer) é a maior responsável pela ocorrência de surtos, sobretudo quando consumida crua ou insuficientemente cozida. As carnes de aves também têm sido apontadas como causa de surtos. Outros produtos como leite cru, queijos e produtos de origem vegetal (consumidos crus) também constituem fonte de contaminação deste micro-organismo. Medidas de controle » Higiene do abate e da ordenha. » Pasteurização dos produtos lácteos e sucos de frutas. » Cuidados na manipulação de alimentos de origem animal crus. » Higiene das instalações e equipamentos nas cozinhas. » Tratamento térmico dos alimentos cárneos. Salmonella Características » Bacilos gram-negativos. » Anaeróbios facultativos. » Não produtores de esporos.Maioria são flagelados. » Ph ótimo para a multiplicação fica em torno de 7. 52 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS » Temperatura ideal de crescimento é entre 35°C e 37ºC, sendo a mínima de 5°C e a máxima de 47°C. » Amplamente distribuídos na natureza, sendo o trato intestinal dos homens e animais o principal reservatório. Doença As salmoneloses caracterizam-se por sintomas que incluem: febre, diarreia, dores abdominais e vômitos. O período de incubação é de 12 a 36 horas. As salmoneloses estão divididas em 3 grupos: » Febre tifoide – causada pela S. tiphy. Só acomete o homem e os sintomas são bastante graves e incluem: septicemia, febre alta, diarreia e vômitos. A infecção inicia-se com a penetração nas células epiteliais do intestino, invasão da lâmina própria e entrada na corrente linfática. Os micro-organismos são fagocitados pelos macrófagos e ali multiplicam-se até os destruírem, com liberação de inúmeras bactérias na corrente circulatória, podendo, assim, atingir diversos órgãos. » Febre entérica – causada pela S. paratiphy. É semelhante à febre tifoide, porém com sintomas mais brandos. Geralmente, ocorre septicemia, febre, vômitos e diarreia. » Enterocolite – causada pelas demais espécies. Ao contrário da febre tifoide e febre entérica, na enterocolite a penetração da Salmonella fica limitada à lâmina própria causando apenas infecção na mucosa intestinal. Alimentos associados Produtos lácteos (leite e queijos), ovos (pudim, gemada, maionese) e carnes (bovinas, suínas e principalmente de aves). Medidas de controle » Tratamento térmico adequado do alimento. » Tratamento dos efluentes e dos dejetos de origem animal. » Higiene do abate. » Pasteurização do leite. 53 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREADE ALIMENTOS │ UNIDADE II » Conservação e cocção em temperaturas corretas. » Tratamento dos animais enfermos. » Prescrição cuidadosa de antibióticos nos casos humanos (e animais), a fim de diminuir a ocorrência de cepas resistentes. A maionese industrial não tem sido envolvida com surtos alimentares. Por outro lado, a maionese caseira é bastante perigosa e tem sido envolvida em diversos surtos de salmonelose no Brasil. Você saberia explicar porque essa diferença ocorre? Você acha que é necessário higienizar os ovos antes da sua utilização? Por quê? Campylobacter jejuni Características » O gênero Campylobacter compreende inúmeras bactérias patogênicas para o homem, sendo a mais importante delas o Campylobacter jejuni, isolado com frequências de pessoas com quadros de gastroenterite. C. laridis e C. coli também representam este gênero. » Bacilos gram-negativos. » Um único flagelo. » Não produtores de esporos. » Requerem microaerofilia. » Crescem em temperatura entre 30°C e 47°C, sendo a temperatura ótima de 42°C. » É uma bactéria comensal do trato gastrointestinal de animais silvestres e domésticos, particularmente os utilizados para a alimentação do homem, como bovinos, caprinos, ovinos, suínos e, principalmente, aves. » Algumas cepas de C. jejuni são capazes de produzir toxinas, destacando-se a enterotoxina termo lábil e citotoxinas. 54 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Doença Pode manifesta-se de várias formas, sendo a enterocolite a mais comum. A doença caracteriza-se por causar diarreia acompanhada de febre baixa e dores abdominais. Em alguns casos pode ocorrer febre alta e fezes com sangue, leucócitos e muco. Afeta principalmente crianças. O período de incubação varia entre 2 a 5 dias. Alimentos associados Leite cru, carnes de aves (principalmente as comercializadas em pedaços) e de outros animais e de água não clorada. Medidas de controle » Rapidamente destruídos pelo calor, não sobrevivem aos processos térmicos utilizados em alimentos. » Não sobrevivem a pasteurização e ao aquecimento a 60°C por 10 minutos. » São altamente sensíveis ao congelamento e, rapidamente, inativados em temperatura de geladeira. Shigella Características » Bacilos gram-negativos. » Existem 4 espécies com sorotipos diferentes: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii e S. sonnei. » A temperatura ótima de crescimento é 37°C, crescendo entre 10°C e 40°C. Doença » A bactéria adere ao epitélio intestinal, invade o epitélio, se multiplica e produz a toxina shiga. » Shigella pode causar uma infecção fraca ou assintomática ou causar disenteria fulminante, com fezes muco-sanguinolentas. Nesses casos, pode levar a desidratação e até convulsão em crianças com menos de 4 anos. » O período de incubação é de 1 a 7 dias. 55 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II Alimentos associados A doença geralmente é disseminada de pessoa para pessoa, mas pode ocorrer pela ingestão de alimentos ou água contaminados. Medidas de controle » Relacionadas à boa higiene pessoal. » Educação dos manipuladores de alimento. Vibrio cholerae Características » Bacilos gram-negativos. » Anaeróbios facultativos. » Um único flagelo. » Sensíveis às temperaturas de cocção. » O cloreto de sódio estimula o desenvolvimento desse micro-organismo. » Encontram-se amplamente distribuídos na natureza. » No gênero Vibrio, estão agrupadas inúmeras bactérias patogênicas para o homem como V. parahemolyticus, V. vulnificus e V. cholerae (a mais importante delas). » O V. cholerae apresenta vários sorogrupos, contudo o O1 e o O139 são responsáveis por epidemias. Doença » Agente etiológico da cólera, sendo considerada a epidemia que atingiu maior extensão geográfica e teve mais longa duração. » V. cholerae penetra no organismo pela via oral e atinge o intestino delgado, onde produz uma exotoxina (toxina da cólera) que atua nas células da mucosa intestinal localizadas nas vilosidades. 56 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS » A presença da toxina da cólera altera o balanço de íons, levando a diarreia intensa. » As pessoas infectadas podem ser assintomáticas ou apresentar diarreia moderada ou diarreia aquosa e profusa. » Nos casos mais severos, pode ocorrer perda de mais de 1 litro de fezes por horas, levando a perda rápida de líquido, colapso circulatório e até morte. » O período de incubação varia de 6 horas a 5 dias. Alimentos associados Frutos do mar, sobretudo moluscos (ostras e mexilhões) e água contaminada com despejos. Medidas de controle » Não ingestão de águas sem tratamento prévio ou para higienizar frutas e vegetais que serão consumidos crus. » A água deve ser previamente fervida ou tratada com cloro antes de sua utilização. » Uso de luvas na manipulação de pescados. Consumir alimentos crus que não sejam devidamente lavados pode ser perigoso para a saúde devido aos micro-organismos nocivos e, por isso, a lavagem correta dos alimentos é muito importante e diminui drasticamente as chances de contaminação. Você acha que é seguro higienizar frutas e vegetais com água sanitária? Fungos Produtores de Micotoxinas Além da deterioração, muitos fungos podem produzir metabólitos secundários tóxicos quando estão se multiplicando nos alimentos. Esses metabólitos são chamados de micotoxinas e causam alterações biológicas prejudiciais para o homem, sendo muitos deles mutagênicos e carcinogênicos. A seguir, as micotoxinas serão estudadas por grupos. 