Relatório Prática 4- Pedro Vinícius, Rafael Stutz e Vinícius El Khalili

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Universidade de Sa˜o Paulo
Instituto de F´ısica de Sa˜o Carlos
Laborato´rio de bioqu´ımica para CFBio
Pra´tica 4: Obtenc¸a˜o e quantificac¸a˜o da case´ına e
determinac¸a˜o de sua massa molecular
Pedro Vin´ıcius Alves
Rafael Stutz
Vinicius El Khalili Borsato
Abril
2019
Suma´rio
1 Obtenc¸a˜o da case´ına 2
1.1 Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Resultados e discussa˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2 Quantificac¸a˜o da concentrac¸a˜o de case´ına 3
2.1 Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.3 Resultados e discussa˜o . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.4 Determinac¸a˜o da Concentrac¸a˜o de Case´ına . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
3 Eletroforese 5
3.0.1 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
4 Questo˜es 12
5 Bibliografia 12
1 Obtenc¸a˜o da case´ına
blabla [1]
1.1 Fundamentos
A case´ına e´ uma famı´lia de prote´ınas encontradas no leite, compondo 80% das prote´ınas encontradas
no leite bovino e 20-45% das prote´ınas encontradas no leite humano. Alimentos derivados do leite -
manteiga, queijo, sorvete etc. - sa˜o ricos em case´ına, tornando-a uma prote´ına fortemente presente
em nossa alimentac¸a˜o dia´ria.
A famı´lia de case´ınas presentes no leite bovino e´ composta por quatro tipos de case´ına: αS1,
αS2, β e κ. As case´ınas αS1, αS2 e β sa˜o ricas em grupos fosfato, facilitando sua solubilidade em
a´gua, enquanto a case´ına κ e´ uma glicoprote´ına hidrof´ılica.
O ponto isoele´trico da case´ına bovina e´ aproximadamente 4.60. O pH do leite bovino usalmente
encontra-se entre 6.4 e 6.8, o que significa que a case´ına presente no leite tem uma carga total
negativa. Quando sujeita a um pH em 4.60, a case´ına torna-se neutra e insolu´vel, precipitando.
1.2 Objetivos
Extrac¸a˜o da case´ına a partir de uma amostra de leite bovino em po´.
1.3 Resultados e discussa˜o
Apo´s o teste do fosfato resultar em negativo, esperamos a sedimentac¸a˜o da u´ltima lavagem da
case´ına, pore´m sem resultados. A tentativa de filtrar nossa soluc¸a˜o, por consequente, falhou e,
portanto, na˜o fomos capazes de realizar a extrac¸a˜o. Os experimentos a seguir foram realizados com
uma soluc¸a˜o padra˜o oferecida pelo te´cnico do laborato´rio.
2
2 Quantificac¸a˜o da concentrac¸a˜o de case´ına
2.1 Fundamentos
Por meio da diluic¸a˜o da case´ına e a utilizac¸a˜o do espectrofotoˆmetro, aplicamos a Lei de Beer-
Lambert para determinarmos a concentrac¸a˜o da soluc¸a˜o.
A = C�L (2.1)
2.2 Objetivos
Determinar a concentrac¸a˜o da case´ına dilu´ıda por meio da relac¸a˜o de Beer-Lambert
2.3 Resultados e discussa˜o
Para adquirirmos uma soluc¸a˜o com absorbaˆncia entre 0.1 e 0.7, dilu´ımos nossa amostra inicial de
case´ına um total de 20 vezes, utlizando um tampa˜o borato. Utilzando do banco de dados ExPASy
e o programa ProtParam Tool, encontramos que os seguintes paraˆmetros para a prote´ına analisada:
coeficiente de extinc¸a˜o molar(25900) e massa molar(aproximadamente 23 KDa).
Ccasein = 2.478.10−5mol/L (2.2)
Multiplicando pelo fator de diluic¸a˜o e pela massa molar da case´ına(aproximadamente 23 kDa),
obtemos:
Ccasein = 11.5g/L (2.3)
Infelizmente, pela extrac¸a˜o da case´ına ter falhado, na˜o podemos dizer nada acerca do rendimento
desse procedimento.
2.4 Determinac¸a˜o da Concentrac¸a˜o de Case´ına
A segunda parte consiste em obter a concentrac¸a˜o da amostra obtida de caseina a partir de uma
curva de padronizac¸a˜o de uma amostra conhecida de case´ına, disponibilizada em laborato´rio.
