aula 3 tecnologia lipossomas

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LIPOSSOMAS
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
Classificação dos Lipossomas:
Diâmetro (nm)	400 - 3500 20 - 50 	200 - 1000
volume aquoso	4,1		0.5	13.7
(L/mg)
% de encapsulação	 5 - 15		0.5 - 1	35 - 65
	 MLV * SUV ** LUV***
* Vesículas multilamelares: MLV
** Vesículas pequenas unilamelares: SUV
*** Vesículas grandes unilamelares: LUV
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VESÍCULAS MULTILAMELARES
 > 0.1m; 
mais de uma bicamada
<volume aquoso; 
> encapsulação de fármacos lipofílicos
Mecanicamente estável por longo período
Simples preparo 
Hidratação de lipídios em presença de solvente orgânico ou simples hidratação
CLASSIFICAÇÃO
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VESÍCULA UNILAMELAR GRANDE
>0,1m; bicamada única
> volume aquoso; > uso para fármacos hidrofílicos
> encapsulação de macromoléculas
Preparação: injeção de solvente (éter ou etanol) ou diálise em detergente
CLASSIFICAÇÃO
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VESÍCULAS UNILAMELARES PEQUENA
0,1m;
bicamada única;
tamanho homogêneo
< volume aquoso
Longa duração
Termodinamicamente instável
Susceptível a agregação e fusão
< encapsulamento de macromoléculas
Preparação a partir de lipossomas maiores (VM e VUG) por extrusão - passagem através de pequenos orifícios sob alta pressão
Carregamento ativo : alta eficiência (90%) 
F entra no LIPSS por difusão passiva (NI); dentro do LIPSS se ioniza >[ ] . Ex: doxorrubicina e epirrubicin, carregada em vesículas unilamelares pequenas
CLASSIFICAÇÃO
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LIPOSSOMAS COMO CARREADORES DE FÁRMACOS
Fármacos anti-câncer
Vitaminas
Antibióticos
Antifúngicos
Antioxidantes
Gene terapia
Proteínas
Vacinas
Anticorpos
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
Métodos de preparação
(Etapas comuns)
Colesterol
Lecitina
Lipídeo com 
carga
Solubilização
Solvente orgânico
Evaporação do solvente
Dispersão do filme
Separação do p.a não
 encapsulado
Análise
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LIPOSSOMAS
Hidratação filme fino lipídico
Métodos mecânicos utilizados para formular lipossomas
sonicação, extrusão, microfluidisação
Dispersão de lipossomas liofilizados ou congelados
Dispersão de uma solução orgânica de fosfolípides
Dispersão de micelas misturadas
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
Métodos mecânicos de dispersão de fosfolipídeos
1. Obtenção de MLV por hidratação de um filme fosfolipídico.
H2O
H2O
H2O
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
2. Obtenção de SUV por Ultra-Som
Etapa 1. Obtenção de MLV por evaporação de solventes
Etapa 2. MLV são submetidos a ação de ultra-som
	- frequência 20 - 60 kHz
	-  > Tc
	- tempo variável
Etapa 3. Separação de MLV e SUV
	-cromatografia em gel
	- cromatografia em camada delgada
	- ultracentrifugação
Fosfolipídeo
H2O
Lipossomas multilamelares
Lipossomas unilamelares
Ultra-som
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
Características dos lipossomas SUV obtidos por ultra-som:
- Injetáveis
(permeabilidade elevada -- fusão de vesículas)
- Degradação de lipídeos ou do pa
- Contaminação da preparação por partículas liberadas pela sonda (titâneo)
3. Obtenção de SUV por extrusão em prensa de French
- Passagens repetidas da preparação de MLV pela prensa de French (20.000 p.s.i.; 4ºC)
- Obtenção de uma preparação homogênea de SUV
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
Vantagens:
- Método simples;
- Reprodutível;
- Não destrutivo: não ocorre degradação de fosfolipídeos ou desnaturação de proteínas;
- Aplicáveis a grandes volumes de dispersão lipídica de alta concentração;
- Encapsulamento de medicamentos;
- Útil no estudo de interação vesícula - célula.
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
4. Obtenção de SUV por Microfluidização
Reservatório
Filtro
Bomba
Saída de ar
Entradade ar
Entrada
Saída
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
5. Obtenção de MLV por dispersãode lipossomas liofilizados - reidratação
Lipossomas SUV
Liofilização
Lipossomas MLV
Solução do pa
+
Adição de
tampão
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
MÉTODO DE DIPERSÃO DE UMA SOLUÇÃO ORGÂNICA DE FOSFOLIPÍDEOS
1. Obtenção de lipossomas por evaporação em fase reversa
Colesterol
Fosfatidilcolina
Lipídeo com garga
pa lipofílico
Evaporação
MeOH / CH3Cl
40ºC
MeOH / CH3Cl
Dispersão do filme
Análise
Armazenamento
Lipossoma
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
2. Obtenção de SUV por injeção de solução etanólica
Etapa 1.