57 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II Toxinas produzidas por Aspergillus spp. » Aflatoxinas: são as micotoxinas mais amplamente estudadas e são produzidas principalmente pelo A. flavus e A. parasiticus. Dentro deste grupo, são conhecidas as seguintes aflatoxinas: B1, B2, G1, G2 e M. A produção destas toxinas é favorecida na temperatura de 23°C a 26°C e em substratos ricos em carboidratos, gorduras e proteínas. São encontradas em amendoins, sementes de algodão, castanhas e grãos de outros cereais, como o milho. As aflatoxinas podem ter atividade tóxica aguda em diversos animais e pequenas quantidades podem causar danos hepáticos e hemorragias no trato gastrointestinal. Apresentam propriedades hepatocarcinogênicas. O emprego do calor na forma que se utiliza no processamento de alimentos não a inativa completamente. » Ocratoxinas: são produzidas principalmente por A. alutaceus, sendo ocratoxina A e B as mais importantes. A. alutaceus é um contaminante de nozes, castanhas, grãos de cereais, frutas cítricas, algodão e pimenta- do-reino. Causa lesões hepáticas e renais em animais. » Esterigmatocistina: produzida por A. versicolor, A. nidulans e A. rugulosus. Sua ocorrência foi relatada em trigo, aveia e café. Apresenta propriedades hepatocarcinogênicas. Toxinas produzidas por Penicillium spp. » Rubratoxina: produzida por P. rubrum e está associada à produção de pigmentos vermelhos, principalmente em milho. Provoca doenças hemorrágicas em animais. » Patulina: produzida por P. expansum, P. claviforme e P. urticae. Sua produção ocorre principalmente em frutas em deterioração, pães mofados, linguiças e suco de maçã. Causa aberrações cromossomais em células de animais e é carcinogênica. » Citrinina: produzida por P. citrinum e P. viridicatum. Ocorre em arroz polido, pão mofado, presunto curado, trigo, aveia e centeio. Leva ao desenvolvimento de lesão renal. » Ácido penicílico: produzida por P. puberalum, acometendo principalmente o milho. Sua ação biológica é semelhante à patulina. 58 UNIDADE II │ MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS Toxinas produzidas por Fusarium spp. » Tricotecenos: são responsáveis por uma síndrome denominada AleuciaTóxica Alimentar (ATA), a qual causa a destruição da medula óssea. São produzidas principalmente no trigo, na cevada, na aveia, no centeio e no milho. Essas micotoxinas não são destruídas pelo aquecimento a 100°C. » Fumonisina: produzida principalmente pelo F. moniliforme. São presentes em milhos e outros grãos. Estão associadas a leucoencefalomalácia equina (LEME) e edema pulmonar em suínos (EPS). » Zearalenona: produzida principalmente por F. graminearum e está mais associada ao milho. Sua produção é favorecida por temperaturas alternadas e pelo excesso de umidade durante o armazenamento do grão. Apresenta propriedades estrogênicas. Toxinas produzidas por Claviceps spp. Espécies de Claviceps, como C. purpúrea e C. paspali, causam uma micotoxicose chamada ergotismo. O princípio ativo tóxico recebe o nome genérico de ergot. Duas formas de ergostimo são conhecidas: ergotismo gangrenoso, o qual resulta em gangrena nos pés e mãos; e ergotismo convulsivo que é uma ação neurotóxica. Os alimentos associados são: centeio, aveia, cevada e trigo. Vírus Os vírus são classificados de acordo com seu ácido nucleico: RNA ou DNA. Os vírus de interesse na área de alimentos são todos RNA, normalmente de fita simples e com estrutura icosaédrica. Os vírus podem ser transmitidos de um hospedeiro para outro e também através da água e dos alimentos. Entre as doenças virais causadas pela ingestão de água e alimentos, destacam-se: hepatite A, poliomielite e gastroenterites por rotavírus e vírus Norwalk. » Hepatite A: é transmitida pela via fecal-oral, sendo água e alimentos contaminados os principais veículos. Moluscos crus e saladas cruas têm sido a causa em diversos casos de hepatite A. Após ingerido, o vírus atinge a mucosa intestinal e chega até o fígado pela veia porta, causando lesões hepáticas. 59 MICRO-ORGANISMOS NA ÁREA DE ALIMENTOS │ UNIDADE II » Poliomielite: o vírus causador desta doença tem como hospedeiro natural o homem e seu habitat é o intestino, não causando nenhum dano quando há anticorpos. Sem a presença de anticorpos, esse vírus pode chegar ao sistema nervoso central e atingir as células da medula óssea destruindo-as. Água, verduras cruas, mariscos e principalmente leite cru eram as principais vias de transmissão. Hoje, devido aos avanços das vacinas, essa doença está praticamente erradicada. » Gastrenterites por rotavírus: os rotavírus causam alterações no fluxo de água e eletrólitos no nível de mucosa intestinal e interfere na reabsorção de fluidos intestinais, o que leva à diarreia. Crianças com idade inferior a 6 anos são as mais afetadas e os casos acontecem principalmente no inverno, por meio da ingestão de água e alimentos contaminados. » Gastrenterites por Vírus Norwalk: semelhante a gastrenterite causada pelo rotavírus, porém mais frequentes no verão. Água, vegetais crus e pescados são os veículos mais importantes. Os sintomas de um surto alimentar podem ter grande grau de variabilidade entre as pessoas que consumiram o alimento contaminado. O grau de intensidade dos sintomas pode ser desde pessoas assintomáticas até pessoas que chegam ao óbito. Você saberia responder por que algumas pessoas passam mal e outras não em um surto alimentar? 60 UNIDADE III CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Nessa unidade iremos entender como controlar o desenvolvimento microbiano nos alimentos visando eliminar os riscos à saúde do consumidor e evitar ou retardar as alterações indesejáveis do alimento. Além disso, vamos conhecer os micro-organismos indicadores de contaminação, as metodologias utilizadas em análises microbiológicas na área de alimentos e aprender sobre o sistema APPCC e como este pode influenciar na segurança e qualidade dos alimentos. CAPÍTULO 1 Controle do desenvolvimento microbiano nos alimentos O controle do desenvolvimento microbiano é muito importante na área da microbiologia dos alimentos, visto que contribui significativamente na eliminação de riscos à saúde além de prevenir ou retardar a decomposição dos alimentos. A conservação dos alimentos, do ponto de vista microbiano, envolve dois princípios básicos: » Preservação ou retardamento da decomposição microbiana: é realizado impedindo-se a entrada do micro-organismo nos alimentos, impedindo-se a multiplicação dos micro-organismos presentes ou pela destruição dos micro-organismos. » Prevenção de injúrias provocadas por insetos ou outros animais ou prevenção de causas mecânicas, as quais são importantes portas de entradas para os micro-organismos. 61 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III Existem diversas maneiras para que o controle microbiano seja exercido. A seguir vamos estudar cada uma delas. Controle dos micro-organismos por remoção Lavagem, centrifugação e filtração são processos empregados no alimento para diminuir a carga microbiana pela remoção de micro-organismos. A lavagem é bastante utilizada no preparo de carcaças de animais, frutas e muito vegetais. A centrifugação é aplicada principalmente no tratamento de água. A filtração é mais eficiente que a lavagem e centrifugação, conseguindo remover totalmente os micro-organismos, porém, seu uso é limitado a líquidos. Um sistema de vácuo é criado para que ocorra a passagem do líquido através de um filtro previamente esterilizado com poros pequenos o suficiente para reter os micro-organismos. A filtração é aplicada para sucos de frutas, cerveja, refrigerantes, água e vinho. Esses métodos são geralmente aplicados como etapa auxiliar no processamento dos alimentos. Controle dos micro-organismos por manutenção em condições desfavoráveis Embalagens com atmosfera modificada são utilizadas para modificar o meio gasoso em que o alimento se encontra e, desta forma, prolongar a vida de prateleira do produto. Alimentos embalados a vácuo ou aquelas embalagens em que o espaço livre seja substituído por CO2 ou NO2 são exemplos deste tipo de controle. Essas embalagens apresentam condições anaeróbicas impedindo o desenvolvimento de micro-organismos aeróbicos. Conservação pelo emprego de altas temperaturas A temperatura elevada é um dos métodos mais utilizados para a destruição de micro-organismos. O calor aparentemente mata os micro-organismos pela desnaturação