04_Proteínas_cinética enzimática

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Bioquímica 
Enzimas 
Classificação, cinética e controlo 
 As enzimas conhecidas pertencem a seis 
classes principais 
 considerando o tipo de reacção que catalisam 
 
Enzimas - classificação 
 
Enzimas - classificação 
2 
Enzimas - classificação 
1. Oxidoredutases 
Desidrogenases 
Oxidases 
Redutases 
Peroxidases 
Hidrolases 
3. Hidrolases 
Estereases 
Glicosidases 
Peptidases 
Fosfatases 
Tiolases 
Fosfolipases 
Amidases 
Deaminases 
Ribonucleases 
4. Liases 
Descarboxilases 
Aldolases 
Hidratases 
Dehidratases 
Sintases 
Liases 
6. Ligases 
Sintetases 
Carboxilases 
2. Transferases 
Transaldolase e 
Transcetolase 
Acil, metil, glucosil, 
fosforil Transferases 
Fosfomutases 
5. Isomerases 
Racemases 
Epimerases 
Isomerases 
Mutases 
 As enzimas conhecidas pertencem a seis 
classes principais 
 considerando o tipo de reacção que catalisam 
 
 É usado um sistema numérico com 4 algarismos 
(IUBMB) 
 o 1º define o tipo de reacção 
 nomes arbitrários 
 aldolase / lisosima 
 nomes sistemáticos 
 alcoól desidrogenase 
Enzimas - classificação 
Enzimas - classificação 
 Nomenclatura IUBMB 
 1.1.1.1. - alcóol desidrogenase 
 
Reacção de oxidação redução 
Remoção de H- e formação de NADH 
Alcóol é o substrato 
Enzima/substrato 1.1.1.27. - lactato desidrogenase 
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 São proteínas específicas que catalisam 
reacções biológicas 
 Associação de proteínas com moléculas 
acessórias não proteícas - grupo prostético 
 metais ou cofactores 
Enzimas 
Catalisadores biológicos 
 Não são consumidas durante 
a reacção 
 
 
 Reconhecem uma estrutura 
específica e formam um 
produto “único” 
 
Catalisadores biológicos 
 Aceleram a velocidade da reacção 
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Catalisadores biológicos 
 Específicas e com elevado poder catalítico 
 
 complementariedade enzima / substrato 
 
 sítio activo - local da reacção 
Catalisadores biológicos 
 Ligação do substrato 
 
 Chave-fechadura 
 o sítio activo é uma entidade 
rígida 
 só um substrato com essa 
forma “cabe” 
 
 Forma induzida 
 o sítio activo é flexivel 
 a conformação é alterada 
após ligação do substrato 
Cinética enzimática 
 Expressa em termos matemáticos a velocidade a 
que decorre uma reacção química 
 
 Segue-se a formação dos produtos 
 
 
 
 
 
 k - constante de velocidade específica para cada reacção 
 relacionada com a energia de activação (estado de 
transição) 
 alterada por: adição de catalisadores, mudança de pH 
ou composição do sistema 
A + B P 
k 
- dA/dt = k[A] - dB/dt = k[B] dP/dt = k[A] [B] 
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Reacções de um substrato 
 Modelo de Michaelis-Menten 
 E + S ES E + P 
k1 
k2 
k3 
dP/dt = k3[ES] 
 
v = k3[ES] 
v = Vmax [S] 
 [S] + kM 
[S] pequena v à [S] 
 
[S] grande v independente de [S] 
┴ 
Modelo de Michaelis-Menten 
 Presupostos 
 
 ES é intermediário da reacção 
 Nenhum produto reverte a 
substrato 
 Condições de estado 
estacionário 
 vformação(ES) = vquebra(ES) 
 
 [S] >> [E] 
 [S] ≈ [S0] 
 [ET] = [E] + [ES] 
Modelo de Michaelis-Menten 
 Dedução da equação de velocidade 
E + S ES E + P 
k1 
k2 
k3 
dP/dt = k3[ES] v = k3[ES] 
vformação(ES) = k1[E] [S] = vquebra(ES) = (k2+k3) [ES] 
kM =k2+k3/k1 
[ES] =([ET] – [ES]) [S] /kM 
[ET] = [ES]*kM/[S] [ES] + [ES] 
[ET] = [E] + [ES] 
[ES] = [E] [S] = [E] [S] 
 (k2+k3)/k1 kM 
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Sítios activos todos preenchidos 
[S] >> kM 
 
([S] / [S] + kM ) ≈ 1 
Modelo de Michaelis-Menten 
 Dedução da equação de velocidade (cont.) 
E + S ES E + P 
k1 
k2 
k3 
dP/dt = k3[ES] v = k3[ES] 
Vmáx = k3 [ET] 
[ES] =([ET] – [ES]) [S] /kM 
[ES] = [ET] [S] 
 [S] + kM 
v = k3 [ET] [S] 
 [S] + kM 
Modelo de Michaelis-Menten 
 Significado dos parâmetros cinéticos 
 
 
 
 
 
