Coliformes Totais e Termotolerantes (Fecais E. Coli) Pela Técnica Do Número Mais Provável (NMP)

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE ENGENHARIAS E CIÊNCIAS EXATAS
CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA
Coliformes Totais e Termotolerantes (Fecais – E. Coli) Pela Técnica Do Número Mais Provável (NMP)
TOLEDO- PARANÁ
14 DE NOVEMBRO DE 2018
ÉDEN ROCKENBACH
MARLLON FELIPE SCHWARZER
VICTORIA LANZANA
Trabalho entregue a Professora Jacqueline Ferandin Honorio como avaliação da disciplina de Microbiologia Industrial do curso de Engenharia Química da Universidade Estadual do Oeste do Paraná – Campus Toledo.
	
TOLEDO- PARANÁ
14 DE NOVEMBRO DE 2018
INTRODUÇÃO
A presença de coliformes nos alimentos é de grande importância para a indicação de contaminação durante o processo de fabricação ou mesmo pós-processamento. Segundo FRANCO (2005), os microrganismos indicadores são grupos ou espécies que, quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial de um alimento, além de poder indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento. Os coliformes fecais e totais são subgrupos das entereobactérias, que são bactérias Gramm negativas, que indicam contaminação de alimentos por manipulação inadequada. 
Os coliformes totais são capazes de fermentar a lactose com produção de ácido, gás e aldeído a 35°C em 24-48 horas. Esse grupo inclui três gêneros, Escherichia, Enterobacter e Citrobacter, dentro estes só a E. coli tem como habitat primário o trato gastrointestinal do homem e de animais de sangue quente, os demais estão presentes em outros ambientes como vegetais e solo. Esse grupo de bactérias foi escolhido como indicador de contaminação de água pois essas bactérias são encontradas nas fezes de animais de sangue quentes e de seres humanos, são facilmente detectáveis e quantificáveis por técnicas simples, tem maior tempo de sobrevivência na agua que as bactérias patogênicas intestinais (são menos exigentes em termos nutricionais e são incapazes de se multiplicarem no ambiente aquático), são mais resistentes aos agentes tensoativos e agentes desinfetantes do que bactérias patogênicas, sua concentração na água contaminada possui relação direta com o grau de contaminação fecal da mesma, apesar que um aumento considerável da população bacteriana pode comprometer a detecção de organismos coliformes.
A presença de coliformes totais nos alimentos não indica, necessariamente, contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos e a maioria dessas bactérias não são patogênicas, mas podem representar riscos à saúde, como também deteriorar a qualidade da água, provocando odores e sabores desagradáveis.
Coliformes termotolerantes é um subgrupo das bactérias do grupo coliforme que fermentam a lactose a 44,5 +-0,2°C em 24 horas, tendo como principal representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal. 
OBJETIVOS
Compreensão do papel das enterobactérias como agentes de toxinfecções alimentares, a diferença entre coliformes totais e termotolerantes, aplicação da técnica do número mais provável, a denominação NMP e UFC, expressar o resultado de uma contagem direta e uma indireta. 
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais utilizados
3 Tubos de ensaio contendo Caldo lauril sulfato de sódio concentração dupla; 
6 tubos de ensaio contendo Caldo lauril sulfato de sódio concentração simples;
9 tubos de ensaio contendo Caldo verde brilhante bile 2% lactose (VBBL);
9 tubos de ensaio contendo Caldo E. coli (EC);
3 tubos de ensaio contendo Solução salina peptonada 0,1%;
Pipeta de 1, 2 e 10 mL;
1 Erlenmeyer com 225 mL de Solução salina peptonada 0,1%;
Proveta estéril de 50 mL;
Alça de Platina;
Agitador de Tubos.