de suas enzimas, que resulta em mudanças na forma tridimensional dessas proteínas, inativando-as. O tratamento térmico necessário varia com o tipo de micro-organismo e o local onde ele se encontra, e pode ser aplicado em condições úmidas ou secas. Calor úmido: é mais eficiente e requer menos tempo que o calor seco porque causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais, enquanto o calor seco promove oxidação 62 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS dos constituintes orgânicos das células. O calor úmido pode ser na forma de vapor, água fervente ou água aquecida a temperaturas abaixo do seu ponto de ebulição. As células vegetativas são muito mais sensíveis ao calor que os esporos. Células vegetativas de bactérias são geralmente mortas dentro de 5 a 10 min. pelo calor úmido a 60-70°C, células de leveduras e outros fungos são normalmente destruídas entre 5 a 10 min. a 50-60°C, enquanto que seus esporos precisam de temperaturas ente 70-80°C. Calor seco: o calor seco ou ar quente mata por efeitos de oxidação. Esta técnica é menos eficiente que o calor úmido e, por isso, requer temperaturas mais elevadas e maior tempo de exposição. Geralmente, uma temperatura aproximada de 170°C, por duas horas, assegura a esterilização, enquanto a autoclave (a qual esteriliza por calor úmido – vapor) necessita de 121°C por 15 minutos. Alguns fatores podem afetar resistência térmica dos micro-organismos. São eles: » água: a resistência térmicadas células microbianas aumenta com a diminuição da umidade; » gordura: presença de gordura aumenta a resistência térmica; » sais: influenciam na resistência térmica de uma forma variável. O cloreto de sódio, em concentrações baixas, aumenta a resistência térmica de alguns esporos; enquanto que Ca2+ e Mg2+, ao aumentarem a atividade de água, diminuem a resistência térmica; » carboidratos: os açucares podem proteger alguns micro-organismos e esporos do calor por diminuir a atividade de água; » pH: o pH próximo da neutralidade aumenta a resistência térmica dos micro-organismos; » proteínas: a presença de proteínas apresenta um efeito protetor sobre os micro-organismos, assim, produtos com alto conteúdo proteico exigem tratamento térmico mais rigoroso; » número de micro-organismos: quanto maior o número de micro-organismos, mais calor será necessário para destruí-los; 63 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III » fase de crescimento: as células na fase estacionária tendem a ser mais termo resistentes que as células na fase logarítmica, assim como os esporos mais velhos também tendem a ser mais resistentes; » temperatura de crescimento: a resistência ao calor aumenta conforme aumenta a temperatura ótima de crescimento e a temperatura máxima de crescimento; » compostos inibitórios: a presença de inibidores microbianos diminui a resistência térmica dos micro-organismos, portanto, ao se adicionar conservantes químicos no alimento antes do tratamento térmico diminui a quantidade de calor necessária; » relação tempo/temperatura: o tempo necessário para combater as células e esporos diminui conforme o aumento da temperatura. Pasteurização ≠ esterilização Pasteurização: é um processo utilizado para destruir micro-organismos patogênicos ou redução dos micro-organismos deteriorantes. Esse processo é aplicado a alimentos ácidos e que são conservados sob refrigeração ou congelamento, assim não haverá condições de multiplicação dos micro-organismos que resistiram à pasteurização. A pasteurização do leite pode ser feita por diferentes combinações de temperatura e tempo, sendo as mais comumente usadas: 63°C/ 30 minutos (baixa temperatura/longo tempo) e 72°C/ 15 segundos (alta temperatura/ tempo curto). Esterilização: destrói todas as células viáveis que possam ser enumeradas por técnica apropriada de semeadura. Na área de alimentos, emprega-se o temo “esterilização comercial”. Para esterilização do leite, a temperatura utilizada é em torno de 150°C por poucos segundos, e o leite é denominado tipo longa vida. Esse processo é chamado UHT (do inglês “Ultra High Temperature”). Produtos esterilizados tem um prazo de validade mais longo, comparativamente aos produtos pasteurizados. A desvantagem de esterilizar é a redução da qualidade de alguns produtos. 64 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Conservação pelo emprego de baixas temperaturas A temperatura tem muita influência na atividade metabólica dos micro-organismos e, quanto menor for a temperatura, menor será a velocidade das reações bioquímicas ou atividade microbiana. Refrigeração: nas temperaturas de refrigeradores comuns (0 a 7°C), a taxa metabólica da maioria dos micro-organismos é muito reduzida e eles não podem se multiplicar ou sintetizar toxinas. Contudo, os micro-organismos psicotróficos ainda crescem em temperatura de refrigerador, podendo alterar o aspecto e sabor do alimento após algum tempo. A maioria das bactérias patogênicas não cresce em temperaturas de refrigerador, porém, algumas são capazes de se desenvolver ou produzir toxinas: Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Salmonella. Congelamento: o congelamento prolonga a vida de prateleira dos alimentos quando comparado à refrigeração. As temperaturas abaixo do congelamento obtidas rapidamente tendem a tornar os micro-organismos dormentes, mas não necessariamente os matam (embora isso também possa ocorrer). O congelamento lento é mais nocivo às bactérias porque os cristais de gelo que se formam e crescem rompem a estrutura celular e molecular bacteriana. O congelamento pode causar alguns efeitos que irá interferir sobre as células microbianas: redução da atividade de água, perda de gases como O2, alteração do pH, desnaturação das proteínas celulares, indução de choque térmico em alguns micro-organismos, danos metabólicos, entre outros. O descongelamento de alimentos tem preocupado os responsáveis por estabelecimentos alimentícios, devido aos riscos inerentes e à dificuldade de seguir os parâmetros legais. Você saberia responder se pode descongelar um alimento em temperatura ambiente, dentro d’água ou sob água corrente? Controle dos micro-organismos pela desidratação Baseia-se no princípio de que tanto os micro-organismos como suas enzimas necessitam de água para a sua atividade. Nesse método, há a diminuição do conteúdo de água até que ocorra a inibição dos micro-organismos deteriorantes e patogênicos. A desidratação pode ser: 65 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III Natural: exposição do produto ao sol e ao vento, porém, a temperatura do local deve ser elevada e o ar deve ser seco. Uva, coco, peixes e carnes (em algumas regiões) são exemplos de alimentos submetidos a esse método. Controlada: utilização de ar controlado a fim de reduzir o conteúdo de umidade. Existem vários sistemas de secagem, que são escolhidos conforme o alimento e custo do processo. Por exemplo: ar quente é utilizado para alimentos como vegetais; spry-drying útil para líquidos e semilíquidos; secagem a vácuo para sucos; e também a liofilização. Micro-organismos podem ser encontrados em alimentos desidratados, principalmente quando a matéria-prima não é de boa qualidade ou quando não são seguidas as boas práticas de produção. As bactérias necessitam de níveis elevados de umidade para sua multiplicação, portanto, elas dificilmente são responsáveis pela deterioração desse tipo de alimento, sendo os fungos os principais agentes deteriorantes nestes casos. Os bolores, principalmente do gênero Aspergillus, são os de maior importância. Conservação de alimentos pelo emprego de radiação O processo de aplicação de energia radiante em um determinado alimento é chamado de irradiação. As radiações de interesse na conservação de alimentos são: Raios Ultravioleta (luz UV): é um poderoso agente bactericida, no qual a célula é destruída devido a mutações letais no DNA. Tem baixo poder de penetração então sua ação é principalmente na superfície de alimentos. Partículas β: são elétrons emitidos por fontes radioativas e também apresentam baixo poder de penetração. Raios γ: são radiações eletromagnéticas emitidas pelo núcleo excitado de elementos radioativos. É a forma mais barata para aplicação em alimentos e apresenta excelente poder de penetração. Altas doses de radiação podem produzir reações secundárias causando efeitos indesejáveis em muitos alimentos, como alteração de cor, sabor e odor. As proteínas e os lipídios parecem ser sensíveis à irradiação. Já foi verificado alterações em alimentos como carnes, frutas e vegetais devido à irradiação. 