Protocolo de Experimento de Microbiologia

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PROTOCOLO DE EXPERIMENTO DE AULAS PRÁTICAS 
 
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Oliveira, T. A. S. (2018) Protocolo de experimento de aulas práticas de microbiologia... 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MICROBIOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
ELABORADO POR: PROF. Dr. 
Thiago Alves Santos de Oliveira 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2018 
 
 
 
 
 
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SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA 
 
DESCRIÇÃO TEÓRICA 
 
 As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios 
gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utiliza-se uma variedade de 
bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem, portanto é essencial que as normas sejam 
seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais. (REIS, 2008). Segundo a OMS erros humanos, 
más técnicas e má utilização do equipamento estão na origem dos acidentes em laboratório e infecções 
relacionadas com o trabalho, assim é fundamental o atendimento a todos os requisitos de segurança, 
objetivando minimizar a ocorrência de acidentes. No Brasil as normas de trabalho em laboratórios 
são definidas pelo conselho nacional de biossegurança. Biossegurança é definida como sendo a 
condição de segurança alcançada por um conjunto de ações destinadas a prevenir, controlar, reduzir 
ou eliminar os riscos inerentes às atividades que possam comprometer a saúde humana, animal, 
vegetal e o ambiente. (BRASIL, 2006). A OMS faz referência aos perigos relativos de 
microrganismos infecciosos por grupos de risco (Grupos de Risco 1, 2, 3 e 4). Esta classificação só 
deve ser utilizada em trabalho laboratorial. No quadro a seguir estão descritos os grupos de risco. 
CLASSE DE RISCO 1 Baixo risco individual e baixo risco para a comunidade 
– organismo que não causa doença ao homem ou animal. 
Ex. microrganismos usados na produção de cerveja, 
vinho, pão e queijo. (Saccharomycescerevisiae, 
Lactobacillus casei, Penicilliumcamembertii, etc). 
CLASSE DE RISCO 2 Risco individual moderado, risco coletivo baixo - um 
agente patogênico que pode causar uma doença no 
homem ou no animal, mas que é improvável que 
constitua um perigo grave para o pessoal dos 
laboratórios, a comunidade, o gado ou o ambiente. A 
exposição a agentes infecciosos no laboratório pode 
causar uma infecção grave, mas existe um tratamento 
eficaz e medidas de prevenção e o risco de propagação 
de infecção é limitado. Ex. Clostridium tetani, 
Staphylococcus aureus. 
 
 
 
 
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CLASSE DE RISCO 3 Alto risco individual, baixo risco coletivo - Um agente 
patogênico que causa geralmente uma doença grave no 
homem ou no animal, mas que não se propaga 
habitualmente de uma pessoa a outra. Existe um 
tratamento eficaz, bem como medidas de prevenção. Ex. 
bactérias - Bacillusanthracis, Chlamydiapsittaci, 
Mycobacterium tuberculosis. Vírus – hepatite B e C, 
HIV, febre amarela, dengue. Parasitas – Trypanosoma 
cruzi. 
CLASSE DE RISCO 4 Alto risco individual e coletivo - Um agente patogênico 
que causa geralmente uma doença grave no homem ou 
no animal e que se pode transmitir facilmente de uma 
pessoa para outra, direta ou indiretamente. Nem sempre 
está disponível um tratamento eficaz ou medidas de 
prevenção. Ex. Vírus de febres hemorrágicas, Vírus 
Ebola. 
Quadro 1: Classificação de risco biológico dos microorganismos. 
De acordo com a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) as características físicas 
estruturais e de contenção de um laboratório estão de acordo com o tipo de microrganismo que será 
manipulado em suas dependências. O quadro abaixo mostra os equipamentos e instalações 
apropriadas para cada um dos laboratórios. 
NB-1 Neste caso, o laboratório não está separado das demais 
dependências do edifício. De um modo geral, o trabalho é 
conduzido em bancada. Os equipamentos de contenção 
específicos, como cabines de segurança biológica, não 
são exigidos. O pessoal de laboratório deverá ter 
treinamento específico nos procedimentos realizados no 
laboratório e deverão ser supervisionados por cientista 
com treinamento em microbiologia ou ciência correlata. 
É necessário o uso de jaleco. Seu uso é apropriado ao 
ensino básico e a pesquisa 
 
 
 
 
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NB-2 Neste caso, o pessoal de laboratório deve ter treinamento 
técnico específico no manejo de agentes patogênicos e 
devem ser supervisionados por cientistas competentes. O 
laboratório não está separado das demais dependências do 
edifício, porém, o acesso deve ser limitado durante os 
procedimentos operacionais. O trabalho é conduzido em 
bancada, e, em casos de procedimentos em que ocorra a 
produção de aerossóis, estes devem ser conduzidos em 
cabines de segurança biológica. É necessário o uso de 
roupas de proteção individual, como jaleco, máscara e 
óculos. É adequado aos procedimentos de pesquisa e 
diagnóstico de microrganismos em tecidos, como o 
sanguíneo, por exemplo 
NB-3 A equipe laboratorial deve possuir treinamento específico 
no manejo de agentes patogênicos e potencialmente letais. 
Devem ser supervisionados por cientistas que possuam 
vasta experiência com estes agentes. Todos os 
procedimentos que envolverem a manipulação de 
material infeccioso devem ser conduzidos dentro de 
cabines de segurança biológica ou outro sistema de 
contenção física. Os manipuladores devem usar roupas de 
proteção individual. O laboratório deve ter área de acesso 
específica, com ambientes selados ou fluxo de ar 
unidirecional. É aplicável para laboratórios clínicos, de 
diagnóstico e pesquisa. 
NB-4 Assim como no NB-3 a equipe laboratorial deve possuir 
treinamento específico no manejo de agentes patogênicos 
e potencialmente letais. Devem ser supervisionados por 
cientistas que possuam vasta experiência com estes 
agentes. O laboratório deve estar separado das demais 
dependências do edifício. Há um controle da entrada e 
saída de pessoas. É necessário mudar totalmente de roupa 
 
 
 
 
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e de sapatos antes de entrar e de sair do laboratório. Os 
manipuladores devem usar roupas especiais de proteção 
individual. O trabalho é dirigido em cabines de segurança 
biológica ou outro sistema de contenção física. Nas 
instalações do laboratório NB-4 é preciso manter pressão 
negativa do ar, ou seja, o sistema de ar é controlado. 
Quadro 2: Classificação dos laboratórios segundo o nível de biossegurança. 
OBJETIVO Apresentar aos estudantesr os EPIs e EPCs presentes em um laboratório didático de 
Microbiologia. Conhecer os princípios da Biossegurança e implantar normas de segurança no 
laboratório de Microbiologa. 
 
MATERIAIS 
 Equipamentos de proteção individual (EPIs); Equipamentos de proteção coletiva (EPCs). 
PROCEDIMENTO 
Apresentação dos EPIs utilizados no laboratório. Apresentação dos EPCs presentes no laboratório. 
São recomendações para o trabalho no laboratório de microbiologia: 
01. Toda amostra biológica deve ser considerada potencialmente contaminada; 
02. Não deixar seus pertences (bolsas, livros, celulares etc) sobre as bancadas onde os experimentos 
serão realizados. 
03. O uso do jaleco ouavental é obrigatório, em alguns casos também se devem usar luvas, touca e 
máscara. 
 04. Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos. 
05. Retirar todos os acessórios pessoais (brincos, anéis, relógios e pulseiras); 
06. No início de cada análise/aula, deve-se traçar um plano de trabalho considerando o tempo 
necessário para sua realização; 
 07. Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática. 
 08. Lavar as mãos e calçar luvas de procedimento, quando necessário, ao iniciar a análise/aula, lavar 
as mãos antes de sair do laboratório e sempre que for necessário; 
09. Sandálias e chinelos não devem ser utilizados no laboratório; 
10. Não comer, beber ou fumar no laboratório; 
 11. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material; 
 