A amostra dispon´ıvel possui concentrac¸a˜o de 2%(m/v), ou seja, 0.02g/ml = 20mg/ml. A fim
de obter a curva de padronizac¸a˜o, preparou-se seis amostras a partir da case´ına padra˜o e duas
amostras teste a partir da case´ına obtida.
Para cada amostra, mediu-se a absorbaˆncia da case´ına no espectrofotoˆmetro em 550nm. A partir
do coeficiente angular obtido pela regressa˜o linear do gra´fico absorbaˆncia x mg/ml(proteina) para a
soluc¸a˜o padra˜o, podemos estimar a concentrac¸a˜o da caseina obtida em termos de sua absorbaˆncia,
comparando-a a` curva de padronizac¸a˜o.
Tabela 1: Volumes de reagentes adicionados para construc¸a˜o da curva de padronizac¸a˜o da case´ına.
3
Tubo Soluc¸a˜o padra˜o (ml) Borato (ml) Biureto (ml) Absorbaˆncia (λ = 550nm)
A 1.0 0.0 4.0 0.703
B 0.8 0.2 4.0 0.642
C 0.6 0.4 4.0 0.532
D 0.5 0.5 4.0 0.446
E 0.4 0.6 4.0 0.385
F 0.2 0.8 4.0 0.190
T1 1.0 0.0 4.0 0.059
T2 0.5 0.5 4.0 0.062
Para obter a curva, realizou-se uma regressa˜o linear da concentrac¸a˜o de prote´ına em func¸a˜o da
absorbaˆncia para a soluc¸a˜o padra˜o.
relatorio.png
Figura 1: Curva de padronizac¸a˜o da case´ına.
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Tabela 2: Concentrac¸a˜o x absorbaˆncia
Tubo Concentrac¸a˜o (mg/ml) Absorbaˆncia (λ = 550nm)
A 4.0 0.703
B 3.2 0.642
C 2.4 0.532
D 2.0 0.446
E 1.6 0.385
F 0.8 0.190
T1 ? 0.059
T2 ? 0.062
Atrave´s da regressa˜o linear, obteve-se a curva de padronizac¸a˜o da case´ına, dada pela func¸a˜o
C(Abs) = 0.16Abs+ 0.10. Tomando as absorbaˆncias das soluc¸o˜es teste T1 e T2, obtem-se, aproxi-
madamente, C(T1) = 0.1193 e C(T2) = 0.1198. Contudo, como ha´ o dobro de case´ına em T1 em
relac¸a˜o a T2, a concentrac¸a˜o desse, portanto, deveria ser maior. Como claramente na˜o houve perda
durante o preparo da soluc¸o˜es ate´ a sua medida no espectofotoˆmetro, provavelmente o grupo colocou
a mesma concentrac¸a˜o em ambos os tubos, de modo a obter valores aproximadamente ideˆnticos.
3 Eletroforese
A eletroforese e´ um me´todo que utiliza a migrac¸a˜o de mole´culas ionizadas, de acordo com carga
ele´trica e massa molecular, por um gradiente de potencial ele´trico. Enta˜o, ela proporciona uma
separac¸a˜o de mole´culas com base em seu tamanho, a medida em que cada mole´cula adquire uma
velocidade diferente quando aplicado um campo ele´trico. Na pra´tica, observamos a migrac¸a˜o de
uma prote´ına (case´ına) por um gel de poliacrilamida em uma estrutura submetida a uma fonte de
tensa˜o. O gel, por sua vez, e´ uma substaˆncia bastante inativa, ou seja, na˜o reage quimicamente com
a case´ına (isso possibilita que a prote´ına se desloque por seus poros e “canais” sem sofrer alterac¸o˜es
qu´ımicas). As prote´ınas podem adquirir cargas positivas ou negativas em func¸a˜o do pH do meio, e
por isso e´ necessa´rio utilizar uma soluc¸a˜o tampa˜o para a manutenc¸a˜o do pH. O tampa˜o aplicado
possui substaˆncias como o Tris-HCl e o SDS, que quebram as interac¸o˜es na˜o covalentes da case´ına,
promovendo um processo de desnaturac¸a˜o proteica. Ale´m disso, o SDS se liga a` prote´ına, o que
lhe confere uma carga total negativa. Consequentemente, a case´ına ira´ migrar do polo negativo
para o positivo. Caso uma mistura de prote´ınas seja submetida a eletroforese, espera-se que cada
mole´cula se mantenha em uma faixa estreita do gel. Abaixo temos uma representac¸a˜o esquema´tica
da unidade de eletroforese e a fonte de tensa˜o (e´ va´lido notar que no experimento realizado a
unidade de eletroforese estava disposta na vertical):
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Figura 2: Caption
3.0.1 Resultados
Obtendo a distaˆncia referentes ao marcado, em preto na imagem do gel, conseguimos os dados
necessa´rios para calcular Rf. Com o aux´ılio de uma tabela com valores padro˜es para a massa molar
desses marcadores adquirimos tambe´m o valor de log(massa molar) e plotamos ambos no gra´ficos
apresentado abaixo.