3.2 Métodos
3.2.1 TESTE PRESUNTIVO
Coletou-se 25 mL de leite e transferiu-se para o Erlenmeyer contendo a solução salina peptonada 0,1%. Dessa solução, coletou-se 3 mL e transferiu-se 1 mL para cada tubo de ensaio contendo Caldo lauril sulfato de sódio de concentração dupla (diluição 10-1). O mesmo procedimento foi repetido para os tubos de ensaio contendo Caldo lauril sulfato de sódio concentração simples (diluição 10-2 e diluição 10-3). Todos os tubos continham tubo de Durham invertidos e foram submetidos à agitação no agitador magnético para que houvesse completa homogeneização. Após isso os tubos de ensaio foram incubados a 35-37ºC por 24-48 horas.
3.2.2 TESTE CONFIRMATIVO
Caso o teste presuntivo fosse positivo (formação de gás), as amostras eram submetidas a análises confirmativas para coliformes totais e coliformes fecais:
Coliformes totais: coletava-se uma porção da amostra do respectivo tubo, com o auxílio de uma alça previamente flambada, e inoculava-se em um tubo de ensaio contendo Caldo verde brilhante bile 2% lactose (VBBL) e então inoculava-se a 35-37ºC por 24-48 horas.
Coliformes fecais: repetia-se o procedimento anterior, no entanto a amostra era transferida para um tubo contendo Caldo E. Coli e a incubação era feita a 44-45ºC por 24-48 horas.
RESULTADOS E DISCUSSÕES 
O propósito primordial de estudar os métodos de análise da qualidade da água está relacionado diretamente à proteção à saúde pública. Onde através da pesquisa de agentes contaminantes, destacando de origem entérica, diminui a probabilidade de inúmeros surtos de doença (GRECHI, 2005). Estas técnicas de análises são específicas e sensíveis aos micro-organismos de água e alimento para consumo humano (YAMAGUCHI et al., 2013). 
A técnica do número mais provável (NMP) permite estimar a densidade de microrganismos viáveis presentes em uma amostra sob análise. 
A determinação do número de microrganismos é baseada no princípio de que, subdividindo a amostra em alíquotas, algumas alíquotas vão conter microrganismos e outras não, dependendo da quantidade dos microrganismos na amostra. O número de tubos com crescimento positivo após a incubação e tubos sem crescimento após a incubação permite estimar, por cálculo de probabilidade, a densidade original dos microrganismos na amostra. 
A aplicação da teoria da probabilidade depende da homogeneidade dos microrganismos na amostra, o que é facilmente obtido em amostras líquidas por meio da agitação da mesma, mas no caso de amostras sólidas é necessário o preparo e homogeneização da primeira diluição, tomando-se alíquotas a partir desta primeira diluição, em alguns casos, as alíquotas da amostra solida são inoculadas diretamente no caldo de cultura, entretanto é menos comum e depende do tipo da amostra.
Esta técnica se divide em três etapas, uma prova presuntiva, seguida de uma prova confirmativa para coliformes totais e outra confirmativa para coliformes termotolerantes. A prova presuntiva é realizada em caldo de Lauril Sulfato de Sódio, contendo lactose. Este meio é um meio de enriquecimento seletivo, no qual a presença do surfactante inibe o crescimento da membrana citoplasmática de bactérias gram-positivas e a presença da lactose viabiliza a fermentação, que libera gás carbônico, evidente no tubo de Durham, caso haja crescimento, o que não ocorreu nos tubos em análise. Mesmo após 48 horas de incubação as amostras não apresentaram bolhas (Figura 1), que indicariam a formação de gás, e consequentemente o crescimento de bactérias na amostra, ou seja, o resultado para a amostra de leite foi negativo. 
Figura 1 - Teste Presuntivo
 Como a etapa presuntiva foi negativa, não foram realizadas as etapas confirmativas para coliformes totais ou termo tolerantes. A etapa de confirmação de coliformes totais consistiria no uso do Caldo Verde Brilhante Bile, que possui bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano, que inibe o crescimento de bactérias Gram positivas, e lactose, utilizada como substrato para produção de gás, que indicaria novamente positividade. A confirmação para coliformes termo tolerantes é usado o Caldo EC (Escherichia coli), o qual é um meio seletivo para microrganismos Grampositivos, pois possui uma mistura de fosfatos que mantém o pH em valor adequado. 
