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PRINCÍPIOS DE QUIMICA ANALÍTICA CROMATOGRAFIA Profa. Valéria Regina Bellotto CROMATOGRAFIA Introdução Descrição geral da cromatografia Classificação dos métodos cromatográficos Eluição em coluna cromatográfica Cromatogramas Resolução do cromatograma Variáveis - taxa de migração e alargamento da banda Eficiência das colunas Instrumentação e aplicações da cromatografia Cromatografia Gasosa (CG) Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Cromatografia - Histórico • Michael Tswett (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo CaCO3 mistura de pigmentos pigmentos separados Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego) Cromatografia - Princípios Cromatografia Introdução Descrição geral da cromatografia A cromatografia engloba um diversificado e importante grupo de métodos que permitem separar, identificar e quantificar componentes de uma mistura complexa. Em todas as separações cromatográficas tem-se: FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) Gás, líquido ou fluido supercrítico (solvente que percorre a coluna) Imobilizada em coluna ou sobre superfície plana Cromatografia Classificação dos métodos cromatográficos Dois tipos de classificação: 1. baseada no meio físico de contato entre as fases móvel e estacionária; 2. baseada nos tipos das fases móveis e estacionárias empregadas e no tipo de equilíbrio envolvido na transferência de solutos entre as fases ( classificação mais fundamental) Cromatografia 1. Classificação segundo o meio físico de contato entre as fases CROMATOGRAFIA EM COLUNA CROMATOGRAFIA PLANAR (cromat. de camada delgada, cromat. em papel e eletrocromatografia) Cromatografia - Princípios • Cromatografia em coluna – separação de diferentes substâncias pelo tempo de retenção (velocidade de interação) com a fase estacionária Cromatografia em coluna DETECTOR COLUNA RECHEA DA S IN A L TEMPO Amostra Fase móvel Cromatografia planar • Cromatografia em papel; • Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou cromatografia em camada fina: ▫ separação em placa; ▫ usa-se lâmina de vidro ou de plástico revestida por uma fina camada de material adsorvente (óxido de alumínio, sílica-gel, carvão ativado, óxido de magnésio, carbonato de cálcio, amido, sacarose) Cromatografia planar dR1 dR2 dR3 linha de partida da fase móvel linha de chegada da fase móvel dm profundidade da fase móvel Cromatografia 2. Classificação segundo o tipos de fase móvel e estacionária e tipo de equilíbrio (mecanismo de separação) 3 categorias gerais: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA; CROMATOGRAFIA GASOSA E CROMATOGRAFIA SUPERCRÍTICA Baseadas na natureza da fase móvel Mecanismos de separação • Físicos: adsorção e partição • Mecânicos: exclusão molecular • Químicos: troca iônica e afinidade Cromatografia Tabela 1. Segundo os tipos de fase móvel e estacionária e tipo de equibíbrio Pode ser realizada tanto em coluna como em superfície plana Fonte: SKOOG et al, 2006 Cromatografia Eluição em coluna cromatográfica A eluição é um processo no qual os solutos são lavados através da fase estacionária pelo movimento da fase móvel (chamada de eluente). Conceitos e terminologia Eluente é um solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através de uma fase estacionária. A fase móvel que deixa a coluna é chamada de eluato. Fonte: SKOOG et al, 2006 Eluição em coluna cromatográfica Definições • Cromatograma: resposta do detector como uma função do tempo (ou do volume de eluição) em uma separação cromatográfica. Cromatograma gasoso Cromatografia Cromatogramas Posição do pico no eixo do tempo: usadas para identificar os componentes da amostra Áreas sob os picos: fornecem uma medida quantitativa de uma função da concentração de cada um dos componentes da amostra Definições • Tempo e volume de retenção tR tM Tempo Si n al tR: tempo de retenção do analito, distância percorrida pela substância desde o instante da injeção da amostra até o máximo do pico (observado pelo detector). tM: tempo morto ou tempo de retenção da fase móvel. Componente que não interage com a fase estacionária. VR’ = VR - VM tR’ = tR - tM tR tM Tempo S in a l tR’ tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE) Definições • Tempo e volume de retenção ajustados Tempo de Retenção Ajustado, tR‘ - Parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito. Definições • Fator de retenção, k: parâmetro experimental empregado para comparação das velocidades de migração de solutos em colunas. tR tM Tempo S in a l tR’ 𝑘𝐴 = 𝑡𝑅 − 𝑡𝑀 𝑡𝑀 = 𝑡𝑅′ 𝑡𝑀 • kA 1 significa que o soluto emerge da coluna em um tempo próximo daquele de retenção da FM • kA > 20-30 – tempo de eluição muito longos • Ideal: 1 < kA < 5. (tR)B tempo (tR)A S in a l A B C injeção Definições • Fator de seletividade: razão entre as constantes de distribuição do soluto mais retido (B) e a do menos retido (A). ▫ Fornece uma medida de quão bem a coluna vai separá-los. 