66 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Conservação pela adição de NaCl ou açúcares O uso de NaCl na conservação de carnes vem de tempos remotos. Altas concentrações de sal desidratam o alimento e os micro-organismos, por aumentar a pressão osmótica ocasionando plasmólise. Além disso, também diminuem a atividade de água do alimento. Os açúcares agem de maneira semelhante, porém para obter o mesmo efeito a quantidade de açúcar deve ser 6 vezes maior que a de sal. O uso mais comum é na produção de conservas de frutas, balas,confeitos e leite condensado. As bactérias são mais sensíveis a concentrações altas de açucares que bolores e leveduras. Conservação de alimentos pelo emprego de agentes químicos Aditivos ou conservadores químicos são substâncias adicionadas ao alimento que impedem ou retardam as alterações provocadas por micro-organismos ou enzimas. Alguns destes conservadores têm também a propriedade de agir no controle de micro-organismos patogênicos. Um conservante não pode ser tóxico nas concentrações utilizadas, não pode ser carcinógeno, deve apresentar baixo custo, ser solúvel em água e não produzir características organolépticas indesejáveis. Os conservantes permitidos pela legislação brasileira podem ser agrupados da seguinte forma: Ácidos lipofílicos e derivados Os sais dos ácidos sórbico, benzoico e propiônico são mais utilizados que os ácidos, devido a questões de solubilidade, toxicidade e sabor. Em solução, o sal se transforma em ácido, o qual é a forma ativa. Ácido benzoico e benzoatos O benzoato de sódio é um conservador (conservante) químico bastante utilizado. Os benzoatos são utilizados em alimentos ácidos, pois apresentam melhor atividade em pH baixo. Por esse motivo, atuam melhor inibindo bolores e leveduras, porém são ativos também contra algumas bactérias. Em alguns alimentos, como suco de frutas, podem alterar o sabor. O limite máximo permitido pela legislação brasileira varia de 0,005 a 0,3g/100g ou 100ml, dependendo do alimento; 67 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III Ácido sórbico e sorbatos Os sorbatos de cálcio, sódio e potássio são geralmente ineficazes em pH>6,5. São muito ativos contra bolores e leveduras e eficientes contra um grande número de bactérias. Este grupo de conservadores não altera o aroma e sabor do produto. O sorbato age em sinergismo com o nitrito retardando a produção de toxina botulínica. O ácido ascórbico e seus sais podem ser adicionados em alimentos como coco ralado, bombons, leite de coco, massas frescas, molhos, néctares de frutas. Seu limite máximo permitido no país é de 0,01 a 0,02g/ 100g ou 100ml, conforme o alimento. Ácido propiônico e propionatos Esse ácido e seus sais são utilizados em produtos de panificação e confeitaria, picles e chocolates. Apresenta atividade principalmente contra bolores e nas concentrações utilizadas não é eficiente contra leveduras, o que torna esses conservadores ideais para produtos que se emprega fermento biológico. São mais ativos em alimentos de baixa acidez. Seu limite permitido no Brasil é na faixa de 0,2 a 0,4g/ 100g. Ésteres do Ácido Para-hidroxibenzóico São bastante conhecidos como parabenos e são mais utilizados em cosméticos e produtos farmacêuticos. São ativos contra bolores e leveduras e pouco eficientes para bactérias. Segundo a legislação brasileira, metil, etil e propilparabenos e seus sais sódicos são permitidos em picles em concentração até 0,1%. Nitratos e nitritos O nitrato de sódio (NaNO3) e o nitrito de sódio (NaNO2) são empregados em carnes, visto que apresentam propriedades que estabilizam a cor vermelha, inibem micro-organismos e também contribuem para as características organolépticas. O nitrato desaparece durante aquecimento e armazenamento e muitas bactérias o reduzem a nitrito. Apresenta melhor atividade me pH entre 4,5 e 5,5. O nitrito apresenta efeito contra Clostridium botulinum, mas em doses maiores que aquelas necessárias para o desenvolvimento da cor e sabor. O nitrito tem a desvantagem de reagir e formar nitrosaminas, que podem ser carcinogênicas. Pois este motivo, a combinação de nitrito com outros conservantes é bastante utilizada, a fim de reduzir seu nível no alimento. Entre as associações, verificou-se que 0,26% de sorbato com 40 ou 80 ppm de nitrito é eficiente para impedir a formação de toxina botulínica. 68 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS No Brasil, os nitritos podem ser adicionados em produtos cárneos curados no limite máximo de 0,02g/100g e o nitrato até 0,05g/100g. O nitrato também pode ser adicionado no leite na concentração de 0,01% sobre o peso do leite. Dióxido de enxofre e sulfitos Além da atividade antimicrobiana, também previne o escurecimento enzimático de alguns alimentos. É mais ativo contra bolores e leveduras, mas também apresenta atividade bacteriostática. Esses compostos são utilizados em frutas secas, sucos de frutas, vinhos, açúcar refinado, batatas fritas congeladas, camarões e lagostas, cervejas, entre outros alimentos. O limite permitido no país é entre 0,002 a 0,035/100 g de alimento. Nisina A nisina é uma bacteriocina, ou seja, uma proteína que tem atividade antimicrobiana. No Brasil, é bastante utilizada em queijos fundidos e em preparados à base de queijos, com o limite máximo de 12,5mg/Kg. A nisina tem a vantagem de não apresentar toxicidade, é produzida naturalmente por cepas de Lactococcus lactis, apresenta alta estabilidade, é destruída por enzimas digestivas e não altera as características organolépticas dos alimentos. Entretanto, ela tem um espectro de atividade pequeno, sendo ativa contra bactérias gram-positivas. Natamicina É um composto poliênico produzido por Streptomyces natalensis e tem ótima atividade contra bolores e leveduras, sendo ineficiente para bactérias. Apresenta como vantagem o baixo desenvolvimento de resistência. No Brasil, a natamicina pode ser adicionada na crosta de queijos no limite máximo de 2mg/100cm2. Os buffets de conservação quente utilizados em restaurantes devem conservar os alimentos em temperaturas de 60°C ou mais. Você acha que esses buffets são seguros, visto que existem micro-organismos que se desenvolvem acima de 60°C (termófilos)? 69 CAPÍTULO 2 Micro-organismos indicadores e análises microbiológicas em alimentos Indicadores microbiológicos Micro-organismos indicadores ou indicadores microbiológicos são úteis para avaliar as condições sanitárias de um alimento durante o processamento, a produção e o armazenamento. Esses micro-organismos podem ser grupos ou espécies e fornecem informações sobre a contaminação de origem fecal e a provável presença de micro-organismos patógenos e deteriorantes. Diversas características importantes devem estar presentes para que um micro-organismo ou grupo possa ser considerado como indicador: » Ter detecção rápida e fácil. » Ser facilmente distinguido dos outros membros que fazem parte da microbiota dos alimentos. » Não deve estar presente como contaminante natural do alimento. » Sempre deve estar presente quando o patógeno associado estiver. » Sua contagem deve ter correlação com a contagem do patógeno. » Deve apresentar necessidade e taxa de crescimento semelhante às do patógeno de interesse. » Ter uma taxa de morte parecida à taxa de morte do patógeno de interesse e, de preferência, apresentar sobrevivência um pouco superior à do patógeno. » Estar ausente nos alimentos que estão livres do patógeno ou estar presente em pequenas concentrações. » Não é necessário que todas essas características sejam observadas em um micro-organismo indicador, entretanto, a maioria delas deve estar presente. 