17-+Prática+Coombs

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DISCIPLINA DE HEMATOLOGIA CLÍNICA 
PROFESSORA: ELAINE GROPP 
 
NOÇÕES DE IMUNOHEMATOLOGIA 
 
 São conhecidos mais de 270 antígenos diferentes no ERI, além do ABO e Rh  proteínas ou outras 
biomoléculas ligadas à membrana do ERI  grande diversidade antigênica. 
 
 Com base na distribuição dos grupos sanguíneos determinados por estes antígenos nas famílias e 
populações  os grupos são reunidos em SISTEMAS. 
 
o 2 ou mais grupos sanguíneos constituem um sistema quando os antígenos por eles responsáveis 
estão relacionados a um grupo comum de alelos. 
 
 Existem mais de vinte sistemas sanguíneos: ABO, MNS, P, Rh, Lutheran (Lu), Kell, Lewis (Le), Duffy (Fy), 
Kidd (Jk), Diego (Di), Yt (Cartwright), Xg, Scianna (Sc), Dombrock (Do), Colton (Co), Landesteiner-Wiener 
(LW), Chido/Rogers (Ch/Rg), Hh (H), Kx (Xk), Gerbich (Ge), Cromer (Crom), Knops (Kn), Indian (In), Ok e 
Raph. 
 
 Transfusões ABO/Rh(D) compatíveis  98% de sucesso ( Hb do receptor). 
 
 ANTÍGENOS PÚBLICOS  Comuns a todos os seres humanos 
 ANTÍGENOS FAMILIARES (ou privados) Extremamente raros 
 
 A intensidade das reações AGxAC é variável de indivíduo para indivíduo e é dependente do: 
o TIPO e ESPECIFICIDADE do AC 
o REVERSIBILIDADE da ligação  forças de interação molecular fracas (não covalentes). 
o ESTABILIDADE da ligação (equilíbrio de associação química) 
o TERMODINÂMICA da reação  AC frios e quentes. 
 
 Não necessariamente um indivíduo produz AC contra AG que não possui  depende da 
IMUNOGENICIDADE do AG (capacidade do AG estimular a síntese de AC) e da ANTIGENICIDADE do AC 
(capacidade do AC de ligar-se facilmente ao AG) 
 
 Os AC contra AG eritrocitários são ESPECÍFICOS  fixam-se em sítios antigênicos determinados, com os 
quais reagem especificamente (ex: um AC anti-A nunca reagirá contra um antígeno diferente do A). 
 
 Nas REAÇÕES in vitro têm-se: 
 
- 1ª ETAPA  hemácias SENSIBILIZADAS: AC ligado ao sítio eritrocitário. 
- 2ª ETAPA  Aglutinação (quando AC é uma AGLUTININA) ou Hemólise (quando o AC é uma 
HEMOLISINA) 
 
OBSERVAÇÃO: Um AC pode sensibilizar os ERI a TA e provocar hemólise somente a 37ºC, ou ainda, 
sensibilizar os ERI em solução salina, mas somente produzir a aglutinação com a adição de soro humano 
ou solução de albumina bovina ou humana a 22% (meio protéico). 
 
 AC NATURAIS  Se formam num indivíduo sem aparentemente ter havido previa exposição ao AG (sem 
imunização prévia), provavelmente por exposição a alimentos e microrganismos após o nascimento (AG 
estão amplamente distribuídos na natureza). Ex: AC do sistema ABO. 
 
São geralmente IgM (ABO): 
 
 Moléculas grandes, não atravessam placenta, geralmente não causam reação imune perinatal. 
 
 Quando há contato com AG há ativação de complemento e hemólise intravascular (10 mL de SG 
transfundido em receptor ABO incompatível pode levar a óbito). 
 
 Reagem melhor com AG a temperaturas < 37ºC (podendo inclusive não reagir in vivo) AC FRIOS 
 
  Se o tempo de exposição ao AG for prolongado, os IgM são gradualmente substituídos por IgG. 
 
  São capazes de aglutinar in vitro ERI com AG correspondente, tanto em solução salina como em meio 
protéico  AC COMPLETOS ou SALINOS. 
 
 AC IMUNES  ocorrem após a inoculação parenteral de ERI contendo AG que não estão presentes nos ERI 
do receptor (AG não próprio). São tão numerosos quanto maior a diversidade entre os AG do doador e do 
receptor. 
 
São geralmente IgG (Rh): 
 
 Moléculas pequenas, atravessam a placenta  doença hemolítica perinatal é perigosa. 
 
 Maioria das IgG é identificada pelo teste de COOMBS INDIRETO (cerca de 25 tipos de IgG mais raras não 
são identificados pelo teste usual) 
 
 Alguns tipos de IgG ativam complemento, mas a maioria produz hemólise extravascular e somente 
depois de novo contato com AG (após sensibilização prévia)  segunda gestação ou transfusão. 
 