 
 
 
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12. Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise/aula. Todas 
as etiquetas têm que ser auto-adesivas; 
13. Retirar o material da amostra para análise com materiais estéreis como pipetas, pinças, colheres, 
etc. Nunca utilizar as mãos; 
14. Manter canetas, dedos e outros longe da boca; 
15. No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção. O 
mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. Deve manter-se um registro 
escrito de tais acidentes; 
. Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho; 
 17. Avisar ao professor em caso de contaminação acidental; 
 18. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a bancada. 
19. Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso; 
20. Os cultivos após a leitura devem ser encaminhados para esterilização, portanto não os colocar na 
estufa ou despejar na pia; 
21. Colocar os materiais contaminados (pipetas, lâminas e etc.) em recipientes apropriados colocados 
na bancada; 
22. Seguir as normas de uso de aparelhos. O microscópio deve ser manuseado cuidadosamente e após 
o seu uso, desligá-lo, limpá-lo, e colocar a capa; 
23. Os tubos de ensaios e as placas de Petri estéreis, bem como aqueles com crescimento de 
microrganismos só poderão ser abertos nas proximidades da chama para evitar contaminação; 24. Ao 
acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis por perto; 
25. Não cheirar os meios de cultura inoculados; 
 26. Os tubos de ensaio e placas de Petri devem ser manuseados adequadamente. Os tampões de 
algodão, bem como as tampas das placas de Petri nunca podem ser colocados sobre a bancada; 
27. As alças de repicagem devem ser aquecidas ao rubro antes e depois de serem utilizadas. Porém, 
antes de tocar a cultura, deve-se esperar que a alça esfrie próximo à chama; 
28. A roupa de proteção laboratorial utilizada não deve ser guardada nos mesmos armários da roupa 
normal; 
29. Todos os recipientes devem estar claramente rotulados com indicação de: conteúdo, aviso de 
perigo, precauções especiais, data de recebimento e preparação, data de abertura para uso, data de 
vencimento, fabricante; 
 
 
 
 
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30. Nunca esquecer, ao término da aula, de limar a bancada, desligar e cobrir os equipamentos 
(microscópios etc), fechar o bico de Bunsen e a válvula de segurança e lavar as mãos antes de deixar 
o laboratório. 
 
QUESTÃO PARA DISCUSSÃO 
Em sua opinião, qual a importância das normas e instruções de segurança no laboratório de 
Microbiologia? 
 
 
 
 
 
 
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MICROSCOPIA 
 
DESCRIÇÃO TEÓRICA 
Microrganismos constituem um grupo de seres vivos de dimensões bastante variáveis de 
acordo com o grupo a que pertencem. Eles são muito pequenos, e são medidos em unidades que não 
são familiares em nossa vida diária. Assim, os microrganismos e seus componentes estruturais são 
medidos em micrômetros (1 µm = 0,000001 m (10-6 )) e nanômetros (1nm = 0,000000001m (10-9 
)). (VERMELHO et al, 2006; TORTORA; FUNKE; CASE, 2005) Levando-se em consideração que 
um ser humano que enxergue muito bem seja capaz de perceber, a olho nu, estruturas com diâmetro 
de 0,2 mm, chega-se a conclusão de que, para a observação dos microrganismos e seus detalhes, são 
necessários microscópios. Dependendo do tipo de análise, bactérias, protozoários e algas podem ser 
observados ao microscópio óptico ou de luz. Já para as partículas virais, o microscópio eletrônico é 
o único equipamento capaz de desvendar a sua estrutura. (VERMELHO et al, 2006). 
O termo microscópio é derivado do latim micro, que significa pequeno, e do grego skopos, 
olhar. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). Em 1674, o holandês Antonie Van Leeuwenhoek, 
munido de microscópio rudimentar dotado de uma única lente, com baixo poder de resolução polido 
por ele próprio, observou, pela primeira vez microrganismos, tais como algas, protozoários, leveduras 
e bactérias. (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987; MORETTI, 2009). Enquanto o microscópio 
óptico utiliza luz para observar espécimes, o microscópio eletrônico emprega um feixe de elétrons 
para produzir uma imagem ampliada. O microscópio óptico composto é o mais utilizado; é assim 
chamado por apresentar dois sistemas de lentes, através dos quais a imagem ampliada é obtida. 
O objeto normalmente está colocado sobre uma lâmina de vidro. A ocular é o sistema de lentes 
próximo ao olho do observador. Objetiva é o que fica montado no fim do tubo do microscópio. 
(SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987; TORTORA; FUNKE; CASE, 2005). 
 O microscópio óptico (Figura 1.) moderno tem uma série de lentes, e utiliza a luz visível como 
fonte de iluminação. A objetiva produz uma imagem real ampliada do objeto, a qual é ainda 
aumentada em escala muito maior pela ocular sendo a mesma captada pelo olho do observador. 
Porém, não é suficiente apenas ampliar uma imagem, é necessário também resolver (distinguir) 
pequenos detalhes de uma estrutura. Ou seja, o sistema óptico deve ter a capacidade de distinguir 
objetos separados por pequenas distâncias. Em microscopia, quanto mais curto o comprimento de 
onda luminosa usado no instrumento, maior a resolução. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005; 
 
 
 
 
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SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987; VERMELHO et al, 2006). Para que se tenha uma imagem 
clara e detalhada em um microscópio óptico composto, as amostras devem ter um alto contraste com 
a substância pela qual a luz passa, ou seja, o seu meio. Para tanto, devemos distinguir o índice de 
refração das amostras daquele do seu meio. 
 
Figura 1. Microscópio óptico composto 
 O índice de refração do meio intercalante é o espaço que a luz tem de percorrer 
depois que deixa o objeto até alcançar a lente objetiva. Quando uma lente seca é utilizada, o ar é o 
meio intercalante, mas quando se utiliza lentes de imersão em óleo, neste caso o índice de refração 
do óleo é mais elevado do que o ar; e tem o mesmo efeito que o aumento do diâmetro da objetiva. Se 
o óleo for usado em uma lente que não a de imersão, a imagem torna-se borrada, com baixa resolução. 
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2005; VERMELHO et al, 2006). 
 A microscopia óptica inclui: microscopialuminosa, microscopia de campo 
escuro, microscopia de fluorescência, microscopia de contraste de fase e microscopia ultravioleta. 
Porém, o microscópio óptico composto de campo claro (ou microscopia luminosa) é o mais utilizado 
para a observação de microrganismos. No entanto, a observação de material biológico exige a 
 
 
 
 
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utilização de métodos de coloração, pois a maioria dos microrganismos, quando observados em 
microscópio óptico parecem quase incolores. (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987; 
VERMELHO et al, 2006). 
OBJETIVOS 
Manusear adequadamente um microscópio óptico. 
 Aprender a focalizar lâminas contendo microrganismos no microscópio. 
Observar a morfologia dos microrganismos contidos nas lâminas. 
 MATERIAIS 
 Lâminas com microrganismos identificados como 01, 02 e 03; 
 Microscópio óptico composto; 
 Óleo de imersão; 
 Solução de limpeza para as lentes do microscópio. 
 Papel absorvente para limpeza das lentes 
 
QUESTÕES PARA DISCUSSÃO 
 
01. Qual é a finalidade do óleo na focalização em imersão? 
02. Como se calcula o aumento final do objeto após a focalização? 
 