70 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Indicadores de contaminação fecal e higiênico-sanitária do alimento Além das características anteriormente citadas, os indicadores de contaminação fecal e higiênico-sanitária devem apresentar também os seguintes requisitos: » Apresentar o trato intestinal do homem e animais como habitat exclusivo. » Apresentar-se em número muito elevado nas fezes. » Ter alta resistência ao ambiente extra enteral. » Para sua detecção e contagem, ter técnicas rápidas, simples e precisas. Coliformes totais São bactérias dafamília Enteribacteriaceae. Estas bactérias são bacilos gram-negativos, não formam esporos e fermentam lactose com produção de gás quando incubadas a 35-37°C por 48h. Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella são os gêneros que fazem parte deste grupo. Escherichia coli é o único micro-organismo desta categoria que tem como habitat primário o intestino do homem e de animais. Os demais, além de presentes nas fezes, também podem estar presentes nos vegetais e solo. Por esse motivo, a presença de coliformes totais no alimento não irá necessariamente indicar contaminação fecal. Coliformes fecais e Escherichia coli São os coliformes totais que têm a capacidade de continuar fermentando lactose com produção de gás na temperatura de 44-45,5°C. Nessas condições, cerca de 90% das culturas que crescem são E. coli, sendo que algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella mantém esta característica. Por E. coli ser a predominante, o crescimento a essa temperatura fornece, com maior segurança, informações sobre as condições higiênicas do produtos e melhor indicação de contaminação fecal. Enterococos São atualmente denominados Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. A utilização destes micro-organismos como indicadores de contaminação fecal apresenta restrições, visto que eles são também encontrados em ambientes diferentes do trato intestinal. Apesar disso, a presença deles em número elevado nos alimentos indica 71 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III práticas sanitárias inadequadas, exceto em alimentos fermentados por bactérias desse gênero. Indicadores gerais de contaminação do alimento São grupos de micro-organismos que podem causar deterioração do alimento quando presentes em números elevados. As contagens são feitas em placas com meios de cultura após serem inoculadas e incubadas quantidades conhecidas de alimento. Contagem de bactérias aeróbias mesófilas: » número elevado desses micro-organismos indica que o alimento é insalubre, mesmo que no alimento não estejam presentes patógenos e nem tenha alterações organolépticas. Isso ocorre porque as bactérias patogênicas de origem alimentar são mesófilas, portanto, alta contagem de micro-organismos mesófilos significa que houve condições para os patógenos multiplicarem-se. Quando a quantidade é maior que 106 UFC/g do alimento, já é possível observar alterações detectáveis no alimento. Contagem de bactérias psicrotróficas e termófilas: » dão informações sobre o grau de deterioração de alimentos refrigerados ou que foram tratados termicamente. Contagem de bactérias anaeróbias: » a presença desses micro-organismos indica que houve condições favoráveis para o desenvolvimento de patógenos anaeróbios, como Clostridium botulinum e Clostridium parfringens. Contagem de bolores e leveduras: » estão mais correlacionados a alimentos ácidos e com baixa atividade de água. A contagem é indicada para verificar deterioração de frutas, sucos de frutas, vegetais, cereais, queijos, alimentos desidratados e em conserva. A presença em alto número de bolores pode estar associada com a produção de micotoxinas, as quais podem causar danos à saúde pública. 72 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Métodos de análise em microbiologia dos alimentos A realização de análises microbiológicas em alimentos é de fundamental importância, visto que permite: » conhecer as condições de higiene em que esse alimento foi preparado; » saber os riscos que estes podem oferecer à saúde humana; » avaliar se o alimento terá o tempo de vida útil pretendido; » determinar o agente etiológico mais provável no caso de um episódio de toxinfecção alimentar; » verificar se os padrões e especificações microbiológicos estão sendo atendidos adequadamente. Análises microbiológicas de um alimento são utilizadas para investigar a presença ou ausência de micro-organismos nesse produto, quantificar os micro-organismos presentes e identificar e caracterizar as espécies microbianas. Atualmente, os métodos de análise são comumente divididos em métodos “convencionais” e métodos “rápidos”. Os métodos convencionais são chamados assim pois foram desenvolvidos há muitos anos e desde então são utilizados como métodos oficiais na maioria dos laboratórios brasileiros e também em outros países. Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 1970, devido à necessidade de diminuir o tempo necessário para a obtenção de resultados analíticos e melhorar a produtividade laboratorial. Esses métodos também visam à simplificação do trabalho e a redução de custos. Em alguns métodos, também é possível encontrar maior sensibilidade e especificidade que os métodos convencionais. Antes de estudar os métodos de análise é importante ressaltar dois pontos importantes realizados previamente aos métodos: amostragem e preparação da amostra para análise. Amostragem A obtenção correta da amostra é crucial para o sucesso da análise. Alguns cuidados devem ser tomados: » Primeiramente, para a obtenção da amostra para análise, deve-se ter cuidado para que ela seja representativa do produto como um todo. 73 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III » Produtos prontos para consumo devem ser coletados em suas embalagens originais fechadas com as devidas especificações que identifiquem o produto (número do lote, data de fabricação). » Quando é necessária a análise de embalagens abertas, estas devem ser acondicionadas adequadamente para evitar contaminações. » Produtos que estão acondicionados em embalagens grandes e de difícil transporte podem ser amostrados in loco, porém com devida assepsia e uso de utensílios esterilizados. » Amostras de alimentos perecíveis refrigerados devem ser mantido entre 0 e 4,4°C até o início da análise. » Alimentos congelados devem ser descongelados apenas no momento da análise. » De modo geral, as amostras devem ser analisadas até 36 h após sua obtenção. Preparação da amostra para análise Técnicas corretas de preparação da amostra para análise são indispensáveis. Alguns itens importantes para esta preparação: » Deve-se ter o cuidado da utilizar técnicas assépticas em todas as etapas. » A amostra deve ser sempre homogeneizada previamente. » A porção da amostra a ser analisada geralmente corresponde a 25g, 50g ou 100g (ou ml) do produto. » No caso de produtos sólidos ou semissólidos, essa porção deve ser homogeneizada com um diluente apropriado (na maioria dos casos utiliza-se o tampão Butterfield ou água peptonada a 0,1%; em alimentos ricos em gordura, é necessária a adição de agentes tensoativos) e feita preferencialmente em homogeneizadores de laboratório (evitando o aquecimento da amostra). O Homogeneizador Stomacher é o padrão mundial para homogeneização de amostras. Utilizado para esmagar, extrair, misturar, homogeneizar e preparar as amostras que serão analisadas, mantendo-as em suas condições originais, 74 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS evitando qualquer tipo de contaminação cruzada, pois nenhuma parte do equipamento entra em contato direto com a amostra, tornando, portanto, desnecessária a limpeza do equipamento entre os processos. Métodos convencionais de contagem de micro-organismos Contagem por plaqueamento É um método convencional que consiste no plaqueamento de alíquotas do alimento homogeneizado e sua diluição em meio de cultura sólidos. Estes meios são adequadamente selecionados conforme o micro-organismo a ser enumerado. O plaqueamento poder ser feito por semeadura em superfície (a semeadura é feita na superfície do meio de cultura previamente distribuído em placas de Petri estéreis) ou semeadura em profundidade (meiode cultura é adicionado após a transferência das alíquotas para as placas de Petri