 Reagem melhor com AG a temperaturas de 37ºC (mas podem reagir também em temperaturas 
inferiores) AC QUENTES 
 
 São incapazes de aglutinar ERI in vitro em solução salina, apenas sensibilizam o ERI (somente ocorre 
aglutinação em meio protéico: dissipa carga elétrica do ERI)  AC INCOMPLETOS, AC BLOQUEADORES 
ou AC ALBUMÍNICOS 
 
 AUTO-ANTICORPO  AC do indivíduo contra antígeno do mesmo indivíduo (desregulação imune). 
 
 HALO-ANTICORPOS  AC de um indivíduo contra antígeno não próprio, porém de indivíduo da mesma 
espécie. 
 
 AC HETERÓFILO  AC proveniente de indivíduo de outra espécie que reage contra AG humano (ex: coelho, 
cavalo)  SORO DE COOMBS (antiglobulina humana). 
 
 AC REGULARES  De ocorrência esperada em dada população: ex: anti-A, anti-B, anti-AB. 
 
 AC IRREGULARES  Ocorrência não é esperada  incomuns. 
- AC formados por aloimunização após transfusão normalmente tem importância clínica, porém os formados 
naturalmente sem nenhuma razão prévia específica geralmente não tem valor clínico. 
 
- Quanto mais transfusões um indivíduo recebe, maior a chance deste desenvolver AC irregulares e rejeitar o 
mesmo sangue na transfusão seguinte. 
 
 
PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES (PAI) – TESTE DE COOMBS INDIRETO 
 
 Pesquisa de AC contra proteínas de membrana de eritrócitos (em especial anti-D), em exames pré-
transfusionais ou pré-natais (quando mãe for Rh -). 
 
 
 
 
 Acompanhamento de pacientes sensibilizados por antígenos de qualquer sistema imunohematológico, 
principalmente do sistema Rh. 
 
 Recomenda-se a utilização de suspensões comerciais de hemácias do grupo “O” a 3%, que devem permitir a 
detecção dos AC clinicamente relevantes no soro do paciente em teste (Rh, Duffy, Kidd, MNS, Lewis, KEL3). 
 
MATERIAL BIOLÓGICO: soro (plasma) 
CONSERVAÇÃO: refrigerar (máx. 48h) ou congelar (-20ºC) 
 
REAGENTES: 
- Soro de Coombs (soro antiglobulina humana poliespecífico) 
- Albumina bovina a 22% 
- Solução salina 0,9% 
- Hemácias-teste I e II (comerciais) 
 
PROCEDIMENTO: 
 
1) AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE ANTICORPOS COMPLETOS: 
 
A) FASE SALINA: 
 
1) Identificar 2 tubos de ensaio com o nome e nº do paciente  TUBO I e II 
2) Em cada tubo, colocar 100 L do soro do paciente. 
3) Adicionar aos tubos I e II: 
- 1 gota de hemácias-teste I no tubo I 
- 1 gota de hemácias-teste II no tubo II 
 
OBS 1: Se a pesquisa for destinada a investigar AC no soro de um receptor que responderão a antígenos nos 
eritrócitos de um doador (PROVA CRUZADA)  fazer um terceiro tubo colocando 1 gota da suspensão de 
hemácias a 3% do doador no lugar da hemácia-teste  resultados positivos indicam incompatibilidades 
transfusionais. 
 
OBS 2: É recomendável a realização de um tubo autocontrole com 1 gota de suspensão de hemácias do 
próprio paciente no lugar das hemácias-teste  deve dar resultado NEGATIVO. 
 
OBS 3: É recomendável a realização de tubos soro controle positivo com 100 L de soro controle 
comercial (ex: Coombs Control IgG - DiaMed) no lugar do soro do paciente nos tubos com hemácias-teste I 
e II  devem dar resultado POSITIVO. 
 
4) Homogeneizar e aguardar 5’ TA. 
5) Centrifugar por 1 minuto a 1.000 rpm. 
6) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias e verificar a presença de aglutinação e/ou hemólise. 
Aglutinação/hemólise presente  Teste de Coombs positivo 
Aglutinação/hemólise ausente  Pesquisar anticorpos incompletos - continuar reação (item 7) 
 
2) AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE ANTICORPOS INCOMPLETOS: 
 
B) FASE ALBUMINA 
 
7) Adicionar 3 gotas de albumina bovina 22% aos tubos I e II. 
8) Homogeneizar e incubar 15’ em B-M 37 ºC. 
9) Centrifugar por 1 minuto a 1.000 rpm. 
10) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias formado e verificar a presença de aglutinação. 
Aglutinação presente  Teste de Coombs positivo 
Aglutinação ausente  continuar reação (item 11) 
 
C) FASE COOMBS (avaliação da presença de anticorpos incompletos): 
 
11) Lavar o conteúdo dos tubos I e II 3 vezes com solução salina 0,9%: marcar volume nos tubos, centrifugar por 
2’ a 1.000 rpm, retirar o sobrenadante após cada etapa da lavagem, ressuspendero botão e completar 
novamente o volume com salina até a marca. 
13) Pipetar 100 L (2 gotas) do soro de Coombs em cada tubo e homogeneizar. 
14) Centrifugar 2’ a 1.000 rpm 
14) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias formado e verificar a presença de aglutinação. 
Aglutinação presente  Teste de Coombs positivo 
Aglutinação ausente  Teste de Coombs negativo 
 
INTERPRETAÇÃO: 
 
- Reação NEGATIVA os tubos com as hemácias-teste I e II e NEGATIVA no tubo “autocontrole” indica ausência de 
anticorpos irregulares detectáveis no soro ou plasma do paciente ou doador. 
 