Dissolução de fosfolipídeos e constituintes em etanol (20 a 40 Mol Lip/mL.
Etapa 2.
Injeção solução etanólica em solução tampão (KCl 15 M), formação espontânea de pequenas vesículas.
Etapa 3.
Concentração da solução por ultracentrifugação sob atmosfera de nitrogênio.
Etapa 4.
Diálise para eliminação de resíduos de álcool.
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
Características dos Lipossomas:
- suspensão diluída
 diminuir a taxa de encapsulação de pa
- desestabilização do pa pelo etanol
3. Obtenção de SUV por infusão de éter
eter
eter
tampão
eter
T
T
T
T
Tampão
Mecanismo de Formação de Lipossomas REV
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PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS
Método ‘bubble’ (Talsma et al., 1994)
Fosfolípides e moléculas não-dissolvidas/não-hidratadas na interface ar/água
Bolhas de gás nitrogênio
N2 /vesículas de fosfolípides
N2/vesículas de fosfolípides acumuladas na superfície da água
Explosão da bolha
Formação da bicamada invertida
Formação dos lipossomas 
�
_922866658.unknown
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Vantagens
Aplicação para lipossomas 
Nem orgânico, nem detergente
Pequena força de cizalhamento
Carregamento de proteínas
Alta eficiência de encapsulação
Desvantagens
Decomposição fosfolipídica
Longo tempo de preparação (24h)
Diminuição do pH 
Espuma excessiva
PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS PELO 
MÉTODO ‘BUBBLE’
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
Caracterização de Lipossomas
* Obtenção de uma preparação homogênea
* Determinação de tamanho das vesículas
* Taxa de encapsulação
* Estabilidade físico-química dos lipossomas
* Interação de lipossomas com células
* Cinética de liberação “in vitro”
* Biodisponibilidade
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
1. Obtenção de uma preparação homogênea de lipossomas.
* Cromatografia líquida de alta eficiência
0.4
30
20
10
0.2
0.6
Volume de solução ( mL)
Turbidez (300nm)
MLV
SUV
Perfil da solução de uma preparação de lipossomas formados por ultra-som a partir de uma suspensão de MLV Coluna de Sepharose 4B ( 2.5 x 50 cm).
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
* Centrifugação
Ultra-som
Fosfolipídeo com
 solução salina
MLV e partículas
de titâneo
Agregados
 lipídicos
Pequenos
MLV
SUV
homogênea
1º centrifugação
100000g - 30min.
2º centrifugação
159000g - 3 a 4 hs
Representação esquemática do Método de Barenholz 
que permite a obtenção de preparações homogêneas de SUV
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
* Diálise
Membranas de porosidade variável.
2. Determinação do tamanho das vesículas
* Microscopia Eletrônica de varredura
Método de Hamilton, coloração com tetróxido de ósmio
* Microscopia Eletrônica a transmissão
* Espectroscopia de auto - correlação de fotons (difração de raio laser monocromático) - Nanosizer 
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
100%
50%
0%
10
1000
100
Distribuição Unimodal
Diâmetro das partículas em nm
Intensidade Diferencial
SDP
40%
30%
20%
10%
10
10000
1000
100
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
3. Taxa de encapsulação.
* Expressão quantitativa de encapsulação
	** Percentagem de encapsulação
	** Massa de substância encapsulada por unidade de massa de lipídeo
	** Volume aquoso encapsulado
* Influência de diferentes fatores sobre a encapsulação:
	** Substânciashidrossolúveis
	** Substâncias lipossolúveis e anfifílicas
	** Caso particular de proteínas
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
4. Estabilidade físico-química dos lipossomas
* Estabilidade a longo prazo:
	** Aspecto macroscópico
	** Aspecto microscópico
	** Diâmetro das partículas
	** Viscosidade
	** Condutividade
	** pH
	** Temperatura de conservação (4ºC, 25ºC e 40 ºC).
	** Dosagem do princípio ativo
* Estabilidade acelerada
	** Centrifugação ( 3500rpm / 1h)
	** Ciclos de congelamento-descongelamento
		(8h a -18 ºC e 16h a 25 ºC)
	**Agitação mecânica (150 Strokes / min. 48h)
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
CONSERVAÇÃO DE LIPOSSOMAS
* Alterações:
- Oxidação e hidrólise de fosfolipídeos
- Interações do tipo Van der Waals
	** agregação
	** carga + ou -
* Métodos de conservação
- Atmosfera de N2, argônio
- Temperatura 4º C
- Abrigo da luz
- Liofilização
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Sistema de Carreação de Fármacos - Lipossomas
INTERAÇÕES COM AS CÉLULAS IN VIVO
* Técnicas de caracterização da internalização do conteúdo
	** Marcadores fluorescentes
	** Marcadores biológicos
Adsorção
Liberação local
Não específico
Específico
Transferência de Lipídeos
Fagocitose
Endocitose
Fusão
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Lipossomas
Carreadores microparticulados ou colidais (0,05-5m)
Lipídeos hidratados em meio aquoso – formação espontânea
Materiais biodegradáveis e biocompatíveis
Volume aquoso envolto por 1 ou + bicamadas de lipídeos naturais ou sintéticos
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Lipossomas
Fármaco ( lipofilicidade) encapsulado em lipossomas:
Bicamada fosfolipídica
No volume aquoso envolvido
Na interface da bicamada
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USO
Antineoplásicos, antimicrobianos, agentes quelantes, esteróides, vacinas e material genético
 índice terapêutico
Dose requerida tóxica p/ tecidos normais
Inabilidade de chegar ao tumor em concentrações adequadas
Citotoxicidade não específica ( atinge tecidos importantes)
Problemas associados c/ a formulação
 solubilidade em solventes comuns – tensoativo ou co-solvente orgânico – efeitos colaterais
Composição
Lipídeos nat. ou sint. (fosfolípides)
Podem conter outras bicamadas (colesterol ou pol. hidrofílicos conj. a lipid)
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APLICAÇÕES
Quando usar:
Formulação no mercado não é satisfatória
Eficácia terapêutica e segurança superior
Formulação c/ tensoativos e co-solventes tóxicos
Lipossoma – lipídeos : 
Não tóxicos, não imunogênicos, biocompatíveis, biodegradáveis, versáteis
Liberação do fármaco intracelular
Farm c/ recept intracelul/LIP  absorção do Farm. na cél.
Ex: fosfoacetil-L-aspartato (PALA) – câncer de ovário
absorvido pelas cels/Cel tumoral absorve por pinocitose - limitação
Através de lipossomas:
 [ ] fármaco retido no LIP; Absorção por pinocitose; Absorção por endocitose; 
PALA lipossomal 500x > PALA livre
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APLICAÇÕES
Liberação sustentada
Citosina arabinose (Ara-C) – leucemia
Rapida/e excretada; Requer níveis plasm por períodos prolongados
Em lipossoma - eficácia terapêutica
Terapia Gênica
Ausência de enzimas/ fatores - Causa genética
Restauração da expressão gênica
Liberação de DNA exógeno ou genes
Geral/e formulados em lipídeos catiônicos e neutros
Pode haver complexação lip-plasmídeo
Diminuir toxicidade em tec normais
LIP  absorvido no coração, rim e TGI – alteração na absorção nos tec normais
Anfotericina B livre - nefrotoxicidade
Doxorrubicina livre – toxicidade cardíaca
Em lipossomas toxicidade e = eficácia
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APLICAÇÕES
Sítio específica
Passivo
Tendência natural 
Macrófagos fagocitam LIP (part. estranhas)
Utilizado p/ fármacos imunossupressores em tec linfáticos  rejeição
Ativo
LIP + Fármaco + anticorpo específico = imunolipossoma
Administração intraperitoneal 
Fármaco livre – rapida/e excretado 
LIP - clearance > [ ] / longo período
Adjuvante em vacinas
Encapsular antígenos
1ª vacina – vírus da hepatite A inativado
1995 – aprovado p/ uso humano na Suiça
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Estabilidade
 Química 
Hidrólise lig. Éster e/ou oxidação cadeias insat.
Física
Extravasamento F e/ou agregação ou fusão das vesículas
F particiona fora do LIPSS durante estocagem
Estratégia 
Liofilização : lipossoma + crioprotetor (açúcar) = liofilizados 
Reconstituição antes do uso
Ex: AmBisomeTM: 1°LIPSS liofilizado
Esterilização
Sensíveis ao calor, radiação e agentes químicos esterilizantes
Estratégia:
Filtração em membrana estéril de 0,22m
Não é viavel p/ vesículas >0,2m
Não retém vírus
LIMITAÇÕES
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Eficiência de encapsulação
Ex: paclitaxel <3% - baixa afinidade c/ bicamada lipídica
Reprodutibilidade lote a lote
Controle do tamanho da partícula
Produção em larga escala
Pequeno T½ circulação das partículas
LIMITAÇÕES
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