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Figura 3: Caption
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Tabela 3: log(MM) x Rf
log(MM) Dist(cm) Rf
4.18 1.10 0.275
3.80 1.45 0.362
3.58 1.75 0.437
3.36 2.25 0.5623.17 2.55 0.637
2.99 3.00 0.750
2.66 3.75 0.937
8
Figura 4: Caption
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Figura 5: Caption
Como os pontos do marcador esta˜o em vermelho, para a reta padra˜o, obtive´mos a seguinte
equac¸a˜o: log(MM) = −2.19Rf + 4.63. Com isso, fomos capazes de, usando as bandas descritas
abaixo e apresentadas por trac¸os vermelhos na imagem do gel e em azul no gra´fico, encontrar
valores para os componentes separados da case´ına.
Banda Rf MM(kDa)
1 0.275 53.13
2 0.575 29.10
3 0.837 16.37
Comparando com os dados da literatura, nossa eletroforese resultou em, provavelmente, Soroal-
bumina(MM = 66 kDa), alfa1-case´ına(MM = 23 kDa) e alfa-lactoglobulina(MM= 14.17 kDa). Por
mais que a soroalbumina na˜o fosse esperada, conseguimos obter a alfa1-case´ına e na˜o a alfa2 ou
beta, comprovando a sua maior quantidade na soluc¸a˜o analisada
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Figura 6: Caption
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4 Questo˜es
1)Esta e´ a reac¸a˜o da formac¸a˜o da colorac¸a˜o amarela entre a soluc¸a˜o de molibdato de amoˆnio com
o fosfato. Ela ocorre na presenc¸a de , pois e´ necessa´rio um meio a´cido, sendo que o precipitado
amarelo cristalino e´ o fosfomolibdato de amoˆnio produzido pela reac¸a˜o. Ale´m disso, empregamos na
equac¸a˜o o molibdato de amoˆnio e na˜o sua fo´rmula comercial (paramolibdato de amoˆnio) por uma
questa˜o de simplicidade, o que na˜o implica em um erro, pois os ı´ons da equac¸a˜o esta˜o presentes nas
condic¸o˜es experimentais da reac¸a˜o.
2)O biureto e´ um reagente composto por hidro´xido de so´dio e sulfato de cobre que pode ser
usado para detectar a presenc¸a de ligac¸o˜es pept´ıdicas. A reac¸a˜o dos ı´ons cu´pricos com os a´tomos
de nitrogeˆnio das ligac¸o˜es pept´ıdicas acarreta o deslocamento dos a´tomos de hidrogeˆnio (ocorre em
meio alcalino) e isso gera uma mudanc¸a de colorac¸a˜o caracter´ıstica (o biureto e´ um reagente azul,
mas ao reagir com a prote´ına, o meio se torna violeta).
3 e 4)Na˜o conseguimos obter o rendimento da case´ına, pois mesmo com o teste do fosfato re-
sultando em negativo, na˜o houve sedimentac¸a˜o apo´s a ultima lavagem, impossibilitando a filtrac¸a˜o.
5)Outra te´cnica que pode ser aplicada para determinar a massa molecular da case´ına e´ o da cro-
matografia de exclusa˜o. Nela ha´ um volume de eluic¸a˜o da prote´ına que e´ determinado a partir
de seu tamanho. Diferentemente da eletroforese em gel, as prote´ınas que levam um tempo maior
para migrar sa˜o as de menor massa molecular nesse tipo de te´cnica. Ademais, pode-se determinar
a massa molecular da case´ına com espectrometria de massas, que utiliza me´todos de ionizac¸o˜es
brandas.
6)
5 Bibliografia
Apostila de Pra´ticas de Bioqu´ımica- IQSC- USP Lehiningher - Princ´ıpios de Bioqu´ımica
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