vazias). As placas são incubadas em temperatura e tempo adequados e, então, as colônias são contadas. A enumeração pode ser feita manualmente ou com auxílio de contadores automáticos. Esta metodologia é a mais utilizada nos laboratórios de análise de alimentos, pois diferentes grupos de micro-organismos podem ser contados de acordo com o meio de cultura e/ou condições de incubação (tempo, temperatura e atmosfera). A desvantagem é que esta técnica é bastante trabalhosa quando muitas diluições precisam ser analisadas ou quando o número de amostras é grande. A leitura dos resultados também pode ser difícil, cansativa e imprecisa. Determinação do número mais provável A técnica do número mais provável (ou técnica dos tubos múltiplos) é utilizada para estimar a contagem de alguns tipos de micro-organismos, como coliformes fecais, coliformes totais, E. coli e S. aureus. Na técnica do Número Mais Provável (NMP), o produto a ser analisado, após homogeneização, é submetido a, pelo menos, três diluições decimais seriadas. De cada uma dessas diluições, alíquotas iguais são transferidas para três ou para cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gás (tubo de Durhan). Todos os tubos são incubados e, em seguida, os positivos são identificados. No caso de coliformes ou E. coli, positividade significa turvação do meio com produção de gás. Para 75 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III S. aureus, a positividade é dada apenas pela turvação do meio de cultura e confirmação por plaqueamento em meio adequados. Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o número mais provável por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três ou para cinco tubos. O NMP é estimado de respostas em que resultados são relatados como positivos e negativo em uma ou mais diluições decimais da amostra. Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes fecais). Na estimativa do número de coliforme totais, coliformes fecais e E. coli em alimento pelas técnica do NMP, normalmente dois caldos de cultura são empregados. Essas determinações são feitas em quatro etapas: 1. Semeadura em caldo laurilsulfato triptose. 2. Semeadura dos tubos que deram positivos na 1a etapa em caldo bile lactose verde brilhante (determinação de coliformes totais) ou para caldo EC (determinação de coliformes fecais e E. coli). 3. Plaqueamento das culturas positivas em meio sólido para isolamento de colônias de E. coli. 4. Identificação das colônias pelos testes adequados. Este técnica é bastante antiga e muito utilizada até hoje, porém, seus resultados são bastante imprecisos permitindo apenas uma estimativa do número de micro-organismos presentes. Métodos alternativos Técnica de membrana filtrante Utilizada há bastante tempo para enumeração de coliformes totais, fecais e Escherichia coli em água, porém, seu uso em alimentos é mais recente. A mistura alimento-diluente é filtrada através de membranas filtrantes de acetato de celulose ou de nitrocelulose que tem porosidade suficiente (0,45µm) para retenção dos micro-organismos presentes nessa mistura. Em seguida, as membranas são transferidas para a superfície de placas contendo ágar ou cartões absorventes saturados com meio de cultura. Após o tempo de 76 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS incubação adequado para cada micro-organismo, faz-se a enumeração das colônias que surgiram na superfície das membranas. A técnica das membranas filtrantes apresenta as seguintes vantagens: » Remove os componentes do alimento que podem interferir no crescimento microbiano (sólidos em suspensão ou agentes antimicrobianos). » Micro-organismos presentes em pequeno número, por vezes não detectáveis em outras técnicas, podem ser “concentrados” pela filtração de volume maior da amostra. » As colônias são coradas para facilitar a visualização. Técnica de Epifluorescência Direta Técnica rápida de contagem de micro-organismos que não depende de seu cultivo. Os micro-organismos viáveis e não viáveis são enumerados por microscopia, sendo uma das técnicas que oferece resultados mais rapidamente. A amostra devidamente homogeneizada tratada com enzimas e tensoativos, se necessário, é filtrada através de uma membrana de policarbonato, que retém os micro-organismos. Essa membrana é então corada com fluorocromo nucleofílico (alaranjado de acridina) e observada em um microscópio de fluorescência. As células viáveis apresentam fluorescência laranja-avermelhado, enquanto células mortas têm fluorescência verde. A epifluorescência direta tem boa sensibilidade, resultante da concentração das células na superfície da membrana filtrante. Tem sido bastante usada em leite. Entretanto, essa técnica é muito cansativa e o custo elevado dos equipamentos torna seu uso limitado a grandes laboratórios. Técnica Fluorogênica Esta técnica é baseada na técnica do NMP para E. coli. O teste é baseado na adição de MUG (4-metil-umbeliferil-β-D-glicuronideo) ao caldo de cultura para detecção de E. coli. A enzima β-glicuronidase produzida pela grande maioria das cepas desse micro-organismo transforma o MUG em umbeliferona, fluorescente quando observado sob luz ultravioleta de onda longa. A observação do número de tubos turvos, com gás e fluorescentes após 24 ou 48h, permite o cálculo do NMP de E. coli por grama (ou ml) do produto. 77 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III Placas Petrifilm As placas Petrifilm são constituídas de cartões de papel revestidos de meio de cultura desidratado, corantes indicadores e agentes gelificantes hidrossolúveis. São comercializadas prontas para uso, isto é, basta inocular 1 ml da amostra adequadamente diluída e incubar. A água contida no inóculo reconstitui o meio de cultura desidratado e solubiliza os agentes gelificantes. Após 1 minuto, o meio gelifica e as placas podem ser incubadas. A contagem de colônias é feita visualmente na própria placa, a qual é quadriculada para facilitar a contagem. As colônias apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo micro-organismo passa de incolor para vermelho. A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumeração de: bactérias aeróbias totais, coliformes totais e fecais, E. coli, enterobactérias, leveduras e bolores e ainda bactérias láticas. Impedância/condutância São baseadas na propriedade que os micro-organismos têm de alterar a transmissão da corrente elétrica por meio um meio de cultura. Essas alterações ocorrem como consequência da mudança da composição química desse meio devido à atividade metabólica dos micro-organismos presentes. Durante a multiplicação microbiana, moléculas grandes (proteínas, lipídeos, carboidratos) são transformadas em moléculas menores (aminoácidos, ácidos graxos, ácidos orgânicos), quimicamente mais ativas. A formação e o acúmulo desses metabólitos finais resultam em alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio, medidas por equipamentos qualificados. Bioluminescência Esta técnica está baseada no princípio de que a quantidade de Adenosina Trifosfato (ATP) presente em um sistema está relacionada ao numero de células metabolicamente ativas, inclusive micro-organismos. Uma das formas mais simples de se medir a quantidade de ATP é pelo sistema luciferina-luciferase, inicialmente obtido da cauda de vagalumes ou extraído de peixes e, mais recentemente, obtido por manipulação genética de micro-organismos.ATP reage com a enzima luciferase, na presença de luciferina e íons Mg++, formando um complexo que, em contato com o oxigênio, sofre uma descarboxilação, com emissão simultânea de luz. A luz emitida pode ser medida em luminômetro, um fluorímetro ou em um espectrofotômetro de cintilação líquida. Esta técnica é bastante conveniente no monitoramento de programas de APPCC (análise de perigos e pontos críticos de controle). 