Exercícios sobre métodos de análise de proteínas - Kjeldahl, Biureto, etc.

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Exercícios sobre métodos de análise de proteínas - Bromatologia
Farmácia – FM7A-12 - Matutino
Eliezer Duarte Gonçalves 
RA: D28142-9
2. Explique sobre a metodologia de análise espectrofotométrica de proteínas na região UV. Fale das vantagens de desvantagens dessa metodologia.
Este método é baseado no fato de que as proteínas mostram absorção na região de 280 nm e na região abaixo de 220 nm, sendo a primeira devido a diversos aminoácidos (fenilalanina, cisteína, cistina, metionina, triptofano, histidina e tirosina), e a segunda devido à ligação peptídica. No entanto, em 280 nm, em pH neutro, somente os aminoácidos triptofano, tirosina e cistina possuem uma absortividade molar significativamente grande.
Aplicações
O método tem sido muito utilizado durante os procedimentos de purificação e separação de proteínas para a quantificação delas. Suas principais vantagens são as de não destruir a amostra e de ser rápido; na literatura raramente são descritas outras aplicações além desta. O principal motivo desta limitação é que, em amostras complexas, diversas substâncias absorvem no ultravioleta tornando os resultados pouco confiáveis.
Interferentes
Este método está sujeito a muitos interferentes, sendo que qualquer substância que apresente uma banda de absorção na região de leitura é um interferente em potencial. Este fato fez com que esta metodologia fosse utilizada somente em processos de purificação de proteínas, onde uma avaliação semi-quantitativa é suficiente, na maioria dos casos.
3. Explique o método Biureto, falando de suas vantagens e desvantagens.
Princípio
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificações dele, sendo, atualmente, a proposta metodológica de Gornall e cols. a mais utilizada.
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols. O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método.
Aplicações
O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro espinhal (líquor), urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. O método de biureto tem sido, também, utilizado em análise por injeção em fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método não é muito sensível, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma sanguíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos autores, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva e leite, quando comparado com outros métodos.
Interferentes
Verifica-se que o método de biureto está sujeito à interferência de substâncias que possam reagir com os íons cobre (II). Os métodos para sua eliminação variam conforme o caso, no entanto, é recomendado a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e posterior solubilização para determinação delas.
4. Em que é fundamentado método de Kjeldahl.?
Este método fundamenta-se na destruição da matéria orgânica com ácido sulfúrico concentrado, em presença de uma catalisador e por ação do calor, com posterior destilação e titulação do Nitrogênio proveniente da amostra.
O método de Kjeldahl é utilizado para para determinar o nitrogênio contido numa substância orgânica. O nitrogênio orgânico transforma-se em amoníaco por digestão com ácido sulfúrico e posterior alcanização da solução. O amoníaco libertado destila-se e recolhe-se num volume conhecido de ácido padrão. Medindo o excesso de ácido por titulação sabe-se a quantidade de nitrogênio presente na substância original.
5. Explique cada uma das três etapas dessa metodologia.
Digestão: e. A digestão baseia-se no aquecimento da amostra com ácido sulfúrico até que os compostos orgânicos sejam oxidados. O N da proteína (orgânico) é reduzido e transformado em sulfato de amônia (inorgânico) que é uma substância estável, porém não facilmente quantificável. 
Destilação: Nessa etapa utiliza-se uma mistura digestora, composta de um sal (sulfato de sódio ou de potássio) com a finalidade de elevar o ponto de ebulição do ácido sulfúrico permitido a decomposição da matéria orgânica, e um catalizador metálico que aumenta o poder de oxidação do meio. 
Titulação: após a etapa de destilação, adiciona-se hidróxido de sódio concentrado e aquece-se para a liberação da amônia em solução de ácido bórico, formando borato ácido de amônia que constitui forma quantificável do N. O borato de amônia formado é titulado com uma solução padronizada de ácido clorídrico.
Em muitos laboratórios estão sendo implementados fundamentos de controle de qualidade para se ampliar a exatidão e a precisão dos resultados produzidos. Para auxiliar nesta meta torna-se importante que os métodos oficialmente aprovados sejam adotados para que a tecnologia avaliada seja empregada nos laboratórios de modo que os resultados produzidos possam ser comparados.