 
 
 
 
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ESTUDOS DAS CARACTERÍSTICAS CULTURAIS DE BACTÉRIAS – COLORAÇÃO DE 
GRAM 
 
DESCRIÇÃO TEÓRICA 
 
Microscópio óptico, fato que dificulta a visualização e distinção de caracteres morfológicos 
daqueles. Assim faz-se necessário uma melhoria do contraste na microscopia, resultado este que pode 
ser obtido empregando-se algumas técnicas como a de coloração (MADIGAN et al., 2010; 
VERMELHO et al., 2006). Segundo TORTORA et al. (2005), coloração seria o ato de corar os micro-
organismos utilizandose de corantes que evidenciem determinadas estruturas. Os corantes, sais 
compostos por íons positivos e negativos, que de acordo com classe, um destes será colorido e 
denominado cromóforo. Em corantes básicos, como o cristal violeta, o azul de metileno, o verde de 
malaquita e a safranina; o cromóforo será o íon positivo, os quais apresentaram forte afinidade aos 
compostos celulares carregados negativamente, como ácidos nucléicos e polissacarídeos ácidos, bem 
como às estruturas da superfície celular. Já em corantes ácidos, como a eosina, a fucsina ácida e a 
nigrosina; o colorido são os íons negativos, o quais são repelidos pela superfície bacteriana carregada 
negativamente (na maioria das bactérias) gerando uma preparação de bactérias incolores contra um 
fundo corado, a coloração negativa (MADIGAN et al., 2010; TORTORA et al., 2005). Em 
microbiologia são mais comumente utilizados três tipos de coloração: simples, aplica apenas um tipo 
de corante; diferencial, são aplicados dois corantes que resultam em colorações distintas em diferentes 
tipos de bactérias; e a especial, empregada no intuito de destacar estruturas ou partes específicas dos 
micro-organismos, a exemplo dos endósporos e flagelos. As colorações são etapas importantes para 
isolar e identificar micro-organismos em amostras clínicas e ambientais, sendo entretanto necessários 
dados fisiológicos ou genéticos para uma identificação completa (VERMELHO et al., 2006; 
TORTORA et al., 2005). A técnica mais empregada para a análise de bactérias é a coloração de Gram, 
classificada como coloração diferencial. Este método de coloração de bactérias foi desenvolvido pelo 
médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884 e se baseia na capacidade 
das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma 
durante um tratamento com etanolacetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-
negativas não o fazem Dessa forma, a coloração de Gram, consiste em duas sequências de coloração, 
com diferentes corantes, possibilitando a visualização de dois grupos de bactérias, as Gram positivas 
 
 
 
 
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e as Gram-negativas, além da observação de sua morfologia e tamanho. (MADIGAN et al., 2010; 
TORTORA et al., 2010). 
A primeira etapa da coloração de Gram é o esfregaço bacteriano, seguido de fixação deste a lâmina 
microscópica, através de secagem ao ar ou próximo a chama, para que as partes do micro-organismo 
de interesse sejam preservadas. A seguir a lâmina com o esfregaço fixado é recoberta por um corante 
básico, como o cristal violeta, de coloração púrpura, impregnando as células, sendo esta a coloração 
primária. Após certo tempo, este corante deve ser lavado com água destilada. O esfregaço deve ser 
então recoberto com o mordente (composto químico que fixará o corante, tornará a combinação um 
composto insolúvel), como a solução de iodo (lugol), que deve ser utilizada nesta etapa. Antes da 
aplicação do próximo corante, deve-se utilizar um agente descorante (remove o púrpura das células 
de algumas espécies), como o álcool etílico a 95% ou até uma mistura de álcool etílico e acetona 
(95:5). Está solução é então lavada e por segue-se à coloração com o segundo corante básico 
(vermelho), que pode ser a safranina ou fucsina, após determinado período de tempo prossegue-se a 
lavagem e secagem cuidadosa com papel. Por fim a amostra estará pronta para observação ao 
microscópio (SANT’ANNA e CERQUEIRA, 2007; MADIGAN et al., 2010; TORTORA et al., 2005; 
VERMELHO et al., 2006). 
 As Gram-positivas retém a cor do primeiro corante (cristal violeta) e as bactérias Gram-
negativas, por conta de sua constituição celular, perdem a cor do primeiro corante, retendo a cor do 
segundo contra corante (fucsina ou safranina) (TORTORA et al., 2010). Diferenças estruturais nas 
paredes celulares dos diversos tipos de bactérias afetam a retenção ou a liberação dos corantes, 
provocando assim reações distintas à coloração de Gram. As espécies Gram-positivas apresentam 
uma espessa parede celular de peptideoglicano (dissacarídeos e aminoácidos), diferentemente das 
Gram-negativas, nas quais essa parede é mais compacta, sendo que este tipo de bactérias possuirá 
também uma camada de lipopolissacarídeo (lipídeos e polissacarídeos) na parede celular. O cristal 
violeta e o lugol tem a capacidade de penetrar facilmente nas células, formando uma combinação de 
cristal violeta e iodo (CV-I). O complexo CV-I é um composto maior que a molécula do cristal violeta 
que adentrou a célula, não sendo permitido por isso sua remoção pelo álcool da camada de 
peptideoglicano das células Gram-positivas. Logo, bactérias Gram-positivas irão reter a cor do 
corante cristal violeta. Nas Gram-negativas entretanto o processo de lavagem com álcool irá quebrar 
a camada externa de lipopolissacarídeo e remover o complexo CV-I através da fina camada de 
peptideoglicano. Assim, as Gram-negativas ficaram incolores e adquiriram a cor do contra corante, 
adicionado em seguida, safranina e se coram de rosa (TORTORA et al., 2010). A maioria dos cocos 
 
 
 
 
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(à exceção dos gêneros Neisseria e Veillonellaque, que são Gram-negativos) e os bacilos dos 
genêrosCorynebacterium, Listeria, Bacillus,Lactobacillus e Clostridium são Gram-positivos. Os 
demais bacilos e os víbrios são Gram-negativos (SANT’ANNA e CERQUEIRA, 2007). 
OBJETIVOS 
Preparar lâminas fixadas. Realizar a coloração de Gram para diferenciar as bactérias em dois grupos.Observar as formas, arranjos, cor, tamanho das células dos micro-organismos. MATERIAIS 
 Cultura de bactérias; 
 Água destilada;  
Fucsina ou safranina;  
 Cristal violeta;  
Lugol (solução de iodo); 
 Álcool 95%; 
 Lâminas; 
 Lamínulas; 
 Alça de repicagem; 
 Bico de Bunsen; 
 Papel absorvente; 
 Microscópio óptico; 
 Óleo de imersão; 
 Solução de limpeza para as lentes do microscópio; 
PROCEDIMENTOS Coloração Diferencial: Coloração de Gram: 
1. Prepare um esfregaço, transferindo assepticamente uma porção da cultura da bactéria em meio 
sólido para uma lâmina contendo uma gota d’água destilada. Utilizando a alça de repicagem faça 
movimentos circulares para formar uma suspensão na área central da lâmina; 
2. Fixe o esfregaço, deixando secar ao ar, próximo ao bico de Busen; ou passando rapidamente três 
vezes a lâmina sobre a chama e deixando-a esfriar; 
 3. Coloração de Gram: cubra o esfregaço com o corante cristal violeta por 1 min, em seguida, com o 
auxílio da pisseta, lave rápida e delicadamente com água destilada (ATENÇÃO PARA NÃO 
COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!); 
 4. Cubra o esfregaço com a solução lugol por 1 min, lave com água; Faculdade Maria Nilza. 
 
 
 
 
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5. Lave a lâmina com etanol 95 % rapidamente (até que não se desprenda mais corante do esfregaço); 
6. Lave o excesso de álcool com água; 
 7. Cubra o esfregaço com solução de fucsina, por 30 segundos; 
8. Lave a lâmina com água e deixe secar; 
9. Faça a observação ao microscópio do material (lembre-se das etapas de utilização do microscópio 
discutidas em aula anterior). 
QUESTÕES PARA DISCUSSÃO 
1- Explique quais as diferenças entre bactérias Gram-positiva e Gram-negativa. 
2- Como a coloração de Gram pode ser útil na prescrição de um tratamento com antibióticos? 
3- Cite alguns fatores que podem levar a erros e influenciar na coloração de Gram.Faça um desenho da 
visualização da lâmina ao microscópio, descrevendo a forma, arranjo e coloração dos micro-organismos 
observados. 
SANT’ANNA, R. de S.; CERQUEIRA, A. de M. F. Apostila de Aulas Práticas Bacteriologia Nutrição. 
Universidade Federal Fluminense, Instituto biomédico, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, 2007. 
 
