aula 4

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Prof. Me. Augusto César R. Araújo
UNIDADE 04 –VALIDAÇÃO DE 
METODOLOGIA ANALÍTICA
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 INTRODUÇÃO A VALIDAÇÃO
 PRINCÍPIOS E DOCUMENTAÇAO DE 
VALIDAÇÃO
 PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 CÁLCULOS DE VALIDAÇÃO
UNIDADE 04 –VALIDAÇÃO DE 
METODOLOGIA ANALÍTICA
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INTRODUÇÃO A 
VALIDAÇÃO
INTRODUÇÃO A VALIDAÇÃO
A validação de métodos analíticos comprova através de
evidências objetivas que requisitos para uma determinada
aplicação ou uso específico são atendidos;
Pode ser definida como o processo que confere validade a
um método analítico, instrumento ou equipamento, cujas
especificações são aceitas como corretas, conferindo
confiabilidade aos resultados obtidos
Ter validado um resultado significa que o procedimento,
que inclui desde as condições de operação do equipamento
até toda a seqüência analítica, seja aceito como correto.
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INTRODUÇÃO A VALIDAÇÃO
Estabelecem-se níveis de exigência que podem definir a
aprovação do produto ou espécie em estudo;
Fundamental que os laboratórios disponham de meios e
critérios objetivos para demonstrar que os métodos que
utilizam conduzem a resultados confiáveis, que garantam
qualidade, idoneidade e credibilidade de seus produtos e/ou
serviços
Qualquer alteração de métodos normalizados implica em
revalidar o método
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INTRODUÇÃO A VALIDAÇÃO
O laboratório precisa demonstrar que tem condições de
aplicar de maneira adequada estes métodos normalizados,
dentro das condições específicas existentes nas suas
instalações antes de implantá-los.
A conformidade dos métodos normalizados utilizados deve
ser verificada sob condições reais de uso.
É responsabilidade do laboratório verificar se as
características de desempenho prescritas no método oficial
podem ser obtidas
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INTRODUÇÃO A VALIDAÇÃO
A validação deve ser efetuada após seleção,
desenvolvimento, e otimização dos métodos.
O procedimento operacional padrão deve ser claro,
objetivo, completo aprovado, autorizado e revisado pelo
grupo de garantia da qualidade da empresa.
O uso de testes estatísticos adequados (t de Student,
Fisher,Cochran, Grubbs, ANOVA, testes de hipóteses)
torna as decisões menos subjetivas
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PRINCIPIOS E 
DOCUMENTAÇÃO DE 
VALIDAÇÃO
PRINCÍPIOS E DOCUMENTOS DE 
VALIDAÇÃO
As medições efetuadas no laboratório devem prover dados
analíticos comparáveis e consistentes, para a eliminação de
barreiras técnicas entre os países.
Deve atender requisitos legais, de certificação e de
acreditação, ou seja, uma vez efetuada a medição esta é
aceita em qualquer país.
As normas internacionais (ISO, USP, FDA, AOAC,
NATA,ASTM) e sistemas da qualidade (Boas práticas de
laboratório; ISO/IEC 17025) requerem a validação de
métodos analíticos e a documentação do trabalho de
validação.
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PRINCÍPIOS E DOCUMENTOS DE 
VALIDAÇÃO
Importante documentar os procedimentos de forma que o
método possa ser implementado de maneira clara e sem
ambiguidades;
A documentação apropriada auxilia na aplicação
consistente do método, já que, uma vez implantado o
método, ele será sempre executado conforme descrito;
Caso contrário o desempenho real do método não irá
corresponder àquele previsto nos dados de validação.
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PRINCÍPIOS E DOCUMENTOS DE 
VALIDAÇÃO
Documentações que registrem etapas da validação são
necessárias também para fins de avaliação e podem ser
exigidas por razões contratuais ou até mesmo por
organismos regulamentadores
A sistemática de controle de documentos do laboratório
deve permitir a retirada de circulação dos documentos
obsoletos e emissão de métodos revisados;
As alterações devem ser realizadas somente por pessoas
autorizadas
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PARÂMETROS DE 
VALIDAÇÃO
PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Especificidade e seletividade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente
um composto específico independente da matriz da amostra
e de suas impurezas.
Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário
demonstrar a capacidade de seleção do método entre
compostos com estruturas relacionadas que podem estar
presentes
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Especificidade e seletividade
A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao
evento da detecção;
A especificidade refere-se a um método específico para um
único analito;
Seletividade refere-se a um método utilizado para vários
analitos com capacidade de distinção entre ele.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Especificidade e seletividade
Os testes de especificidade têm como objetivo determinar
os componentes que precisam ser analisados na amostra,
para isso, é necessário definir a matriz, assim com os
possíveis interferentes;
Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas, a
especificidade pode ser determinada pela comparação dos
resultados obtidos de amostras contaminadas com
quantidades apropriadas de impurezas ou amostras não
contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste não
é afetado por esses materiais.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Especificidade e seletividade
A matriz da amostra pode conter componentes que
interferem no desempenho da medição pelo detector
selecionado, sem causar um sinal visível no teste de
especificidade.
Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal, e a
magnitude do efeito também pode depender da
concentração.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Especificidade e seletividade
Para fazer o teste de seletividade podem ser utilizados
diversos testes, depende da disponibilidade do analito, da
matriz sem o analito e de amostras de referência nas
concentrações de interesse;
Podem ser aplicados os teste F(Snedecor) de
homogeneidade de variâncias e o teste t(Student) de
comparação de médias.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho
Em qualquer método quantitativo , existe uma faixa de
concentrações do analito no qual o método pode ser
aplicado.
Os primeiros valores da faixa podem ser dos valores dos
limites de detecção e de quantificação e os últimos
dependem do sistema de resposta do equipamento de
medição.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho
A faixa linear é definida como a faixa de concentrações na
qual a sensibilidade pode ser considerada constante e são
normalmente expressas nas mesmas unidades do resultado
obtido pelo método analítico;
Para escolher a faixa de trabalho quando se tem uma
amostra específica, a concentração esperada deve se situar
no meio da faixa de trabalho e quando a concentração do
analito é desconhecida utiliza-se a faixa de trabalho
estudada para amostras diversificadas.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar
que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à
concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado;
A linearidade é obtida por padronização interna ou externa
e formulada como expressão matemática (equação da
regressão linear) usada para o cálculo da concentração do
analito a ser determinado na amostra real
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Linearidade
O coeficiente de correlação linear (r) é frequentemente
usado para indicar a adequabilidade da curva como modelo
matemático.
Um valor maior que 0,90 é, usualmente, requerido.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Sensibilidade
É um parâmetro que demonstra a variação da resposta em
função da concentração do analito.
Pode ser expressa pela inclinação da curva de regressão
linear de calibração, e é determinada simultaneamente aos
testes de linearidade.
A sensibilidade depende da natureza do analito e da
técnica de detecção utilizada
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Limite de detecção
• É a menor quantidade do analito presente em uma amostra que
pode ser detectada, porém não necessariamente quantificada,
sob as condições experimentais estabelecidas.
métodos não instrumentais É o menor valor de concentração
capaz de produzir o efeito esperado (mudança de cor, turvação,
etc).
métodos instrumentais– Se baseia na relação de 3 vezes o
ruído da linha de base.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Limite de quantificação
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode
ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as
condições experimentais estabelecidas.
Onde o limite de quantificação é estabelecido por meio da
análise de soluções contendo concentrações decrescentes
do analito até o menor nível determinável com precisão e
exatidão aceitáveis
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Exatidão e tendência (bias)
A exatidão de um método analítico é verificada quando são
obtidos resultados muito próximos em relação ao valor
verdadeiro
A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação
da quantidade conhecida do analito adicionado à amostra,
ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor
verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiança
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Exatidão e tendência (bias)
Deve ser determinada após o estabelecimento da
linearidade, do intervalo linear e da especificidade do
mesmo;
No mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o
intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três)
concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas
cada.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Exatidão e tendência (bias)
A tendência implica numa combinação de componentes de
erros aleatórios e sistemáticos, onde a determinação da
tendência total com relação aos valores de referência
apropriados é importante no estabelecimento da
rastreabilidade aos padrões reconhecidos.