78 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Métodos bioquímicos São baseados na avaliação da capacidade dos micro-organismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados metabólitos. Existem, no mercado, diversos “kits”, na maioria miniaturizados, onde os testes são executados com pequenos volumes de meio de cultura. Os meios de cultura podem se encontrar na forma desidratada ou liofilizada, em alguns “kits” os meios estão impregnados em tiras ou discos de papel e em outros os meios estão pronto para uso. Após a incubação, faz-se a leitura dos resultados, normalmente por meio deuma combinação de números obtida de acordo com o resultado de cada um dos testes que faz parte do sistema. A interpretação pode ser feita através do uso de um manual que acompanha cada um dos sistemas ou através de um método computadorizado. Em alguns sistemas, o número de testes bioquímicos para um único micro-organismo é grande, o que permite a obtenção de resultados mais corretos e preciso. Métodos Imunológicos Esses métodos apresentam grande sensibilidade e elevada especificidade e, em função disso, vêm sendo empregados cada vez mais em microbiologia de alimentos. São baseados em reações específicas entre antígenos e anticorpos, os quais podem ser poli ou monoclonais. As técnicas imunológicas mais utilizadas em microbiologia dos alimentos são divididas em cinco grupos. Os principais métodos imunológicos são: » Ensaios imunoenzimáticos. » Imunocaptura. » Imunoimobilização. » Coaglutinação. » Imunofluorescência. Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) É uma técnica muito utilizada em microbiologia para amplificação do material genético de micro-organismos. Com essa técnic,a é possível multiplicar um único fragmento de DNA para milhares de cópias em poucas horas. A multiplicação é exponencial e se da por meio de uma enzima (DNA polimerase). Cada ciclo envolve 3 passos: desnaturação do DNA e separação em fita simples, ligação de oligonucleotídeos iniciadores e 79 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III polimerização com formação de fita complementar. Normalmente, são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação. O resultado é analisado por uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizada com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. 80 CAPÍTULO 3 Sistema APPCC e a Segurança dos Alimentos A qualidade dos alimentos é o conjunto dos atributos sensoriais que são imediatamente percebidos pelos sentidos humanos (aparência, textura, sabor e aroma), pelos os atributos ocultos como a segurança (controle de contaminantes físicos, químicos e microbiológicos), pela quantidade de nutrientes, constituintes químicos e propriedades funcionais. A ausência de micro-organismos infecciosos está entre as principais qualidades que se deseja alcançar na produção de um alimento. Entretanto, mesmo com a aplicação das BPF (boas práticas de fabricação), talvez isso não seja possível. Em vista disso, objetiva-se a produção de alimentos com o mínimo possível de micro-organismos. A garantia da inocuidade dos alimentos foi conseguida com a adoção do sistema APPCC (análise de perigos e pontos críticos de controle) conhecido internacionalmente pela sigla em inglês HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), o qual foi desenvolvido pela Pillsbury Company a partir de necessidades da NASA em garantir segurança aos alimentos fornecidos nas primeiras viagens tripuladas ao espaço. Hoje, o sistema APPCC é um método importante para garantir a segurança dos alimentos, desde a origem até a mesa do consumidor. O APPCC é um sistema planejado para que a produção de alimentos seja microbiologicamente segura, mediante a análise dos perigos e na busca de ações corretivas para os desvios identificados. Esse sistema enfatiza a qualidade de todos os ingredientes e de todas as etapas de processamento, desde a matéria-prima até o abuso por parte do consumidor. Como consequência, espera-se produzir um alimento seguro e, assim, minimizar a ocorrência dos surtos alimentares. Definições de termos Os seguintes termos e conceitos são úteis no desenvolvimento e na execução de um sistema APPCC: » Perigo: agente microbiológico, químico ou físico, presente no alimento, ou condição em que esse pode ocorrer, que possa causar um risco inaceitável à saúde do consumidor. 81 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III » Risco: probabilidade de um dado perigo ocorrer. » Ponto Crítico de Controlo (PCC): qualquer ponto, procedimento, operação ou etapa de um sistema alimentar em que deva haver um controle a fim de eliminar, prevenir ou minimizar um perigo. » Limite crítico: um ou mais limites de tolerância já estabelecidos que devam ser cumpridos para garantir que um PCC controle efetivamente um perigo microbiológico. É um valor/critério que diferencia a aceitabilidade ou a inaceitabilidade do processo. » Sistema de monitorização: conjunto de observações ou medições dos parâmetros de controle para produzir registros precisos que garantam a segurança do produto. » Não conformidade ou desvio: falha no cumprimento de um limite crítico. » Ações corretivas: ação ou procedimento a tomar quando ocorre um desvio do processo ou uma não conformidade. » Plano APPCC: documento escrito que aborda os procedimentos formais a serem seguidos, de modo a garantir o controle de um processo ou procedimento específico. » Sistema APPCC: resultado da implementação de um Plano APPCC. » Fluxograma: representação esquemática da sequência das etapas ou operações usadas na produção de um determinado produto. » Verificação: métodos, procedimentos ou testes, adicionais aos utilizados na monitorização, que permitem determinar a eficácia do sistema e se esse está de acordo com o plano. » Árvore de decisão: sequência de questões que permitem determinar se um ponto é crítico. » Validação: item de verificação que tem como objetivo a recolha e avaliação de informação técnica e científica necessária para garantir que o plano APPCC, quando devidamente implementado, controla os perigos de forma efetiva. 82 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Desenvolvimento das etapas para elaboração e implantação do programa de APPCC O APPCC é implementado por meio de doze etapas (esquematizadas na figura 3) sequenciais compostas de cinco passos preliminares e os sete princípios do sistema, como descritos a seguir: Figura 3. Esquema das etapas do sistema APPCC. Fonte: adaptado de Melo e Landgraf (2008). 83 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III Passos preliminares » Passo 1 – formação da equipe do sistema APPCC: a equipe deve ser multidisciplinar, com a responsabilidade de implementar e manter o sistema funcionando. O líder da equipe deve ter treinamento e habilidade suficiente para conduzir o sistema APPCC. » Passo 2 – descrição do produto: deve ser feita uma descrição completa e detalhada do produto, incluindo sua composição química e física, o tipo de embalagem, o transporte utilizado na distribuição, as condições de armazenagem e o tempo de vida útil,assim como outros aspectos que podem afetar a sua segurança. » Passo 3 – destinação do uso: deve-se identificar qual o público-alvo do produto. Alimentos potencialmente consumidos por pessoas que apresentem o sistema imunológico comprometido (idosos, bebês, portadores de doenças que afetam o sistema imunológico) devem receber especial atenção na implementação do sistema. » Passo 4 – elaboração do fluxograma: toda equipe de APPCC deve estar envolvida em preparar um fluxograma do processo de produção e informações sobre suas variáveis. Esse fluxograma deve ser bastante detalhado, com informações sobre especificações dos ingredientes, formulação do produto, etapas de processamento e sistema de embalagem. » Passo 5 – confirmação do fluxograma: esta etapa tem por objetivo confirmar se o que foi estabelecido no fluxograma corresponde à realidade observada. Assim, é necessário que a equipe APPCC acompanhe passo a passo o processamento do produto alvo. Os sete princípios do APPCC » Princípio 1 – análise de perigos e riscos associados a cada etapa do processo: é feito um levantamento de todos os possíveis perigos em cada uma das etapas levantadas no fluxograma, os quais devem ser identificados com base na experiência dos membros da equipe e nas informações de saúde pública sobre o produto. A análise de perigos mostrará se sua ocorrência e seu monitoramento merecem uma maior importância no plano de APPCC. 