O fato de ser possível inocular uma maior quantidade da amostra ao utilizar esta técnica confere à mesma uma sensibilidade maior do que a técnica de contagem em placas, entretanto por ser considerada um método padrão, está sujeita a diversas interferências, como a presença de inibidores naturais do meio seletivo, a competição entre bactérias não coliformes por lactose ou bactérias antagonistas. O antagonismo acontece quando se pode artificialmente limitar o processo de crescimento por esterilização, desinfecção microbiológica ou quando dois microrganismos vivem em um mesmo ambiente e um deles produz alguma substância que inibe o crescimento do outro, as quais podem ser de várias naturezas: enzimáticas, ácidos orgânicos ou antibióticos (BROCK, 2000). A bactéria P. aeruginosa leva vantagem sobre a E. coli em comunidades mistas que vivem em competições, por ter maior versatilidade metabólica (BANNING et al., 2003). Geralmente o antagonismo não está relacionado a um único mecanismo de ação, mas sim associações deles, como antibiose, competição por nutrientes, interação direta com o patógeno, predação ou indução de resistência (MENDES, 1999). 
Os métodos convencionais frequentemente usados para enumeração coliformes são a Técnica de Número mais Provável e Técnica de Membrana Filtrante, onde o primeiro método é laborioso, exigindo grande quantidade de meios de cultura e vidrarias. A Técnica de Filtração em Membrana utiliza equipamento de custo elevado e não é indicado para águas com alto índices de turbidez, pois dificulta o processo de filtração. Os métodos rápidos Colilert e Colitag surgiram para abreviar o tempo necessário para a obtenção dos resultados, simplificação do trabalho e redução dos gastos. Esses dois métodos são aprovados pela United States Environmental Protection Agency (USEPA) (GRECHI, 2005). A técnica do NMP é bastante versátil, permitindo a enumeração de diferentes grupos ou espécies de microrganismos, variando-se o meio de cultura e as condições de incubação.
CONCLUSÃO
Estudar a presença de enterobactérias é de extrema importância para o ramo de indústrias alimentícias, visto que pode ser um indicativo da qualidade do produto e da metodologia utilizada em seu processamento. Estes testes podem indicar higienização insuficiente na manipulação do produto, más condições de armazenamento e estocagem, entre outros. Considerando a metodologia empregada, os resultados obtidos no teste presuntivo, onde não houve formação de bolha, conclui-se que o produto estudado se encontra em qualidade microbiológica satisfatória.
REFERÊNCIAS
ULRICH, Vasconcelos da Rocha Gomes; GLICIA, Maria Torres Calazans. Investigação do antagonismo entre Pseudomonas aeruginosa e bactérias do grupo coliforme. 2005. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia de Produtos Bioativos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2005.
BROCK. Biology of microorganisms, 9th ed., New Jersey: Prentice hall, 1045p, 2000.
BANNING, N.; TOZE, S; MEE, B. J. Persistence of biofilm-associated Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa in groundwater and treated effluent in a laboratory model system, Microbiology, v. 149, p. 47-55, 2003.
MENDES, S. V. Control biologico postcosecha en Uruguay, Horticultura Internacional, a. 7, n. 26, nov. de 1999.
GRECHI, S. Q. Avaliação da eficiência de métodos rápidos usados para detecção de Coliformes Totais e Coliformes Fecais em amostras de água, em comparação com a técnica de fermentação em tubos múltiplos. 2005. 104 f. Dissertação (Mestrado alimentos e nutrição) – Universidade Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Campus Araraquaras, 2005. 
YamaguchiUM, et al. Qualidade microbiológica da água para consumo humano em instituição de ensino de Maringá-PR. Revista: O mundo da saúde, São Paulo, v. 37, n. 3, p. 312-320, 2013.
Brasil. Fundação Nacional de Saúde. Manual prático de análise de água / Fundação Nacional de Saúde – 4. ed. – Brasília: Funasa, 2013.
FRANCO, Bernadette D. G. M; LANDGRAF,Mariza, Maria Tereza Destro. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo, Ed. Atheneu, 2005.p27-171.