Determinação de açúcar espectrofotometro

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DETERMINAÇÃO DE AÇÚCAR EM AMOSTRA DE ALIMENTOS UTILIZANDO O ESPECTROFOTÔMETRO
INTRODUÇÃO
A indústria alimentícia requer altos padrões de qualidade com o intuito de obter as propriedades desejadas nos produtos e a garantia da satisfação dos consumidores, visto a grande competitividade do mercado. A determinação da concentração de açúcares pode ser, em diversas situações, um indicador de características do produto final exposto para comercialização. As diversas necessidades de detecção de açúcares indicam a importância dos sensores em âmbitos dentro e fora de indústrias. Os açúcares influenciam diretamente no sabor e aroma final dos produtos, devido ao fato dos diferentes poderes de doçura. O conhecimento da composição dos açúcares em uma solução (tipo e concentração) possibilita determinar o melhor momento para o uso na produção de sucos, néctares e vinhos, dentre outros produtos alimentícios, e auxilia no controle de qualidade que é imposto pela legislação, que muitas vezes limita concentrações de sacarose, e também desmascara qualquer produto adulterado, que deveria originalmente conter somente açúcares naturalmente presentes, mas que talvez possa ter sofrido adição de sacarose e posteriormente ter sido rotulado como livre de adição deste açúcar (DORNEMANN, 2016).
O espectrofotômetro é um equipamento de técnica analítica que avalia a intensidade da luz transmitida através de uma amostra com a intensidade da luz absorvida em comprimentos de ondas por esta amostra, que contém um soluto que se deseja quantificar. O aparelho de espectrofotometria é composto por cinco partes essenciais: fonte de radiação, monocromador, compartimento para amostras, detector de sinal e processador de sinal, conforme mostra a Figura 1. A fonte de radiação é uma lâmpada que emite luz. O monocromador é um prisma que funciona como uma rede de difração, nos comprimentos de onda que compõem a luz emitida. É selecionado um comprimento de onda adequado aos componentes estudados. A solução, que está presente em uma cubeta no compartimento para amostras, recebe o feixe de luz monocromática. Uma fração do feixe de luz é absorvida e outra fração é refletida. O detector de sinal é uma célula fotoelétrica que detecta a redução da intensidade luminosa consequente da diferença entre absorção e reflexão. Este detector identifica a intensidade da luz para gerar um sinal elétrico de saída. Este sinal elétrico é amplificado e processado por um computador, que retorna o valor referente de absorbância, sendo este proporcional à concentração dos componentes absorventes que estão presentes na solução na cubeta (SKOOG, HOLLER E CROUCH, 2006).
Figura 1. Estrutura esquemática de um espectrofotômetro.
Fonte: Adaptado de GE Healthcare Life Sciences, 2013. 
O ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) é um composto amarelado em solução que pode ser reduzido por açúcares redutores a um composto nitroamino análogo, ácido 3-amino-5-nitrossalicílico, que possui coloração avermelhada, ao mesmo tempo em que os açúcares redutores são oxidados. Este composto, assim como o DNS, é aromático, mas absorve luz facilmente e, assim, é possível estabelecer uma relação direta entre a quantidade de açúcares redutores presente na solução com a medida colorimétrica realizada em espectrofotômetro (VASCONCELOS, PINTO, ARAGÃO, 2013).
Figura 2. Reação do DNS para determinação de açúcares utilizando ectrofotometria.
Fonte: VASCONCELOS et al., 2013.
MATERIAIS UTILIZADOS
Os materiais utilizados foram amostra de suco industrializado de laranja, tubo de ensaio, pipetas graduadas, pera de sucção, estante para tubo de ensaio, Becker, micropipeta, ponteira para micropipeta, balão volumétrico, banho-maria, espectrofotômetro, cubeta de quartzo.
PROCEDIMENTO
O procedimento empregado neste método, segue uma série de passos, como preparação da solução de DNS, preparação da solução mãe de glicose, preparar a curva padrão de glicose, calibrar o equipamento, fazer leitura em absorbância da curva padrão, da amostra e do branco, construir a curva padrão e determinar a concentração de açúcar da amostra.