 
 
 
 
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PREPARO DE MATERIAIS E VIDRARIAS PARA ESTERILIZAÇÃO 
 
DESCRIÇÃO TEÓRICA 
O estudo dos microrganismos é de grande importância, tanto acadêmica quanto prática. O 
entendimento de suas atividades em ambientes naturais é extremamente importante para a agricultura. 
Também, a compreensão dos mecanismos biológicos envolvidos nas doenças infecciosas é de vital 
importância para seu controle. Mas estudá-los em condições naturais é difícil e a maior parte do 
conhecimento provém de estudos laboratoriais com culturas puras de amostras isoladas (MORETTI, 
2009). Um laboratório de Microbiologia destina-se ao estudo de microrganismos, compreendendo 
entre outras atividades, seu isolamento, identificação, caracterização, quantificação e conservação. A 
este estudo aplicam-se “técnicas microbiológicas”, que envolvem uma série de operações e normas 
padronizadas, instalações e instrumental próprios (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987). 
Em meados da década de 1870 os cientistas do grupo de Koch e os do grupo Pasteur, desenvolveram 
as técnicas básicas de microbiologia, ainda hoje em uso, tais como, técnicas de esterilização de 
material e meios de cultura e o uso de agar para a solidificação de meios de cultura (MORETTI, 
2009). No estudo de microrganismos são imprescindíveis as seguintes operações: execução de 
preparações microscópicas, esterilização de vidrarias, preparo de meios de cultura e materiais 
diversos, técnicas de cultivo, isolamento e outros ensaios microbiológicos (SOARES; CASIMIRO; 
AGUIAR, 1987). 
Muitas são as tarefas importantes nas atividades de um laboratório de Microbiologia, tais como 
lavagem, secagem, preparo de vidraria, montagem e esterilização (SOARES, CASIMIRO; AGUIAR, 
1987). No dia a dia, são poucos ou nenhuns os materiais contaminados que precisam ser retirados do 
laboratório ou destruídos. A maior parte dos recipientes de vidro, instrumentos e roupa de laboratório 
são reutilizados ou reciclados. 
O princípio dominante é que todo o material infeccioso deve ser descontaminado, esterilizado em 
autoclave ou incinerado no laboratório (GENEBRA, 2009). 
 LAVAGEM DE VIDRARIAS 
As condições de higiene e limpeza devem sempre prevalecer e são de fundamental importância em 
um laboratório de Microbiologia. A lavagem do material em uso deve observar as seguintes etapas: 
(SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987). 
MATERIAL AINDA NÃO USADO: 
 Água com sabão; água corrente; água destilada. 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE EXPERIMENTO DE AULAS PRÁTICAS 
 
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Oliveira, T. A. S. (2018) Protocolo de experimento de aulas práticas de microbiologia... 
MATERIAL EM USO: - CONTAMINADO: 
Autoclavação; água com sabão; enxágue com água corrente; água destilada. – 
NÃO CONTAMINADO: semelhante ao anterior, sem necessidade de autoclavação (SOARES; 
CASIMIRO; AGUIAR, 1987). 
 SECAGEM A vidraria lavada deverá secar em estufa a cerca de 70°C e posteriormente, se for o 
caso, será preparada, montada e esterilizada convenientemente (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 
1987). 
 PREPARO E MONTAGEM DO MATERIAL DO LABORATÓRIO 
A montagem consiste na preparação do material para ser esterilizado e posteriormente usado nas 
atividades de laboratório. Pois, estes ficariam sem efeito se viessem a ser recontaminados pelos 
microrganismos do ar. É necessário, portanto, que o material a ser esterilizado, venha a ser protegido 
contra contaminação posterior. 
PIPETAS: Lavadas e secas, deve-se colocar preferencialmente um pequeno tufo de algodão a cerca 
de 2 cm da extremidade de aspiração da pipeta. Colocar em recipientes metálicos com a parte de 
aspirar para cima ou enroladas individualmente em papel. 
 PLACAS DE PETRI: A tampa funciona como um protetor do meio, dentro da placa, contra 
contaminação exterior. Devido ao fato das placas não serem fechadas hermeticamente, haverá 
eventual acesso de ar e microrganismos para o interior da placa, em caso de manuseio excessivo. 
Placas de Petri são esterilizadas em recipientes metálicos, sacos plásticos apropriados ou envolvidas 
em papel em grupos de 2,3 ou 4 unidades. 
TUBOS DE ENSAIO: Contendo meios de cultura, são geralmente tamponados com algodão não 
absorvente ou hidrófobo. Os tampões devem penetrar, aproximadamente 2 a 3 cm no interior dos 
tubos e permanecem bem ajustados, de modo a poder suportar o próprio peso, quando suspensos 
vazios. 
 FRASCOS ERLENMEYER: são usados para conter um volume maior de meio de cultura, são 
tamponados com algodão envolvido por gaze. As demais vidrarias são protegidas simplesmente 
colocando um papel cobrindo a parte interna e amarrando um barbante ou fita adesiva em volta 
(SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987). 
ESTERILIZAÇÃO 
 AUTOCLAVE: Equipamento que emprega o vapor d’água sob pressão. A esterilização em autoclave 
é mais eficaz quando os organismos entram em contato diretamente com o vapor ou estão contidos 
em um pequeno volume de solução aquosa. Sob essas condições, o vapor em uma pressão a cerca de 
 
 
 
 
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15psi (pressão por polegada quadrada), 121° C, matarátodos os organismos e seus endosporos em 
aproximadamente 15 minutos. O calor requer tempo extra para alcançar o centro de materiais. 
Recipientes grandes também necessitam de tempo extra: • Tubo de ensaio (18 X 150 mm), com 
volume de 10 mL, necessitam de 15 min para esterilização. 
• Frasco de Erlenmeyer (2000 mL), com volume de 1.500 mL, necessitam de 30 min para 
esterilização. 
A autoclave é utilizada para esterilizar meios de cultura, soluções e inúmeros outros itens que podem 
suportar altas temperaturas e pressões (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987; TORTORA; 
FUNKE; CASE, 2005). 
 Os materiais para a descontaminação na autoclave devem ser colocados em recipientes ou sacos 
plásticos apropriados e autocláveis (BRASÍLIA, 2009). 
ESTUFA OU FORNO PASTEUR: Esteriliza pelo vapor seco, através da oxidação das proteínas dos 
organismos. A temperatura e o tempo de exposição são de 170° C por 60 min. É utilizado para 
vidrarias como: Placas de Petri, tubos de ensaio tamponados, frascos, dentre outros. FILTRAÇÃO: é 
amplamente utilizada para a esterilização de soluções que contenham substâncias termolábeis. 
Bactérias e outros microrganismos maiores podem ser removidos de líquidos, passando-os através de 
filtros de celulose ou nitrocelulose com poros inferiores aos seus diâmetros, impedindo-lhes a 
passagem. É útil para esterilizar líquidos, como vacinas, por exemplo, que são destruídas pelo calor 
(SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987; TORTORA; FUNKE; CASE, 2006). 
OBJETIVOS 
Executar técnicas de preparo e montagem de material para esterilização. Caracterizar os diversos 
métodos de esterilização. 
MATERIAIS 
 Vidrarias (pipetas, placas de Petri, tubos de ensaio, frascos Erlenmeyer, béqueres) Papel Kraft ou 
Jornal; Barbante ou Fita Adesiva; Algodão hidrófobo; Gaze; Clipe para papel; Tesoura; Estilete; 
Marcador Permanente. 
METODOLOGIA 
PIPETAS 
1. Com o auxílio de um clipe aberto coloca-se um pequeno tufo de algodão a cerca de 2 cm da 
extremidade de aspiração da pipeta. 
 