A tendência pode ser expressa como recuperação analítica
(valor observado / valor esperado).
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Precisão
É a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em
uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma
mesma amostra,
As duas formas mais comuns de expressá-la são por meio
de repetitividade e reprodutividade expressa pelo desvio
padrão
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Precisão
Ambas repetitividade e reprodutibilidade são geralmente
dependentes da concentração do analito;
Devem ser determinadas para um diferente número de
concentrações; em casos relevantes, a relação entre
precisão e concentração do analito deve ser estabelecida;
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Precisão
Repetitividade é a precisão intra-corrida, ou seja o grau de
concordância entre os resultados de medições sucessivas,
efetuadas sob as mesmas condições de medição.
Todas as medições com o mesmo procedimento; mesmo
analista; mesma instrumentação, dentro de um curto período de
tempo.
A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em termos
da característica da dispersão dos resultados
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Precisão
Reprodutibilidade é a precisão interlaboratorial, ou seja, o
grau de concordância entre os resultados obtidos em
laboratórios diferentes como em estudos colaborativos.
É considerada importante quando um laboratório busca a
verificação do desempenho dos seus métodos em relação
aos dados de validação obtidos através de comparação
interlaboratorial.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Precisão
Precisão intermediária é a precisão intercorridas, ou seja,
refere-se à concordância entre os resultados do mesmo
laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas
diferentes e/ou equipamentos diferentes.
Para a determinação da precisão intermediária recomenda-
se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Precisão
A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de
amostras adicionadas com quantidades conhecidas do
mesmo (spike).
As amostras podem ser adicionadas com o analito em pelo
menos três diferentes concentrações.
A limitação deste procedimento é a de que o analito
adicionado não está necessariamente na mesma forma que
apresente na amostra
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Robustez
Um método de ensaio mede a sensibilidade que este
apresenta face a pequenas variações.
Um método diz-se robusto se revelar praticamente
insensível a pequenas variações que possam ocorrer
quando esse está sendo executado.
Para determinar a robustez de um método de ensaio, pode-
se recorrer ao teste de Youden.
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Incerteza de medição
Os estudos de validação produzem dados de desempenho
global do método e fatores de influência individuais que
podem ser aplicados à estimativa da incerteza associada
aos resultados do método em rotina
Através desses dados é possível calcular as variações
sofridas pelo método e determinar a incerteza, ou seja,
quanto o meu resultado vai variar para mais ou para menos
numa determinada faixa de trabalho com uma determinada
matriz
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PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO
 Incerteza de medição
Após essa etapa, o método pode ser considerado validado e
passar para o processo de acreditação, onde todos os
parâmetros da validação serão avaliados pelo órgão
certificador responsável.
A manutenção da validação do método também será
analisada através do uso de padrões de verificação e de
participação em estudos interlaboratoriais.
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CÁLCULOS DE 
VALIDAÇÃO
CÁLCULOS DE VALIDAÇÃO
 Exemplo 01
A validação de doseamento de nimesulida em cápsulas
através de espectrofotometria de absorção no ultravioleta
obteve os seguintes valores:
Amostra 01 – 103mg
Amostra 02 – 100mg
Amostra 03 – 105mg
Determinar o que se pede a seguir:
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CÁLCULOS DE VALIDAÇÃO
 Exemplo 01
a) A média dos valores
b) O desvio padrão dos valores
c) Precisão
d) Exatidão
e) Limite de detecção
f) Limite de quantificação
g) Recuperação. Sabendo que o valor inicial foi de 98mg e
o valor final foi de 90mg
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CÁLCULOS DE VALIDAÇÃO
 Exemplo 01
a) x =∑x / n
b) s = √ ∑(xi – x) / n-1
c) p = x±s
d) e = Vr - x
e) LD = x + ts
f) LQ = x + 10s
g) Recuperação. Sabendo que o valor inicial foi de 98mg e
o valor final foi de 90mg
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