3.1. Preparar a solução de DNS
Para preparo desta solução, foi preparado a solução A e B. Para a solução A, foi pesado 10 gramas de ácido 3,5 dinitrosalisílico e dissolvido em 200 mL de solução de 2M (2 mol/L, 80 gramas de NaOH para 1 litros de água) de hidróxido de sódio (NaOH), recém preparada. A solução B, foi pesado 300 gramas de tartarato duplo de sódio e potássio, dissolvidos em 500 mL de água destilada, sob aquecimento e agitação constante. Posteriormente adicionou a solução A na solução B, até completa dissolução do DNS. Após a solução esfriar, transferiu a mistura para um balão volumétrico de 1 L e aferiu volume com água destilada.
3.2. Solução mãe de glicose 
	Pesou 1 g de glicose anidra, onde foi transferida para um balão volumétrico de 100 mL, homogeneizou e aferiu o volume com água destilada.
	A partir da solução mãe de glicose (1g/L) foi preparado as soluções com concentrações variando de 0,1 a 0,9 g/L de glicose. Onde identificou 10 tubos de ensaio, com pipeta graduada adicionou a quantidade indicada de solução mãe de glicose e completando com água destilada para obter a concentração final, conforme mostra tabela abaixo. Sendo que o tubo 10, é considerado o branco, contendo 10 mL de água destilada.
Tabela 1. 
	Tubo
	Solução mãe de glicose (mL)
	Água destilada (mL)
	Concentração curva padrão (mg/mL)
	1
	1
	9
		0,1	
	2
	2
	8
	0,2
	3
	3
	7
	0,3
	4
	4
	6
	0,4
	5
	5
	5
	0,5
	6
	6
	4
	0,6
	7
	7
			3
	0,7
	8
	8
	2
	0,8
	9
	9
	1
	0,9
 Fonte: os autores, 2018.
3.3. Curva padrão
	O preparo das soluções para a construção da curva padrão se deu da seguinte forma, foram identificados 09 tubos de ensaios, para cada ponto da curva, foi pego com auxílio da micropipeta 0,5 mL de cada concentração da curva padrão, conforme Tabela 1 e transferida para um novo tubo de ensaio, identificado conforme sua concentração. Após foi trocada a ponteira da micropipeta e adicionado 0,5mL de solução DNS em cada tudo e homogeneizado. Em um balão volumétrico, com auxílio da pipeta graduada e da pera de sucção, foi adicionado 10 mL da amostra (suco de laranja) e aferido com 90 mL de água destilada, sendo homogeneizado em seguida. Em um novo tubo de ensaio, com a micropipeta foi adicionado 0,5 mL da amostra preparada, trocou-se a ponteira da micropipeta e acresceu 0,5 mL de DNS no tubo, identificando-o e homogeneizando. 
	Foi aquecido em banho-maria, em 100°C, por 15 minutos, passado este tempo, foi retirado para esfriar em banho frio. Posteriormente foi completado o volume de cada tubo com água destilada, sendo 4,5 mL por tubo, homogeneizado na sequência. Necessitou fazer uma nova diluição da amostra, onde foi pego com a micropipeta 0,5 mL do tubo correspondente da amostra, transferido para um novo tubo, acrescido de 4,5 mL de água destilada e homogeneizado, obtendo uma concentração de 1/20.
Imagem 1. Concentrações variadas de soluções e amostra para construção da curva padrão.
Fonte: os autores, 2018.
3.4. Calibração do aparelho
	Primeiramente o aparelho foi calibrado com o branco (água destilada), ajustado a 0% de Abs, onde foi transferido o líquido para a cubeta, para proceder a calibração. O aparelho de espectrofotômetro foi ajustado para realizar a leitura em Absorbância (Abs) a 540 nm.
	Após ser calibrado, decorreu a leitura de cada concentração. Para cada leitura era adicionado na solução do tubo na cubeta, realizada a leitura, conforme Tabela 2, devolvido a solução para o tubo, lavada a cubeta com água destilada, secada com papel macio, para então realizar nova leitura. 
Tabela 2. Leitura em Abs das concentrações das soluções
	Concentração da solução
	Absorbância 
	0,1
	0,033
	0,2
	0,093
	0,3
	0,135
	0,4
	0,215
	0,5
	0,277
	0,6
	0,333
	0,7
	0,391
	0,8
	0,448
	0,9
	0,567
	Amostra
	0,271
Fonte: os autores, 2018.3.5. Construção da Curva padrão
	Para a construção da curva padrão, foi utilizado o programa Microsoft Excel 2016, onde empregou-se a equação da reta (y= a.x +b). Esta equação permite a relação direta entre a Abs (y) e a concentração presente na amostra (x).