 
 
 
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 2. As pipetas enroladas em papel para esterilização obedecem aos seguintes procedimentos: 2.1. 
Dobre o jornal formando tiras com 4 cm de espessura. Em seguida, obedecendo ao desenho das 
dobras, e com o auxílio de uma tesoura ou estilete recorte-as. 
 2.2. Depois de recortadas às tiras enrola-se a pipeta. 
2.3. Com o marcador permanente escreva no papel a quantidade de mL correspondente a pipeta 
enrolada. 
2.4. Depois de enroladas uma a uma, as pipetas são agrupadas e enroladas novamente. PLACAS DE 
PETRI 01. As placas de Petri quando esterilizadas envolvidas em papel (em grupos de 2, 3 ou 4) 
devem ser embrulhadas adequadamente. 
TUBO DE ENSAIO 
01. Os tubos de ensaio que não utilizam tampa de metal ou plástico, são geralmente tamponados com 
algodão hidrofóbico. 
 02. Utilize um tufo de algodão, enrole-o de maneira que permaneça bem firme, penetre cerca de 2 a 
3cm no interior do tubo para que permaneça bem ajustado de modo a suportar o próprio peso quando 
suspenso vazio. Externamente o tampão deve ter algodão suficiente para oferecer uma boa superfície 
de cobertura das bordas do tubo e para ser segurado com firmeza; 
 03. O tampão deve entrar e sair do tubo com facilidade 
FRASCOS ERLENMEYER 
01. Os frascos Erlenmeyer são tamponados por algodão envolvido por gaze. 
 02. Com a gaze envolva o algodão, que deve penetrar de 2 a 3 cm no interior do Erlenmeyer. 
Externamente o tampão deve ter algodão suficiente para oferecer uma boa superfície de cobertura das 
bordas do Erlenmeyer. 
03. Com um pedaço de barbante ou fita adesiva amarre o tampão. 
 04. Recorte as sobras do barbante e da gaze. 05. Para finalizar, recorte um pedaço da folha de jornal 
e envolva o tampão já no Erlenmeyer. 
BÉQUER 01. 
 O béquer, assim como as demais vidrarias, é protegido, simplesmente colocando um papel cobrindo 
a parte interna e amarrando um barbante em volta. 
QUESTÕES PARA DISCUSSÃO 
 01. Qual a importância do uso de algodão hidrofóbico nas preparações e montagens de vidrarias? 
02. Uma pipeta foi descartada com material contaminado. Descreva sucintamente s etapas pelas quais 
a pipeta deve passar até a sua reutilização como vidraria estéril. 
 
 
 
 
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MEIOS DE CULTURA: PREPARAÇÃO 
 
DESCRIÇÃO TEÓRICA 
 
O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto, são utilizad osdiversos 
meios de cultura diferentes. Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in 
vitro de microorganismos. A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as ricketsias, 
clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos intracelulares obrigatórios. Neste caso, estes 
microorganismos podem ser cultivados em culturas de células e ovos embrionados. 
Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de um 
determinado número de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e 
permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de 
semeadura. Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado) 
requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos são denominados 
técnicas assépticas. 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
Meios de Cultura 
Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas: 
 
 
 
 
 
 
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MATERIAL 
Para a atividade prática serão utilizados: 
- Meio de Cultura (NA) 
- Placa de Petri 
- Tubo 
- Agua Destilada 
 
METODOLOGIA 
Preparação do meio de cultura conforme o fabricante; 
 
 
 
 
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Verter meio em placa de Petri; 
Verter meio em tubo inclinado 
Verter meio em tubo em camada alta 
 
 
 
 
 
 
 
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SEMEADURA E CONTAGEM DE MICRORGANISMOS 
 
DESCRIÇÃO TEÓRICA 
 A escolha para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e 
a finalidade do cultivo, porém o isolamento, cultivo e identificação de microrganismos requerem 
técnicas adequadas de inoculação em meios de cultivo que proporcionem seu rápido crescimento, 
livre de contaminações (REIS, 2008; SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987). O estabelecimento 
de uma zona de esterilidade é garantido pela regulação do bico de Bunsen. É somente nesta zona, 
estéril, que os tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com material a ser inoculado, 
deverão ser abertos ou manipulados. Qualquer outro material deverá ser mantido nesta área, para ser 
preservada sua esterilidade. 
As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de Bunsen. As alças 
ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente antes e depois de 
qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo o seu comprimento, a partir de alguns 
centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro, mantendo-as na posição vertical à chama do bico deBunsen. Deixar esfriar nas proximidades da chama. (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987). É 
importante, também, flambar a boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios, imediatamente 
antes e depois da transferência. Nunca colocar tampas ou tampões de algodão dos tubos ou frascos 
sobre a bancada ou mesa de trabalho. Descartar pipetas usadas em recipientes contendo soluções 
detergentes ou desinfetantes. Dispor o material de trabalho em posição adequada à fácil manipulação, 
de preferência em posição vertical e em suportes e estantes apropriadas, sem risco de acidentes ou 
trocas. Identificar adequadamente o material de trabalho (SOARES; CASIMIRO; AGUIAR, 1987). 
Dentre as técnicas conhecidas para o cultivo de microrganismos pode-se destacar a técnica do 
esgotamento, que podem ser estrias em toda a placa, ou estrias em quadrantes. E, a técnicas das 
diluições em placas (VERMELHO et al, 2006). A técnica do esgotamento consiste em semear, com 
o auxílio de uma alça de inoculação, uma porção da suspensão de microrganismos, fazendo na 
superfície do meio uma seqüência de estrias não sobrepostas, que vão das bordas para o centro para 
o centro da placa. Já técnica das diluições em placa pode ser utilizada tanto para o isolamento como 
para a contagem de microrganismos (VERMELHO et al, 2006). Existem várias condições em que é 
conveniente quantificar a população microbiana de uma determinada amostra como, por exemplo, na 
 
 
 
 
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quantificação da população de microrganismos da água e alimentos, a fim de avaliar a qualidade 
microbiológica dos mesmos. 
Os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente o 
número de células presentes num determinado material ou superfície e por contagem do número de 
microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado, ou indiretamente, efetuando-se 
análises da turbidez, determinação do peso seco, concentração de substâncias químicas (proteínas, 
pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via metabólica, DNA, RNA). 
 Essa possibilidade permite que se avalie a quantidade de microrganismos na água, em alimentos, 
superfícies, ar ou até mesmo em culturas puras. O método de contagem padrão em placas é utilizado 
tanto para quantificação de grandes grupos microbianos (Ex: aeróbios mesófilos, aeróbios 
psicrotróficos, bolores e leveduras, enterococos, bactérias láticas), como para gêneros e espécies em 
particular. O princípio envolvido na contagem é baseado na premissa de que, quando ficada em um 
meio de cultura sólido adequado, cada célula microbiana presente na amostra irá formar uma colônia 
isolada, visível a olho nu. Desse modo ao se semear uma diluição de uma suspensão bacteriana, pode-
se determinar o número de bactérias viáveis na população original pela contagem do número de 
colônias que se desenvolvem após o período de incubação. 
Porém, como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, tétrades, cachos, 
cadeias, etc), não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de 
células. Essa correlação é feita entre o número de colônias e o número de “Unidades Formadoras de 
Colônias” (UFC), que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de 
certas espécies microbianas (SILVA et al, 2010). Para as várias técnicas de contagem de viáveis o 
material contendo bactérias ou outros microrganismos é diluído seriadamente e alíquotas de cada 
diluição são semeadas em placas com um meio adequado. Vários são os diluentes que podem ser 
utilizados: água peptonada, solução salina fisiológica, solução tampão fosfato, etc. 
OBJETIVO 
Treinar o discente na manipulação de meios de cultura em condições de assepsia; 
 Executar técnicas básicas de semeadura de microrganismos em meios de cultura; 
 Conhecer e executar técnica de contagem padrão de células viáveis. 
Técnicas de Semeadura 
As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um 
meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. 
Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, são utilizadas as 
 