84 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS » Princípio 2 – Determinação dos Pontos Críticos de Controle (PCC): nesta etapa, deve-se identificar os pontos críticos de controle. PCC é definido como sendo uma operação na qual uma medida preventiva ou de controle pode ser tomada para eliminar, prevenir ou reduzir um perigo ou vários perigos. A identificação dos PCCs requer a aplicação da árvore de decisão (figura 4), a qual deve ser aplicada a todos os perigos identificados. Nesta etapa, é importante ressaltar que se existe um perigo em que o controle é necessário e não existe nenhuma medida possível de controle, há a necessidade de se mudar o produto ou modificar essa etapa para uma outra que se encontre medidas de controle. Os PCCs podem ser divididos em três categorias: » PCCe – é uma operação na qual os perigos são eliminados. Ex.: pasteurização e enlatamento. » PCCp – é uma operação na qual o perigo é prevenido, mas não eliminado. Ex.: congelamento. » PCCr – é uma operação na qual os perigos são reduzidos ou retardados, mas não eliminados ou evitados. Ex.: refrigeração de alimentos perecíveis. Devido a semelhança entre PCCq e PCCr, também é muito comum agrupá-los em uma única categoria. Dessa forma, muitos microbiologistas classificam os PCCs em PCC1 (no qual o perigo é eliminado) e PCC2 (no qual o perigo é preventivo ou reduzido). » Princípio 3 – estabelecimento dos limites críticos para cada PCC identificado: um limite crítico é um ou mais limites de tolerância, predefinidos, que devem ser seguidos para garantir que um PCC controle efetivamente um perigo microbiológico. Por exemplo, manter temperaturas de refrigeração dentro de uma faixa estreita e específica ou ter certeza de que uma temperatura mínima de destruição seja obtida e mantida por tempo suficiente para destruir os micro-organismos patogênicos. O estabelecimento desses limites deve estar baseado nos conhecimentos disponíveis em fontes como: legislação, literatura científica, dados de pesquisas reconhecidas, normas internas da empresa etc. » Princípio 4 – estabelecimento de um sistema de monitoramento de cada PCC: a monitorização permite detectar situações fora dos limites estabelecidos para cada PCC. Essa etapa é caracterizada pela definição de 85 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III quem é o responsável da monitoração, com que frequência é realizada, como é realizada (procedimentos, métodos) e o que é medido (substância teste). O sistema de monitoração deve permitir, quando possível, que os ajustes sejam feitos antes que uma medida exceda os limites críticos. Toda a monitoração é devidamente registrada para que se tenha um histórico de monitoração. » Princípio 5 – estabelecimento de ações corretivas: essa etapa estabelece ações corretivas a serem adotadas quando não conformidades em um PCC são monitoradas. São ações necessárias para que, em caso de desvio, o produto não siga inseguro para a etapa posterior, ou que seja retido antes do consumo. Nesta etapa, faz-se necessária a tomada de ações para que a etapa volte a estar controlada. » Princípio 6 – estabelecimento de procedimentos de verificação: estabelece procedimentos para verificar se o sistema APPCC está funcionando corretamente. Nesta etapa, deve ser verificado se o sistema APPCC está sendo adequadamente monitorado, pela avaliação dos registros, verificação da ocorrência de desvios e suas ações corretivas, entre outros. Também deve haver um estabelecimento de rotinas de inspeção, a qual deve ser sempre realizada por uma pessoa diferente da que controla. » Princípio 7 – estabelecimento de um sistema de documentação e registro: esse princípio estabelece sistemas efetivos de arquivamento de registros que documentam o plano APPCC. Esse deve ser arquivado na indústria de alimentos e disponível caso seja solicitado por auditores oficiais, para a comprovação de que o sistema está adequadamente funcionando. É importante salientar que, para a implantação do sistema APPCC, é necessário comprometimento da direção da empresa, esclarecendo os objetivos e fornecendo recursos humanos e materiais para tornar este programa possível. Além disso, é fundamental o papel do líder para auxiliar os empregados e demostrar a importância de cada passo durante o processo, fazendo com que a segurança do alimento seja a prioridade do operário. O grupo responsável pelo programa APPCC deve ser composto por pessoas de diferentes qualificações e formações. No grupo devem estar presentes aqueles que farão análise dos perigos, os que monitorarão os pontos críticos do controle, aqueles que serão responsáveis pelas supervisões das operações dos pontos críticos de controle, os que farão os testes laboratoriais e os que farão as verificações de monitoramento. 86 UNIDADE III │ CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS Uma característica importante do sistema APPCC é que ele é exclusivo, ou seja, deve ser desenvolvido para cada uma das linhas de processamento de cada empresa e não pode ser importado de outras indústrias. A implantação desse sistema é relativamente simples, entretanto, seu planejamento exige tempo e seu custo de instalação pode ser alto. Contudo, este custo é rapidamente recuperado pelo aumento na produtividade, qualidade e menor índice de reclamações dos consumidores. Algumas limitações do sistema APPCC » É necessário a educação de manipuladores de alimentos não profissionais, especialmente em estabelecimentos que servem alimentos e em casas, onde o próprio consumidor manipula. » Além das indústrias, deve ser aceito também por inspetores de alimentos e pelo público. » Divergência sobre qual etapa é um PCC e qual a melhor forma de monitorá-la. » A adoção do sistema APPCC pela indústria pode causar uma falsa impressão de que o alimento é seguro e, por isso, não necessitaria de precauções usuais que acontecem entre a compra e o consumo. Figura 4. Árvore de decisão. Fonte: <http://www.esac.pt/noronha/manuais/manual_HACCP_AGRO%2044.pdf>. Acesso em: 20/3/2016. 87 CONSERVAÇÃO, SEGURANÇA E QUALIDADE DOS ALIMENTOS │ UNIDADE III O sistema APPCC é uma abordagem sistêmica em função de estabelecer relações entre as diversas etapas do processo produtivo. O sistema APPCC é proativo, pois antecipa a detecçãocontínua de não conformidades e a tomada de ações corretivas antes que o produto seja consumido de forma insegura pelo consumidor. O controle da qualidade no processamento de alimentos é realizado nas diversas etapas do processo, por meio dos programas de pré-requisitos (como Boas Práticas de Fabricação). O sistema APPCC apenas transforma alguns pontos de controle (PC) estabelecidos por meio das diretrizes das BPF em pontos críticos de controle (PCC) estabelecidos por meio da análise de perigos do processo utilizando a árvore decisória. A diferença entre os PC e os PCC é que esses últimos são pontos que se não controlados têm uma grande probabilidade de produzir alimentos inseguros para o consumidor. Para que o sistema APPCC possa ser adequadamente implantado, faz-se necessário que as não conformidades observadas tenham as devidas ações corretivas. Na produção de alimentos, além do sistema APPCC, existem outras ferramentas de gestão de segurança como: » Boas Práticas de Fabricação (BPF). » Boas Práticas (BP). » Procedimentos Operacionais Padronizados (POP). » Procedimentos Padrão de Higiene Operacionais (PPHO). » Normas ISO 9001 e 22000. » Análise de Riscos. 88 Referências ABADARÓ, A. C. L. Alimentos probióticos: aplicações como promotores da saúde Humana. Nutrir Gerais. Revista Digital de Nutrição, v. 2, Brasil: Minas Gerais , 2008. FORSYTHE, Stephen J. Microbiologia da segurança dos alimentos. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. FRANCO, Bernadette Dora Gombossy de Melo; LANDGRAF, Mariza. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. GAVA, Altanir Jaime; SILVA, Carlos Alberto Bento da; FRIAS, Jenifer Ribeiro Gava. Tecnologia de alimentos: princípios e aplicações. São Paulo: Nobel, 2009. JAY, James M. Microbiologia de alimentos. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. KOMATSU, T. R; BURITI, F. C. A.; SAAD, S. M. I. 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