	Após a construção da curva padrão, analisa-se o coeficiente de correlação (r), para saber o quanto bem os valores da curva de calibração encaixam em uma reta. Os valores podem variar de 1,0 a -1,0. Sendo que de 0,90 < r < 0,95 indica uma correlação razoável, já de 0,95 < r < 0,99 indica uma boa correlação e r > 0,99 indica uma excelente correlação.
Gráfico 1. Curva padrão de açúcar redutor 
Fonte: os autores, 2018.
CÁLCULOS
A partir da equação da reta, calcular a concentração de açúcar redutor na amostra. Deve-se considerar nos cálculos as diluições efetuadas na amostra, multiplicando o resultado por esse fator.
y= 0,6523x – 0,0462
0,271 = 0,6523x – 0,0462
0,3172 = 0,6523x
x = 0,4862 x 20 (diluição)
AR = 9,725 g/mL
RESULTADO E DISCUSSÃO
Através da determinação do coeficiente de correlação (R2), que indica quão bem os valores da curva de calibração se encaixam numa reta, podemos analisar conforme o Gráfico 1, que o valor de R2 foi de 0,9921, representando uma excelente correlação. Para a construção da curva, optou-se por excluir o ponto de concentração 0,8 e 0,9 mg/L, a fim de obter uma correlação melhor.
Para a amostra utilizada, podemos observar que a concentração de açúcares redutores foi de 9,72 g/mL. Em comparação com a rotulagem do produto, a tabela nutricional informa que em uma porção de 240 ml, contém 25g de açúcares. Porém o resultado encontrado foi superior as informações contidas na rotulagem. Já a legislação permite uma quantidade máxima de açúcares totais de 13g/100g, ficando bem acima da recomendação da legislação. (BRASIL, 2016). Vale considerar que a legislação brasileira não estabelece os métodos de análise para avaliar os requisitos de qualidade dos sucos, limitando-se tão somente a citar alguns métodos de análise nas referências. 
Se tratando da laranja, segundo Hendrix e Redd (1995), a árvore que dá origem a fruta é asiática, com um porte médio e atingindo oito metros de altura aproximadamente. Conforme Chen et al. (1993), seu fruto tem coloração e formato que pode mudar conforme cada variedade. Normalmente a casca pode ser de cor amarelada, envolvendo uma polpa aquosa com coloração variando entre vermelho e amarelo claro.
Seu fruto dentre outras coisas, tem em sua fonte: folato; β-caroteno; potássio; tiamina; além de ser considerada como uma fonte rica em vitamina C. Já em relação ao teor calórico da laranja, está em torno de 60 calorias para cada 100g (TRIBESS, 2003). 
Abaixo está uma tabela da composição química do suco de laranja cru. Nela podemos observar dentre outros dados, a quantidade de carboidratos, por diferença (g) em um valor de 100g.
Fonte: (USDA Nutrient Database for Standard Reference, Release 24, 2005 apud Vandresen, 2007)
Já em relação ao suco industrializado, o setor brasileiro explora fortemente na área da fruticultura, o ramo específico da citricultura, que envolve a laranja, tangerina, limão, dentre outros. Entretanto a laranja se destaca dentre as demais, o que coloca a indústria Brasileira em posição competitiva. No mundo, a indústria de produção de sucos está entre as maiores, sendo o suco de laranja um dos maiores protagonistas deste setor (NETO e FARIA, 1999).
Das frutas industrializadas no Brasil, uma das que estão presentes em maior quantidade está a laranja citrus sinensis, onde cerca de aproximadamente 72% dos seus frutos produzidos sofrem o processamento tendo como produto final o suco (NETO e FARIA, 1999).
Especificamente em São Paulo, no ano de 2002 existiam cerca de 11 grandes indústrias processadoras de suco. Era ainda, um estado responsável por aproximadamente 70% da produção de laranja do país, o que representava naquela época um volume que superava 400 milhões de caixas produzidas (SUGAI et al., 2002 apud VANDRESEN, 2007).
Já no mercado internacional, uma das principais formas comerciais é a do suco de laranja concentrado congelado. No ano de 2003, esta modalidade de suco acabou ocupando o segundo lugar entre os produtos mais comercializados a nível de mercado internacional, onde o seu maior exportador no Brasil foi o Estado de São Paulo (FUNDECITRUS, 2005 apud VANDRESEN, 2007).
