Relatório Prática 4- Pedro Vinícius, Rafael Stutz e Vinícius El Khalili
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Relatório Prática 4- Pedro Vinícius, Rafael Stutz e Vinícius El Khalili


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Universidade de Sa\u2dco Paulo
Instituto de F´\u131sica de Sa\u2dco Carlos
Laborato´rio de bioqu´\u131mica para CFBio
Pra´tica 4: Obtenc¸a\u2dco e quantificac¸a\u2dco da case´\u131na e
determinac¸a\u2dco de sua massa molecular
Pedro Vin´\u131cius Alves
Rafael Stutz
Vinicius El Khalili Borsato
Abril
2019
Suma´rio
1 Obtenc¸a\u2dco da case´\u131na 2
1.1 Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Resultados e discussa\u2dco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2 Quantificac¸a\u2dco da concentrac¸a\u2dco de case´\u131na 3
2.1 Fundamentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.3 Resultados e discussa\u2dco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.4 Determinac¸a\u2dco da Concentrac¸a\u2dco de Case´\u131na . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
3 Eletroforese 5
3.0.1 Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
4 Questo\u2dces 12
5 Bibliografia 12
1 Obtenc¸a\u2dco da case´\u131na
blabla [1]
1.1 Fundamentos
A case´\u131na e´ uma fam\u131´lia de prote´\u131nas encontradas no leite, compondo 80% das prote´\u131nas encontradas
no leite bovino e 20-45% das prote´\u131nas encontradas no leite humano. Alimentos derivados do leite -
manteiga, queijo, sorvete etc. - sa\u2dco ricos em case´\u131na, tornando-a uma prote´\u131na fortemente presente
em nossa alimentac¸a\u2dco dia´ria.
A fam\u131´lia de case´\u131nas presentes no leite bovino e´ composta por quatro tipos de case´\u131na: \u3b1S1,
\u3b1S2, \u3b2 e \u3ba. As case´\u131nas \u3b1S1, \u3b1S2 e \u3b2 sa\u2dco ricas em grupos fosfato, facilitando sua solubilidade em
a´gua, enquanto a case´\u131na \u3ba e´ uma glicoprote´\u131na hidrof´\u131lica.
O ponto isoele´trico da case´\u131na bovina e´ aproximadamente 4.60. O pH do leite bovino usalmente
encontra-se entre 6.4 e 6.8, o que significa que a case´\u131na presente no leite tem uma carga total
negativa. Quando sujeita a um pH em 4.60, a case´\u131na torna-se neutra e insolu´vel, precipitando.
1.2 Objetivos
Extrac¸a\u2dco da case´\u131na a partir de uma amostra de leite bovino em po´.
1.3 Resultados e discussa\u2dco
Apo´s o teste do fosfato resultar em negativo, esperamos a sedimentac¸a\u2dco da u´ltima lavagem da
case´\u131na, pore´m sem resultados. A tentativa de filtrar nossa soluc¸a\u2dco, por consequente, falhou e,
portanto, na\u2dco fomos capazes de realizar a extrac¸a\u2dco. Os experimentos a seguir foram realizados com
uma soluc¸a\u2dco padra\u2dco oferecida pelo te´cnico do laborato´rio.
2
2 Quantificac¸a\u2dco da concentrac¸a\u2dco de case´\u131na
2.1 Fundamentos
Por meio da diluic¸a\u2dco da case´\u131na e a utilizac¸a\u2dco do espectrofoto\u2c6metro, aplicamos a Lei de Beer-
Lambert para determinarmos a concentrac¸a\u2dco da soluc¸a\u2dco.
A = C\ufffdL (2.1)
2.2 Objetivos
Determinar a concentrac¸a\u2dco da case´\u131na dilu´\u131da por meio da relac¸a\u2dco de Beer-Lambert
2.3 Resultados e discussa\u2dco
Para adquirirmos uma soluc¸a\u2dco com absorba\u2c6ncia entre 0.1 e 0.7, dilu´\u131mos nossa amostra inicial de
case´\u131na um total de 20 vezes, utlizando um tampa\u2dco borato. Utilzando do banco de dados ExPASy
e o programa ProtParam Tool, encontramos que os seguintes para\u2c6metros para a prote´\u131na analisada:
coeficiente de extinc¸a\u2dco molar(25900) e massa molar(aproximadamente 23 KDa).
Ccasein = 2.478.10\u22125mol/L (2.2)
Multiplicando pelo fator de diluic¸a\u2dco e pela massa molar da case´\u131na(aproximadamente 23 kDa),
obtemos:
Ccasein = 11.5g/L (2.3)
Infelizmente, pela extrac¸a\u2dco da case´\u131na ter falhado, na\u2dco podemos dizer nada acerca do rendimento
desse procedimento.
2.4 Determinac¸a\u2dco da Concentrac¸a\u2dco de Case´\u131na
A segunda parte consiste em obter a concentrac¸a\u2dco da amostra obtida de caseina a partir de uma
curva de padronizac¸a\u2dco de uma amostra conhecida de case´\u131na, disponibilizada em laborato´rio.
A amostra dispon´\u131vel possui concentrac¸a\u2dco de 2%(m/v), ou seja, 0.02g/ml = 20mg/ml. A fim
de obter a curva de padronizac¸a\u2dco, preparou-se seis amostras a partir da case´\u131na padra\u2dco e duas
amostras teste a partir da case´\u131na obtida.
Para cada amostra, mediu-se a absorba\u2c6ncia da case´\u131na no espectrofoto\u2c6metro em 550nm. A partir
do coeficiente angular obtido pela regressa\u2dco linear do gra´fico absorba\u2c6ncia x mg/ml(proteina) para a
soluc¸a\u2dco padra\u2dco, podemos estimar a concentrac¸a\u2dco da caseina obtida em termos de sua absorba\u2c6ncia,
comparando-a a` curva de padronizac¸a\u2dco.
Tabela 1: Volumes de reagentes adicionados para construc¸a\u2dco da curva de padronizac¸a\u2dco da case´\u131na.
3
Tubo Soluc¸a\u2dco padra\u2dco (ml) Borato (ml) Biureto (ml) Absorba\u2c6ncia (\u3bb = 550nm)
A 1.0 0.0 4.0 0.703
B 0.8 0.2 4.0 0.642
C 0.6 0.4 4.0 0.532
D 0.5 0.5 4.0 0.446
E 0.4 0.6 4.0 0.385
F 0.2 0.8 4.0 0.190
T1 1.0 0.0 4.0 0.059
T2 0.5 0.5 4.0 0.062
Para obter a curva, realizou-se uma regressa\u2dco linear da concentrac¸a\u2dco de prote´\u131na em func¸a\u2dco da
absorba\u2c6ncia para a soluc¸a\u2dco padra\u2dco.
relatorio.png
Figura 1: Curva de padronizac¸a\u2dco da case´\u131na.
4
Tabela 2: Concentrac¸a\u2dco x absorba\u2c6ncia
Tubo Concentrac¸a\u2dco (mg/ml) Absorba\u2c6ncia (\u3bb = 550nm)
A 4.0 0.703
B 3.2 0.642
C 2.4 0.532
D 2.0 0.446
E 1.6 0.385
F 0.8 0.190
T1 ? 0.059
T2 ? 0.062
Atrave´s da regressa\u2dco linear, obteve-se a curva de padronizac¸a\u2dco da case´\u131na, dada pela func¸a\u2dco
C(Abs) = 0.16Abs+ 0.10. Tomando as absorba\u2c6ncias das soluc¸o\u2dces teste T1 e T2, obtem-se, aproxi-
madamente, C(T1) = 0.1193 e C(T2) = 0.1198. Contudo, como ha´ o dobro de case´\u131na em T1 em
relac¸a\u2dco a T2, a concentrac¸a\u2dco desse, portanto, deveria ser maior. Como claramente na\u2dco houve perda
durante o preparo da soluc¸o\u2dces ate´ a sua medida no espectofoto\u2c6metro, provavelmente o grupo colocou
a mesma concentrac¸a\u2dco em ambos os tubos, de modo a obter valores aproximadamente ide\u2c6nticos.
3 Eletroforese
A eletroforese e´ um me´todo que utiliza a migrac¸a\u2dco de mole´culas ionizadas, de acordo com carga
ele´trica e massa molecular, por um gradiente de potencial ele´trico. Enta\u2dco, ela proporciona uma
separac¸a\u2dco de mole´culas com base em seu tamanho, a medida em que cada mole´cula adquire uma
velocidade diferente quando aplicado um campo ele´trico. Na pra´tica, observamos a migrac¸a\u2dco de
uma prote´\u131na (case´\u131na) por um gel de poliacrilamida em uma estrutura submetida a uma fonte de
tensa\u2dco. O gel, por sua vez, e´ uma substa\u2c6ncia bastante inativa, ou seja, na\u2dco reage quimicamente com
a case´\u131na (isso possibilita que a prote´\u131na se desloque por seus poros e \u201ccanais\u201d sem sofrer alterac¸o\u2dces
qu´\u131micas). As prote´\u131nas podem adquirir cargas positivas ou negativas em func¸a\u2dco do pH do meio, e
por isso e´ necessa´rio utilizar uma soluc¸a\u2dco tampa\u2dco para a manutenc¸a\u2dco do pH. O tampa\u2dco aplicado
possui substa\u2c6ncias como o Tris-HCl e o SDS, que quebram as interac¸o\u2dces na\u2dco covalentes da case´\u131na,
promovendo um processo de desnaturac¸a\u2dco proteica. Ale´m disso, o SDS se liga a` prote´\u131na, o que
lhe confere uma carga total negativa. Consequentemente, a case´\u131na ira´ migrar do polo negativo
para o positivo. Caso uma mistura de prote´\u131nas seja submetida a eletroforese, espera-se que cada
mole´cula se mantenha em uma faixa estreita do gel. Abaixo temos uma representac¸a\u2dco esquema´tica
da unidade de eletroforese e a fonte de tensa\u2dco (e´ va´lido notar que no experimento realizado a
unidade de eletroforese estava disposta na vertical):
5
Figura 2: Caption
3.0.1 Resultados
Obtendo a dista\u2c6ncia referentes ao marcado, em preto na imagem do gel, conseguimos os dados
necessa´rios para calcular Rf. Com o aux´\u131lio de uma tabela com valores padro\u2dces para a massa molar
desses marcadores adquirimos tambe´m o valor de log(massa molar) e plotamos ambos no gra´ficos
apresentado abaixo.
6
Figura 3: Caption
7
Tabela 3: log(MM) x Rf
log(MM) Dist(cm) Rf
4.18 1.10 0.275
3.80 1.45 0.362
3.58 1.75 0.437
3.36 2.25 0.562