 
 
 
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técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de 
materiais, meios e culturas. 
As técnicas de assepsia incluem: 
è fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e DEPOIS de 
qualquer trabalho. (1) 
trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da 
chama do bico de Bunsen. (2) 
è esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e 
DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. 
(3) 
è flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a 
contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo 
desejado será inoculado. (4) 
De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade 
da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação. 
A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente 
como repique. 
A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação: 
· Semeadura em meios sólidos 
 
 
 
 
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Semeadura em meios semi-sólidos 
 
Semeadura em meios líquidos 
 
 
 
 
 
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OBJETIVOS 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: è executar e determinar a finalidade das 
principais técnicas de semeadura de bactérias em diferentes meios (líquidos, semi-sólidos e sólidos), 
tanto em tubos quanto em placas; è caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada 
um; è identificar e executar as técnicas de assepsia em laboratório. 
MATERIAL 
 
Para a atividade prática serão utilizados: 
- Placa de Petri com Agar 
- Tubo com Agar inclinado 
- Placa de Petri estéril 
- Tubo com Agar semi-sólido 
- Tubo com Agar em camada alta 
- Cultura bacteriana em caldo e em Agar 
- Amostra de água em tubo (para a técnica do pour plate) 
- Pipetas estéreis 
- Alça e agulha bacteriológicas 
A partir de cultura em placa: 
- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia com auxílio de uma alça 
bacteriológica e transferir para o tubo com caldo, através do processo de difusão. 
 
A partir de cultura em caldo: 
- a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculações: 
1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com caldo, através da 
técnica de difusão. 
2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar 
inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou reta).PROTOCOLO DE EXPERIMENTO DE AULAS PRÁTICAS 
 
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Oliveira, T. A. S. (2018) Protocolo de experimento de aulas práticas de microbiologia... 
3. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para a placa com Agar, através da 
técnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias). 
4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar semi sólido, 
através da técnica de picada central. 
 
A partir da amostra de água: 
- com o auxílio de uma pipeta estéril, transferir 1 ml da amostra de água para uma placa estéril e 
adicionar o meio fundido, realizando a técnica do pour plate. 
 
 
 
 
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Oliveira, T. A. S. (2018) Protocolo de experimento de aulas práticas de microbiologia... 
 
Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. Observar e interpretar 
o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no isolamento de colônias (esgotamento em 
estrias). 
 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
 
1. Qual a diferença entre os meios “de enriquecimento” e “seletivo”? 
2. Qual a finalidade da técnica do “spread plate” ou técnica do espalhamento? 
3. Por que não devemos cruzar as estrias na técnica do esgotamento em estrias? 
4. Por que devem ser realizadas as técnicas assépticas? 
5. Por que utilizamos diferentes meios durante a análise de um determinado material (p.ex.: 
alimento)? 
6. Para uma cultura que esteja guardada há muito tempo (sob refrigeração), qual o tipo de meio 
devemos utilizar para retornar a utilizá-la numa atividade prática? 
7. Para determinar a presença de um microorganismo específico num material que esteja muito 
contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar? 
 
 
 
 
 
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BACTÉRIAS NO AMBIENTE 
 
INTRODUÇÃO 
A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes. A exposição de 
alimentos, sua manipulação e conservação incorretas, são fatores que levam à sua contaminação por 
microorganismos. Os microorganismos podem ter relação com o alimento de três formas: è 
adicionados intencionalmente: são aqueles que provocam alterações desejáveis nos alimentos, como 
os lactobacilos, que fermentam o leite, transformando-o em iogurte, queijo (etc). è deterioradores: 
durante o seu desenvolvimento, estes microorganismos causam mudanças desagradáveis nos 
alimentos, tornando-os impróprios para o consumo, como os coliformes, que deterioram alimentos 
como queijos frescais, leite (etc). è patogênicos: podem colonizar o alimento e representam um risco 
à saúde de quem ingerir este alimento (com o microorganismo ou com toxinas formadas por este), 
como Salmonella sp., Staphylococcus aureus e outros. 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
As bactérias estão presentes em todos os ambientes. Muitas vezes, sua presença não é 
prejudicial, como os microorganismos que colonizam a nossa pele e o nosso trato gastrintestinal. 
Algumas vezes esta presença é até benéfica, como a utilização de microorganismos na indústria de 
alimentos na produção de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem nunca ouviu falar 
em alimentos pré e pró bióticos? São alimentos que contém em sua composição microorganismos 
vivos que, quando no nosso organismo, causam reações benéficas (como auxiliar a regulação do 
trânsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa microbiota normal a exercer seu 
papel benéfico no nosso organismo (como a produção de vitamina K pelas bactérias do nosso trato 
gastrintestinal). Mas, nem sempre a relação alimento x microorganismos x homem é benéfica. 
 Diversos microorganismos têm a capacidade de nos causar doenças, até mesmo os 
microorganismos da nossa microbiota normal (em casos de redução da atividade imunológica, 
causando doenças oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos. 
É importante ressaltar que os alimentos por si só não são fontes de contaminação, mas podem veicular 
esta contaminação adquirida, podendo causar doenças. As principais fontes de contaminação são o 
solo e a água, as plantas, os utensílios utilizados na preparação do alimento (contaminação cruzada), 
 
 
 
 
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o trato gastrintestinal do homem e de animais, os próprios manipuladores de alimentos, a ração 
animal, a pele dos animais, e até o ar. 
A indústria de alimentos vem crescendo e a preocupação com a obtenção de alimentos com 
qualidade tanto do ponto de vista tecnológico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo, aceitável 
no mercado, etc.) quanto microbiológico (segurança alimentar) está cada vez mais desenvolvida. O 
nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulação, preparo e conservação 
inadequados estão freqüentemente associados a doenças (intoxicações ou infecções) microbianas. O 
manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que não contamine o alimento com 
técnicas e hábitos anti-higiênicos. 
É dever do nutricionista conhecer os riscos associados à precariedade no cuidado com os 
alimentos para melhor orientação e supervisão das atividades de qualquer UAN (Unidade de 
Alimentação e Nutrição), restaurante ou indústria, evitando a disseminação de doenças através dos 
alimentos. 
 
OBJETIVOS 
 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: è constatar a presença de bactérias no 
ambiente; è compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e manipulação 
de alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais ou por portadores 
de microorganismos patogênicos; è diferenciar fontes de contaminação e veículos de contaminação; 
comentar sobre o papel de bactérias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos. 
 
MATERIAL 
- 2 Placas de Petri com Agar 
- swab estéril 
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 
 Bactérias no ambiente: 
- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da área de segurança. Cada grupo deixará 
a placa em exposição por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos) 
- após o tempo de exposição, a placa deve ser tampada novamente. 
 
 
 
 
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Bactérias nas superfícies: 
- 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes 
- em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificação de bactérias em 
diversas superfícies, de acordo com o diagrama representado a seguir: 
Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 
Observar e interpretar o crescimento nos meios. 
 
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 
 
1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiológica dos alimentos? 
2. Por que é necessário tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou manipulam 
alimentos? 
3. O que é contaminação cruzada? 
4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminação? 
5. Quais são as principais fontes de contaminação dos alimentos? 
 