𝛼 = 𝐾𝐵 𝐾𝐴 = 𝑘′𝐵 𝑘′𝐴 = 𝑡𝑅′ 𝐵 𝑡𝑅′ 𝐴 sempre maior que a unidade Definições • A distribuição de um analito entre a fase estacionária e a fase móvel: • No equilíbrio os analitos se aproximam de um equilíbrio local, que ocorre no centro de seus picos cromatográficos. ▫ Substância que apresenta forte interação com a fase estacionária, terá grande KD – grande tempo de retenção. 𝐾𝐷 = 𝑎𝐴 𝐸 𝑎𝐴 𝑀 = 𝐶𝐸 𝐶𝑀 𝐴𝑚ó𝑣𝑒𝑙 ↔ 𝐴𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛á𝑟𝑖𝑎 Eficiência de separação • Separação de duas ou mais substâncias por cromatografia exige diferenças significativas em seus tempos de retenção. • Dois fatores contribuem para que os compostos sejam bem separados pela cromatografia: ▫ Resolução dos picos (distância entre os picos): quanto mais afastados, melhor a separação ▫ Alargamento dos picos (largura dos picos): quanto mais largos os picos, pior a separação. Cromatografia Cromatogramas Resolução de um cromatograma Depende da eficiência da coluna como dispositivo de separação Parâmetros importantes: Velocidade de separação das bandas e Alargamento das bandas Resolução de picos • Medida quantitativa da sua habilidade em separar os analitos A e B. 𝑅𝑠 = ∆𝑡𝑅 𝑊 𝑏 = ∆𝑍 𝑊𝐴 2 + 𝑊𝐵 2 = 2∆𝑍 𝑊𝐴 +𝑊𝐵 = 2 𝑡𝑅 𝐵 − 𝑡𝑅 𝐴 𝑊𝐴 +𝑊𝐵 Medidas de largura de banda: • Largura w na linha de base entre as tangentes traçadas • Largura w1/2 medida na altura igual à metade da altura de pico Resolução de picos • O soluto que se move através da coluna tende a se dispersar de acordo com uma distribuição gaussiana, com desvio padrão 𝑅𝑠 = ∆𝑡𝑅 𝑤 = 0,589∆𝑡𝑟 𝑤1/2 Pico gaussiano: w1/2 = 2,35 w = 4 Resolução para dois picos adjacentes Resolução de picos • Retenção Relativa = tR2´ / tR1´, onde onde tR2´> tR1´ quanto maior maior a separação entre dois componentes • Para a análise quantitativa, é altamente desejável uma Rs > 1,5. Alargamento de banda •A banda relacionada a um analito aumenta à medida que se desloca através de uma coluna cromatográfica ▫ Ideal: banda infinitamente estreita no início emerge com uma forma gaussiana na saída ▫ Três mecanismos de alargamento: caminhos múltiplos, tempo de equilíbrio e difusão longitudinal. Eficiência da separação • Resultado do processo de separação (distribuição entre as FE e FM) é um espalhamento simétrico de velocidades ao redor de um valor médio – distribuição normal - curva gaussiana. • Variância por unidade de comprimento da coluna é empregada como medida de eficiência 𝜎2 = 2𝐷𝑡 = 2𝐷 𝐿 𝑢𝑥 = 2𝐷 𝑢𝑥 𝐿 = 𝐻𝐿 Altura do prato H 𝐻 = 𝜎2 𝐿 Altura do prato é uma constante de proporcionalidade entre a variância da banda e a distância que ela percorreu. Eficiência da separação • Altura de prato é aproximadamente , o comprimento da coluna necessário para que o soluto atinja um equilíbrio entre a fase móvel e a estacionária. ▫ Quanto menor a altura de prato, menor a largura da banda ▫ A eficiência de separação de uma coluna aumenta com a diminuição da altura de prato ▫ Solutos diferentes passando através da mesma coluna possuem alturas de pratos diferentes, pois tem coeficientes de difusão diferentes ▫ 0,1 a 1mm para CG e 10 m para CLAE. Eficiência da coluna • Dois termos são empregados para medidas quantitativas da eficiência da coluna: ▫ Altura de prato H ▫ Número de pratos teóricos N Os dois parâmetros estão relacionados pela equação: 𝑁 = 𝐿 𝐻 Onde L = comprimento do recheio da coluna Eficiência aumenta à medida que o número de pratos se torna maior conforme a altura de pratos se torna menor. Cromatografia Formas de aumentar a eficiência de uma coluna - controle de variáveis que: - aumentam a velocidade de separação das bandas e - diminuem a velocidade de alargamento das bandas Cromatografia •Na cromatografia gasosa kA Pode ser modificado alterando-se a temperatura e o recheio da coluna (a) Isotérmico a 45ºC (b) Isotérmico a 145ºC (c) Programado de 30ºC a 180ºC Cromatografia •Na cromatografia líquida kA Pode ser manipulado por meio da variação da composição das fases móvel e estacionária Cromatografia Bibliografia SKOOG, D.A; LEARY, J.J. Principles of Instrumental Analysis. 4 th edition. Fort Worth:Saunders College Publishing,1992. SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.. Fundamentals of Analytical Chemistry. 7 th Edition. Fort Worth:Saunders College Publishing., 1996. SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R.. Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição norte- americana. São Paulo:Thomson Learning., 2006.