 
 
 kM - mede a afinidade enzima-substrato 
 Vmáx - velocidade máxima / todos os sítios activos 
preenchidos 
E + S ES E + P 
k1 
k2 
k3 
v = Vmáx [S] 
 [S] + kM 
Vmáx = k3 [ET] kM =k2+k3/k1 
 Determinação dos parâmetros cinéticos 
 
v = Vmáx [S] 
 [S] + kM 
1 = 1 + kM * 1 
v Vmáx Vmáx [S] 
Y = b + m X 
Modelo de Michaelis-Menten 
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Inibidores 
 Moléculas que se ligam às 
enzimas e bloqueiam a 
sua actividade enzimática 
 Inibidores reversíveis 
 não sofrem reacção 
quando ligados à enzima 
 removíveis por diluição ou 
diálise 
 
 Inibidores irreversíveis 
 
Inibição competitiva 
 Modelo 
 
 
 
 
 
 
 inibidor semelhante ao S 
 liga-se ao sítio activo 
impedindo a ligação de S 
 
 
 
 
 
 
 
 kM aumenta 
 Vmáx = C
te 
 Contornada 
aumentando a 
[S] 
 
Inibição competitiva 
 Determinação dos parâmetros cinéticos 
 
v = Vmáx [S] 
 [S] + k’M 
k’M = α kM 
 
k’M = 1 + [I] kM 
 kI 
 
1 = 1 + kM (1 + [I]) * 1 
v Vmáx Vmáx kI [S] 
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Inibição não competitiva 
 Modelo 
 
 
 
 
 
 
 inibidor diferente do S 
 inibidor e substrato ligam-se 
simultaneamente mas em sítios 
diferentes 
 local de ligação do inibidor – local 
alostérico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 kM = C
te 
 Vmáx diminui
 
 
Inibição não competitiva 
 Determinação dos parâmetros cinéticos 
 
v = V’máx [S] 
 [S] + kM 
1 = α + kM (1 + [I]) * 1 
v Vmáx Vmáx kI [S] 
V’máx = Vmáx 
 α 
 
V’máx = Vmáx 
 1 + [I] 
 kI 
 
Inibição incompetitiva 
 Modelo 
 
 
 
 
 
 
 inibidor diferente do S 
 liga-se apenas ao complexo 
ES 
 causa distorção no sítio activo 
 torna a enzima inactiva 
 
 
 
 
 
 
 
 
 kM aumenta
 
 Vmáx diminui
 
 
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Inibição incompetitiva 
 Determinação dos parâmetros cinéticos 
 
v = V’máx [S] 
 [S] + k,M 
k’M = α kM 
 
 
V’máx = Vmáx 
 α 
 
1 = α + kM * 1 
v Vmáx Vmáx [S] 
Reacções de vários substratos 
 Enzimas alostéricas 
 
 Possuem mais do que uma 
subunidade 
 Ligam mais do que uma 
molécula de substrato 
 
 Podem-se definir duas formas 
 Forma T – baixa afinidade para 
o substrato 
 Forma R – elevada afinidade 
para o substrato 
Reacções de vários substratos 
 Teste à cooperatividade (v = f[S]) 
 Sem cooperatividade - ?? 
 
 
 
 
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Reacções de vários substratos 
 Teste à cooperatividade (v = f[S]) 
 Sem cooperatividade - curva hiperbólica (Michaeliana) 
 Com cooperatividade - ?? 
 
 
 
 
Reacções de vários substratos 
 Teste à cooperatividade (v = f[S]) 
 Sem cooperatividade - curva hiperbólica (Michaeliana) 
 Com cooperatividade - curva sigmoidal ?? 
 
 
 
 
Reacções de vários substratos 
 Teste à cooperatividade (v = f[S]) 
 Sem cooperatividade - curva hiperbólica (Michaeliana) 
 Com cooperatividade - curva sigmoidal 
 variação do kM com a variação do substrato 
 
 
 
 
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Reacções de vários substratos 
 Teste à cooperatividade (v = f[S]) 
 Adição de activadores e inibidores 
 
 
 
 
Reacções de vários substratos 
 Modelo sequencial (Kosland) 
 
 
 
 
 
 
 A ligação do substrato altera apenas a forma da 
subunidade à qual este se ligou 
 A alteração conformacional induzida pode aumentar 
ou diminuir a afinidade de ligação do substrato na 
outra subunidade (cooperatividade positiva ou 
negativa) 
Reacções de vários substratos 
 Modelo concertado (Monod) 
 
 
 
 
 
 
 As duas conformações existem e estão em equilíbrio na 
ausência do substrato 
 A ligação do substrato altera a conformação de ambas as 
subunidades 
 Um inibidor liga-se preferencialmenteà forma T 
 Um activador liga-se preferencialmente à forma R 
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Efeito do pH 
 pH’s extremos desnaturam 
as proteínas 
 
 ?? 
Efeito do pH 
 pH’s extremos desnaturam 
as proteínas 
 
 alteração do grau de 
protonação dos a.a. 
carregados do sítio 
activo 
 alteração da 
 conformação nativa 
 
Efeito da temperatura 
 Temperaturas extremas 
desnaturam as proteínas 
 
 K = A e-Ea/RT 
 alteração da 
 conformação 
 nativa 
 
 
vo 
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Regulação 
 Regulação da actividade 
enzimática 
 
 controlo alostérico 
 modificação covalente 
 cooperatividade 
Regulação 
 Regulação dos caminhos metabólicos 
 
 pelo produto / “feedback” 
 concentração enzimática celular 
 inibidores/activadores 
 modificação covalente 
 compartimentação