 
 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE EXPERIMENTO DE AULAS PRÁTICAS 
 
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Oliveira, T. A. S. (2018) Protocolo de experimento de aulas práticas de microbiologia... 
Controle Microbiano 
INTRODUÇÃO 
 
Como já vimos, as bactérias estão em quase todos os ambientes e superfícies, e não é desejável 
que muitos materiais se contaminem com elas, como os alimentos, os utensílios utilizados na suapreparação, medicamentos, e outros. Para tanto, podemos aplicar diversos métodos de controle 
microbiano. O crescimento microbiano é fortemente influenciado por fatores ambientais (fatores 
extrínsecos), quais sejam: temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente, composição gasosa 
do ambiente. 
O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a finalidade de reduzir 
a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicação de microorganismos existente em 
ambientes, utensílios, e superfícies vivas ou inanimadas. A conservação de alimentos envolve sempre 
o uso de uma ou mais técnicas empregadas 
no controle microbiano. 
 
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
 
Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu 
modo de ação, é importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos: 
è Desinfecção: redução do número de microorganismos em uma matéria inanimada (ambientes, 
superfícies, objetos, alimentos) 
è Sanitização: igual a desinfecção (termo utilizado na indústria de alimentos) 
è Esterilização: destruição total de microorganismos em um material 
è Anti-sepsia: redução do número de microorganismos em matéria viva (pele) 
è Assepsia: conjunto de técnicas e/ou medidas assépticas, que visam a não contaminação de algo 
(por exemplo, de alimentos durante o preparo) 
Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle microbiano, que 
pode ser feito através de agentes químicos ou físicos. 
 
Controle Microbiano por Agentes Físicos 
· Calor 
 
 
 
 
PROTOCOLO DE EXPERIMENTO DE AULAS PRÁTICAS 
 
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Oliveira, T. A. S. (2018) Protocolo de experimento de aulas práticas de microbiologia... 
Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor úmido. É o método mais empregado para 
destruição de microorganismos devido ao seu baixo custo de aplicação, fácil aplicação, eficácia e 
praticidade. 
 
O calor úmido é mais eficaz que o calor seco, pois a água é melhor condutora de calor quando comparada 
com o ar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Controle Microbiano por Agentes Químicos 
· Álcool Etílico 
É um dos métodos químicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo custo, relativa 
eficácia e fácil aplicação. Pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico. Possui maior atividade 
germicida quando hidratado (60 – 70%), pois nessa condição possui maior poder penetrante. O álcool 
absoluto possui poder bacteriostático, enquanto o álcool hidratado a 70% possui poder 
bactericida.São apontados diversos mecanismos de ação para o etanol: 
- ação detergente: solvente de lipídeos 
- ação desidratante: retira água das células 
- ação desnaturante: agindo sobre proteínas celulares 
Fenóis e Derivados 
O fenol é um desinfetante fraco, porém é utilizado como um desinfetante de referência para ser 
comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto é mais ativo que 
o fenol. 
Atua como desnaturantes de componentes protéicos 
Dentre os cresóis, o mais importante é a creolina, uma mistura de cresóis muito utilizada para pisos 
e sanitários. O hexaclorofeno é muito utilizado na antissepsia cirúrgica. 
· Halogênios 
Os principais halogênios utilizados no controle microbiano são o Cloro e o Iodo. 
è Cloro: É usado como desinfetante de águas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ação é dado pela 
reação: 
Cl2 + H2O → HCl + HClO 
O ácido hipocloroso é instável, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O2, que eliminará 
os microorganismos através de oxidação de componentes celulares. 
è Iodo: reage de forma irreversível com aminoácidos aromáticos de proteínas celulares 
(fenilalanina e tirosina), desnaturando-as. Devido à grande possibilidade de alergias, seu uso como 
anti-séptico na prática cirúrgica vem diminuindo, sendo substituído por clorexidine e 
 
 
 
 
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similares. 
· Detergentes catiônicos 
Alteram a permeabilidade da membrana. É mais ativo contra Gram negativos. 
Exemplo: compostos quaternários de amônio à cloreto de benzalcônio. 
· Sais de Metais Pesados 
Os metais pesados agem na inativação de enzimas, por sua alta afinidade por apoproteínas. Os 
principais metais pesados utilizados no controle microbiano são: 
è Mercúrio (Hg): já foi muito utilizado como anti-séptico, mas seu uso está decaindo devido ao risco 
de intoxicação por absorção cutânea. 
è Sulfato de Cobre (CuSO4): utilizado como desinfetante para águas de recreação 
è Nitrato de Prata (AgNO3): é um anti-séptico altamente eficiente contra gonococos, que causam 
oftalmia em recém-nascidos e gonorréia em adultos com vida sexual ativa. 
· Ácidos 
Tanto os ácidos orgânicos quanto os inorgânicos são muito utilizados na conservação de alimentos. 
São mais utilizados os ácidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior solubilidade. 
A atividade antimicrobiológica dos ácidos fracos é atribuída a sua forma não dissociada (HA), pois 
esta penetra através da membrana tornando-se ionizada após alcançar o interior da célula. A 
concentração intracelular destes ácidos orgânicos altera o funcionamento normal do gradiente 
envolvido no sistema de transporte da membrana celular. 
A concentração da forma não dissociada do conservante químico no alimento é determinada pelo pKa 
(pH n qual 50% da molécula está na forma dissociada) do ácido e do pH do meio, como mostra a 
fórmula a seguir: 
 
 
Álcalis 
Os principais álcalis utilizados são o NaOH, o KOH e o Ca(OH)2. O NaOH, principalmente, está 
presente nos sabões, conferindo-lhes relativa ação anti-séptica. 
 
 
 
 
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· Corantes básicos 
São mais eficiente contra Gram-positivos. 
Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno. 
· Redutores 
Reduzem compostos celulares, levando as células à morte. Aldeídos e derivados: formaldeído e 
formalina são utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas causam irritações cutâneas. 
· Oxidantes 
Oxidam componentes celulares levando à morte das células. São muito utilizados como desinfetantes. 
Exemplo: Ozônio, água oxigenada, permanganato de potássio, peróxido de zinco. Óxido de etileno 
(gás): é um agente alquilante, age inativando proteínas e ácidos nucléicos. À temperatura de 52°C o 
óxido de etileno passa do estado líquido para o gasoso. Seus vapores são utilizados para esterilização 
de materiais de borracha ou plástico. 
· Antimicrobianos 
Possuem ação seletiva contra microorganismos, ao contrário dos anteriores. São um 
método biológico de controle microbiano. Serão abordados num próximo assunto. 
 
OBJETIVOS 
 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: 
è conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiológico; 
è descrever os agentes físicos e químicos utilizados no controle microbiano; 
è entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilização, diferenciando calor úmido 
de calor seco 
è compreender as diferenças encontradas na ação dos diferentes métodos de anti-sepsia 
utilizados. 
 
MATERIAL 
 
- Culturas bacterianas- 2 Placas de Petri com Agar 
- Soluções anti-sépticas 
- Gaze estéril 
 
 
 
 
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- Tripé e tela de amianto 
- Recipiente com água em ebulição 
 
EXECUÇÃO DA PRÁTICA 
 
 Agentes Químicos 
- dividir uma placa de Petri com Agar em 4 quadrantes 
- semear os 4 quadrantes da seguinte forma: 
- 1º quadrante: um aluno encosta o dedo suavemente no Agar 
- 2º quadrante: outro aluno lava o dedo com água e sabão por 1 minuto, seca com gaze estéril e 
faz a impressão do dedo 
- 3º quadrante: outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool etílico a 
70%, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo 
- 4º quadrante: um outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool 
iodado, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo 
 
Agentes Físicos - calor 
- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espaço respectivo ao tempo 0 
- para os próximos espaços, colocar as culturas em banho-maria fervente até atingir o tempo 
especificado: 
- 5 minutos à reinocular 
- 10 minutos à reinocular 
- 20 minutos à reinocular 
 
 
 
 
 
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Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 
- Observar e interpretar o crescimento nos meios. 
Exercícios de fixação 
1. Qual a diferença entre anti-sepsia e assepsia? 
2. Qual o modo de ação do calor seco? E do calor úmido? Qual o mais eficaz? 
3. Qual é o tipo de calor mais utilizado para a indústria de alimentos? Por quê? 
4. Por que o álcool etílico utilizado como desinfetante e anti-séptico deve ser hidratado? 
5. Qual o mecanismo de ação dos ácidos utilizados na conservação de alimentos? 
6. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou estufas 
de esterilização, também possuem ação esterilizante? 
 
 
Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos – TSA 
(Antibiograma) 
Introdução 
O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da 
sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias apresentam um perfil de 
sensibilidade previsível e constante, no entanto muitas outras são altamente suscetíveis ao 
desenvolvimento ou aquisição de resistência a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso 
adequado e criterioso de antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de 
amostras bacterianas multirresistentes. 
 
 
 
 
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O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o esclarecimento 
objetivo do perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de drogas eficazes no tratamento. 
O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo 
infeccioso, mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na 
terapia não seja previsível como por exemplos: S. aureus, bacilos gram-negativos não 
fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactérias) etc. 
A seleção dos antimicrobianos para a realização dos antibiogramas de rotina deve seguir 
alguns princípios. Uma das estratégias adotadas é o reconhecimento que alguns agentes 
antimicrobianos podem ser agrupados em classes, baseando-se no seu espectro de atividade. 
Assim, um só representante de classe necessita ser testado, a não ser quando dentro de uma 
mesma classe de antimicrobianos não exista a possibilidade de equivalência. 
Fundamentação teórica 
Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é 
inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior àquela que o antimicrobiano 
atinge no sangue, caso contrário ela é considerada resistente. O meio termo (bactérias 
moderadamente resistentes) é dado por aquela cujo crescimento é inibido por concentrações 
intermediárias. Na interpretação dos resultados, consideramos as bactérias intermediariamente 
resistentes como resistentes. 
A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente. 
A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de 
difusão em placa com discos impregnados com as drogas. 
- Método de Diluição (MIC): No método de diluição, concentrações variadas do antibiótico, obtidas 
pela diluição em Caldo ou Agar, são inoculadas com o microrganismo. A concentração mais baixa 
do antibiótico que evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 horas é a concentração inibitória 
mínima, é a medida da sensibilidade. 
- Método da Difusão do Disco: Nos testes pelo método de difusão, discos de papel impregnados com 
o antibiótico são colocados uniformemente na superfície do Agar semeado com o microrganismo. 
Forma-se, então, um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco para o 
Agar com conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível ao determinado (os) 
antibiótico (os). 
Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os métodos de difusão com 
disco (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de diluição para os testes de rotina, mas é 
 
 
 
 
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indispensável que sejam, rigorosamente padronizados, pois a presença de algumas substâncias nos 
meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição. Para minimizar os riscos de resultados 
errôneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este é um meio 
padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar que o teste 
de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma coloração de Gram 
antes de qualquer TSA para a confirmação da pureza da cultura. 
A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona sem crescimento 
em volta dos discos de antibiótico). O tamanho do halo sozinho não é uma medida quantitativa da 
atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais potente seja o 
antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos produzidos por antibióticos 
não relacionados são falsos e não devem ser realizados. Deve-se interpretar a sensibilidade de acordo 
com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação aos dados da tabela de interpretação do 
antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica. 
Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ação na célula bacteriana: 
 
 
 
 
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Na escolha do antimicrobiano a ser utilizado, devem ser avaliados os seguintes critérios: toxicidade 
seletiva, bactericida, amplo espectro, não deve ser alergênico, não deve provocar efeitos colaterais e 
não devem ter microorganismos resistentes. 
É necessário que se observe o tempo mínimo para uso do agente antimicrobiano, para evitar a seleção 
de microrganismos resistentes. Graças ao uso descuidado de agentes antimicrobianos, a taxa de casos 
de microrganismos multirresistentes vem aumentando nos últimos anos. Um exemplo é o tratamento 
da tuberculose, que consistena administração de uma combinação de antibióticos (2 a 3) por um 
longo período (6 meses). O abandono precoce do tratamento acaba por selecionar cepas MDR (multi 
drug resistent). 
 
 
 
 
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Durante a execução da prática utilizaremos a Escala Mac Farland, que consiste num método de 
quantificação de microorganismos através de turbidez. A escala é preparada com ácido sulfúrico e 
cloreto de bário em diversas concentrações, que reagem formando cloreto de bário obtendo diversos 
graus de turbidez. A concentração aproximada de microorganismos é dada conforme a leitura de 
absorbância realizada, de acordo com a tabela a seguir. 
Geralmente utilizamos uma concentração de microrganismos equivalentes ao padrão 0,5 da escala 
MacFarland, ou seja, 1,5x108/ml. 
 
O discente deve conhecer bem a funcionalidade dos antibiogramas e dos antibióticos que são 
utilizados para o tratamento de infecções a partir do conhecimento à sensibilidade das bactérias aos 
mesmos, para então acompanhar a dieta do indivíduo, fazendo as devidas modificações necessárias 
devido as inúmeras interações fármaco-nutrientes e a biodisponibilidade dos fármacos, sem esquecer 
as possíveis deficiências de vitaminas e minerais que podem vir a acontecer devido as introdução de 
alguns antibióticos. 
Objetivos 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: è conceituar antibiograma (TSA) e 
identificar os grupos ou quadros clínicos nos quais o antibiograma é indicado; è diferenciar os 
métodos de diluição (CIM ou MIC) do método de difusão e descrever as etapas para a realização 
deste último; è compreender a influência de alguns fatores no diâmetro do halo e inibição; è ler e 
interpretar resultados possíveis de um antibiograma; è citar alguns grupos microbianos aonde o TSA 
deve ser feito através de outras técnicas. 
Material 
- Cultura bacteriana 
- Tubo com solução salina estéril 
- Swab estéril 
- Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland 
- Pipeta estéril 
- Placa de Agar Mueller-Hinton 
 
 
 
 
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- 4 discos de antibióticos diferentes 
- Pinça 
- Régua graduada 
Execução da prática 
- ajustar a densidade do inóculo acrescentando a cultura à solução salina até esta se igualar à 
turvação do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste é feito por turbidez, e não 
pela cor que o caldo se apresenta). 
 
 
- embeber o swab na suspensão bacteriana padronizada e inocular na placa de Mueller-Hinton de 
modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo menos 3 direções) 
 
 
aguardar um tempo para que o Agar absorva o inóculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o 
 
 
 
 
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auxílio de uma pinça estéril, colocar os discos de antibióticos sobre o Agar, pressionando 
levemente cada disco para que este fique aderido ao meio. Deixar entre eles e deles à borda da 
placa um espaço não inferior a 15 mm. 
 
 
 
 
Incubar 18-24 horas a 35o C. 
Medir com régua o diâmetro do halo de inibição, comparar com os dados da tabela e expressar 
seus resultados. 
 
Meios utilizados na prática 
 
 
Exercícios de fixação 
1. Qual a diferença entre os métodos de difusão e impregnação em discos? 
2. Por que o método de impregnação do antimicrobiano em discos é mais utilizada? 
 
 
 
 
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3. Qual a importância da inoculação ser realizada de modo correto, permitindo crescimento 
confluente? 
4. Podemos comparar os halos de inibição obtidos com antimicrobianos diferentes ou em 
diferentes concentrações? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Bibliografia 
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Brown, A. E. Benson Microbiological Applications – Laboratory Manual in General Microbiology. 
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Harley, J. P. Prescott, L. M. Laboratory Exercises in Microbiology. 5th Edition. The 
McGraw−HillCompanies, 2002. 
Morello, J. A.; Granato, P. A.; Mizer, H. E. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: 
Applications to Patient Care. 7th Edition. The McGraw−Hill Companies, 2003. 
Sant’Anna, R. de S.; Cerqueira, A. de M. F. Apostila de Aulas Práticas Bacteriologia Nutrição. 
Universidade Federal Fluminense, Instituto biomédico, Departamento de Microbiologia e 
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