Ainda analisando o suco de laranja concentrado congelado, após o início dos anos 90, com o crescimento de novas formas de produção de sucos, com ênfase no aumento da produção dos naturais, o consumo deste último aumentou consideravelmente. Diante disso, a rejeição ao suco concentrado congelado teve grande crescimento. Assim, houve um aumento da tendência pelo suco pasteurizado embalado, produto que não era comercializado no Brasil até 1993 e que, no ano de 1999 atingiu uma produção considerável de aproximadamente 160 milhões de litros no país (TAVARES et al., 1998).
No mercado existem muitas variedades de suco disponíveis. Para fins de curiosidade, conforme os autores, abaixo estão imagens com os rótulos e suas respectivas informações nutricionais de dois diferentes sucos comumente encontrados. São eles: Suco Del Valle® sabor laranja e; Suco Kapo® sabor uva; ambos produzidos por Coca-Cola Brasil®. O primeiro segundo consta na imagem, possui 20g ou 7% de carboidratos/açúcares para uma porção de 200 mL, o que equivale a 1 copo. Já o segundo, para a mesma porção possui 19g de carboidratos, o que representa 6%.
 
 Fonte: os autores, 2018.
 
 Fonte: os autores, 2018
	A maioria dos estudos realizados utiliza-se de outros métodos para determinar a quantidade de açúcares, como por exemplo a refratometria, dificultando assim a discussão deste trabalho.
REFERÊNCIAS
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretária de Defesa Agropecuária. Portaria nº 86, de 26 de agosto de 2016. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, DF, n. 169, p. 06, set., 2016. Seção 1.
CHEN, C. S.; SHAW, P. E.; PARISH, M. E. Orange and tangerina juices. In: NAGY, S.; CHEN, C.S.; SHAW, P.E. Fruit juice processing technology. Florida: Agscience, cap.5, p. 110-165, 1993. 
DORNEMANN, G. M. Comparação de Métodos para determinação de açúcares redutores e não-redutores. 2016. Disponível em: <https://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/143940/000998082.pdf?sequence=1>. Acesso em: 24 out. 2018.
GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES, Spectrophotometry Handbook, 2013, Disponível em: <https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/ge-spectrophotometry.pdf >. Acesso em 25 out. 2018.
HENDRIX, C. M.; REDD, J. B. Chemistry and technology of citrus juices and byproducts. In: ASHURST, P.R. Production and packaging non-carbonates fruit juices and fruit beverages. London: Blackie academic & Professional, Cap. 2, p. 53-87, 1995. 
MALDONADE et al. Protocolo para determinação de açúcares totais em hortaliças pelo método de DNS. Embrapa Agroindústria de Alimentos, Brasília, 2013b. Disponível em: < http://www.cnph.embrapa.br/paginas/serie_documentos/publicacoes2013/cot_85.pdf>. Acesso em: 24 out. 2018.
NETO, R. S. C.; FARIA, J. A. F. Fatores que influem na qualidade do suco de laranja. Campinas, Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.19, n. 1, p. 153-160, 1999.
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Principles of Instrumental Analysis, 2006. Disponível em: < http://zeus.qui.ufmg.br/~valmir/livros/analitica/Principles%20of%20Instrumental%20Analysis%20(6ed)%20-%20Skoog,%20Holler%20&%20Crouch.pdf>. Acesso em: 25 out. 2018.
TAVARES, V. B., SIVIERI, T.S. et. al. Utilização do resíduo líquido de indústria de processamento de suco de laranja como meio de cultura de Penicillium Citrinum: depuração biológica do resíduo e produção de enzima. Química Nova, v. 21, n. 6, 1998.
TRIBESS, T. B. Estudo da cinéticade inativação térmica da pectinesterase em suco de laranja natural minimamente processado. Dissertação de Mestrado, Escola Politécnica da Universidade de São Paulo, 2003.
VANDRESEN, S. Caracterização Físico-Química e Comportamento Reológico de Sucos de Cenoura e Laranja e suas Misturas. Dissertação de Mestrado. Centro Tecnológico da Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2007.
VASCONCELOS, N. M.; PINTO, G. A. S.; ARAGÃO, F. A. S. de. Determinação de Açúcares Redutores pelo Ácido 3,5-Dinitrosalicílico: Histórico do Desenvolvimento do Método e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratório de Bioprocessos. Embrapa Agroindústria de Alimentos, Fortaleza, 2013. Disponível em: < http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/103342/1/BPD13017.pdf >. Acesso em 24 out. 2018.