- Reação POSITIVA em um ou ambos os tubos com as hemácias-teste e NEGATIVA no tubo “autocontrole” indica 
sensibilização prévia do paciente (presença de AC irregulares). 
 
- Reação POSITIVA em ambos os tubos com as hemácias-teste e POSITIVA no tubo “autocontrole” indica presença 
de auto-anticorpos  FAZER COOMBS DIRETO. 
 
- Reação POSITIVA em ambos os tubos com as hemácias-teste e POSITIVA no tubo “autocontrole”, sendo a reação 
no tubo “autocontrole” menos intensa que a das hemácias-teste pode indicar a presença de alo-anticorpos (AC 
irregulares) mascarados por auto-anticorpos  FAZER COOMBS DIRETO. 
 
 
LIMITAÇÕES: 
 
Reações F(-): 
- Presença de AC irregular não detectável pela hemácia-teste utilizada. 
- Lavagem incorreta ou presença de globulinas humanas nos tubos podem neutralizar o soro de Coombs 
- Agitação inadequada 
 
Reações F(+): 
- Medicamentos 
- Quadro infeccioso ou outras condições patológicas com produção de AC 
- Excesso de centrifugação 
 
 
PESQUISA DE ANTICORPOS E COMPLEMENTO NA MENBRANA DE ERITRÓCITOS – TESTE DE COOMBS 
DIRETO 
 
 
 Pesquisa de AC aderidos aos eritrócitos (hemácias sensibilizadas) em sangue de recém-natos com suspeita de 
eritroblastose fetal  anemias hemolíticas do recém-nascido por incompatibilidade ABO ou Rh. 
 Investigação de processos hemolíticos  anemias hemolíticas adquiridas 
 Avaliação de transfusões incompatíveis 
 
MATERIAL BIOLÓGICO: sangue total (EDTA) 
CONSERVAÇÃO: utilizar amostras recém-colhidas 
 
REAGENTES: 
- Soro de Coombs (soro antiglobulina humana poliespecífico) 
- Hemácias “O” Rh D (+) a 3% em salina ou hemácias-teste I comercial 
- Solução salina 0,9% 
 
 
PROCEDIMENTO: 
 
1) Tomar 2 tubos de ensaio e identificar: 
 a) TUBO TESTE (colocar nome e nº de identificação do paciente) 
 b) TUBO CONTROLE (-) 
 
2) Preparar uma suspensão a 5% de hemácias do paciente. 
 - 1 ml salina + 50 L de sangue do paciente 
 
OBS: Fazer o mesmo com uma amostra conhecida “O” Rh D (+) ou hemácias-teste I comercial  
CONTROLE NEGATIVO 
 
3) Lavar a suspensão de hemácias do paciente e de hemácias “O” Rh D (+) com salina por 3 vezes, utilizando 
centrifugação de 1.000 rpm por 1’ em cada etapa da lavagem. Ao final, desprezar completamente o 
sobrenadante (ficar somente com a papa de hemácias). 
 
 lavagem é necessária para que se retire do meio reacional proteínas que podem promover falsa 
aglutinação (garantir que só sobrem hemácias com os AC adsorvidos). 
 
3) Transferir 100 L da papa de hemácias lavadas do paciente para o TUBO TESTE. 
4) Transferir 100 L da papa de hemácias lavadas “O” Rh D (+) para o TUBO CONTROLE (-). 
 
6) Colocar 2 gotas de soro de Coombs poliespecífico nos dois tubos  homogeneizar 
 
7) Incubar os tubos em B-M 37 ºC por 15’ 
 
8) Centrifugar por 1 minuto a 1.000 rpm. 
 
9) Ressuspender delicadamente o botão de hemácias formado e verificar a presença de aglutinação: 
 
Aglutinação presente  Teste de Coombs positivo 
Aglutinação ausente  Teste de Coombs negativo 
 
OBS: O TUBO CONTROLE (-) não deve aglutinar. 
 
INTERPRETAÇÃO: Resultados positivos indicam presença de AC adsorvidos às hemácias  sensibilização prévia 
dos eritrócitos. 
 
REAÇÕES (+) PRODUZIDAS POR OUTRAS CONDIÇÕES DO PACIENTE: 
 
- Medicamentos: metildopa, levodopa, ácido mefenâmico, penicilina, cefalosporinas, quinina, digitálicos e insulina. 
- Mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldeström.