relatorio 1 BM-converted

Prévia do material em texto

Faculdade de Ciências e Tecnológico 
Licenciatura em Engenharia Química Biológica 
Biologia Molecular 
 
 
Relatório: 
 
 
 
 
Extração e análise do DNA 
(Eletroforese) 
 
 
 
 
 
 
 
Discentes: Docente: 
Andrea Semedo Ariana Freire 
Danila Fortes 
Emeline Barbosa 
Nadine Semedo 
 
 Praia, 20-11-2018 
2 
 
Índice 
1 Resumo ...................................................................................................................... 3 
2 Fundamento teórico ................................................................................................... 3 
3 Objetivos ................................................................................................................... 4 
4 Parte experimental ..................................................................................................... 4 
4.1 Extração do DNA ............................................................................................... 4 
 4.2 Eletroforese em gel de agarose: ......................................................................... 5 
5 Discussão dos resultados ........................................................................................... 7 
6 Conclusão .................................................................................................................. 9 
7 Bibliografia.............................................................................................................. 11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
1 Resumo 
Este trabalho prático, foi realizado em duas partes. Numa primeira fase, fez-se a 
extração do DNA de sangue humano, utilizando um kit comercial “DNA Blood kit 
EXTRACTME”. A extração do DNA a partir de sangue consistiu em uma série de 
etapas, que se basearam na eliminação do material não passível de ser analisado, até a 
obtenção do ácido nucléico em questão. Portanto, fez a lise a celular, com libertação de 
todo o material intracelular, e de seguida a purificação do DNA. A segunda fase desse 
experimento, consistiu-se na análise dos fragmentos de DNA, obtidos na fase de 
extração, por meio da técnica eletroforese em gel agarose. Seguindo todos os passos 
indicados no procedimento, que se resume na preparação do gel agarose, preparação das 
amostras, e na realização da eletroforese na cuba, finalmente detectou-se sob iluminação 
UV, as bandas de DNA no gel de agarose. 
Palavras-chave: Extração de DNA, eletroforese, purificação, lise celular. 
2 Fundamento teórico 
A descoberta do DNA ( ácido desoxirribonucleico) ocorreu em 1869 e foi feita pelo 
bioquímico alemão Johann Friedrich Miescher1 (1844 – 1895). Miescher buscava 
determinar os componentes químicos do núcleo celular e usava os glóbulos brancos 
contidos no pus para suas pesquisas (Dulcos, 2004). 
 Por várias décadas, o DNA era visto como um mero elemento estrutural. Contudo, na 
década de 1940 foi identificado como o provável portador da informação genética. Essa 
espantosa descoberta no entendimento dos processos celulares surgiu a partir de estudos 
de hereditariedade em bactéria (Albert, 2010). 
Entretanto, no início da década de 1950, a forma como as proteínas eram especificadas 
pelas instruções no DNA e como a informação hereditária era copiada e transmitida de 
célula a célula ainda era um completo mistério. Em 1953 esse mistério foi resolvido, 
quando a estrutura do DNA foi corretamente determinada por James Watson e Francis 
Crick (Albert, 2010). 
Existem várias técnicas para extração do DNA, que utilizam diferentes metodologias e 
espécimes biológicos. O sangue é muito utilizado para extração de DNA porque é fonte 
abundante de informação genética e por fornecer amostra fresca para análise (a maioria 
dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos 
humanos). (Costa e Moura, 2001) 
No entanto, muitos outros materiais podem ser efetivamente analisados: células 
epiteliais da mucosa oral, unhas, pêlos e fios de cabelo (região do bulbo capilar), 
manchas de material biológico (líquido seminal, urina, saliva) em vidro, faca, têxtil, 
4 
 
ossos carbonizados, ossadas ou dentes, material anatomopatológico, e inclusive células 
deixadas por impressão digital em selos, filtros de cigarro, copos, talheres e telefone. 
Basicamente, o processo de extração de DNA consiste em duas etapas. A primeira etapa 
é a extração propriamente dita e consiste no rompimento das membranas celulares (e 
consequente exteriorização do DNA). A segunda fase consiste na purificação do DNA 
em solução, ou seja, “retirada” dos outros componentes celulares da solução (restos de 
membrana, proteínas, RNA). (Costa e Moura, 2001). 
Para a quantificação e qualificação da amostra de DNA obtida, é comum a utilização do 
método de eletroforese, processo utilizado para a separação de moléculas de DNA, 
RNA e proteínas conforme sua carga elétrica e peso molecular. Essa técnica tira 
proveito do caráter negativo da molécula de DNA, negatividade característica à 
presença dos grupos fosfatos na molécula. (Teixera, A.2001) 
A técnica de eletroforese em gel de agarose consiste na submissão do DNA a um campo 
elétrico, o qual deve ser colocado no lado negativo (sua carga característica), de maneira 
a migrarem ao pólo positivo. Moléculas menores tendem a correr mais do que 
moléculas maiores, e a concentração da agarose também influencia na separação das 
mesmas. (Teixera, A. 2001) 
A agarose é um polissacarídeo composto por subunidades de galactose e 
galactopiranose, que se solubiliza em água fervente e geleifica após esfriar, como uma 
gelatina. É uma matriz inerte usada como suporte na visualização de DNA. (Martinez e 
Paiva, 2006). 
3 Objetivos 
• Extrair e isolar amostras de DNA a partir de células sanguíneas utilizando um kit 
comercial “DNA Blood kit EXTRACTME” 
• Analisar os fragmentos por meio da técnica de eletroforese em gel de agarose. 
4 Parte experimental 
4.1 Extração do DNA 
Materiais 
• Micropipetas 
• Tubos eppendorfs de 1,5 mL 
• Coluna 
• Tubos coletores 
• Balança analítica 
• Centrifugador 
• Vortex 
Reagentes: 
• Sangue(em EDTA) 
• Buffer de lise 
• Proteinase K 
• Buffer de ligação 
• Buffer de lavagem 
• Buffer de eluição 
 
5 
 
Procedimento experimental 
1. Transferiu-se 200 μL de sangue (em EDTA, que é um anticoagulante) para um tubo 
eppendorf estéril de 1.5 mL e adicionou-se o mesmo volume do Buffer de Lise RBC 
(células vermelhas do sangue). Homogeneizou-se a mistura, invertendo o tubo. 
2. A seguir, centrifugou-se o tubo por 4 minutos a 8.6g. 
3. Cuidadosamente descartou-se o sobrenadante preservando o pelete. 
4. Adicionou-se375 μL do BL ( Buffer de Lise) e ressuspendeu o pelete. 
5. Adicionou-se 1 μL do proteinase K e homogeneizou a mistura no vortex, para depois 
ser incubado a 55ºC por 10 minutos. 
6. Foi adicionado 400 μL do Buffer BB (Buffer de Ligação) e misturou-se bem 
utilizando o vortex por 15 – 20s. 
7. Transferiu-se o lisado para uma mini coluna de purificação inserida num tubo coletor 
e este foi centrifugado a 15 g por 1 min. 
8. De seguida, transferiu-se a mini coluna de purificação para um novo tubo coletor e 
adicionou-se 600 μL BW1 (Buffer de lavagem). Centrifugou-o por a 15g por 30 s. 
9. Após a centrifugação, descartou-se o filtrado e o tubo coletor foi reutilizado. 
10. Foi adicionado 400 μL BW2 ao tubo e este centrifugado a 15 g por 30 segundo. 
Depois descartou-se o filtrado e reutilizou o tubo coletor. E novamente centrifugou-se a 
15 g por 2 minutos. 
11.O tubo coletor foi descartado e inseriu a mini coluna de purificação num tubo 
eppendorf estéril de 1.5 mL. 
12. Adicionou-se 60 μL de Buffer de Eluição pré aquecido a 70ºC, diretamente na 
membrana da mini coluna de purificação, e de seguida, o tubo foi encubado por 2 
minutos a temperatura ambiente. 
13. Centrifugou-se o tubo por 1 minuto à 15g e finalmenteremoveu a mini coluna e 
conservou-se o filtrado contendo o DNA a 20ºC. 
4.2 Eletroforese em gel de agarose: 
 
6 
 
 
Materiais 
• Erlemeyer 
• Microondas 
• Cuba de eletroforese 
 
 
Procedimento experimental 
I. Preparação do gel de agarose: 
Na preparação de gel de agarose, primeiramente fez-se diluição da solução TAE x50 
para solução TAE x1. Adicionou-se 20 mL de TAE x1 no erlenmeyer. De seguida, foi 
adicionado 0,5g de agarose no erlenmeyer, e este, foi agitado e dissolvido 
completamente sob o calor (microondas). 
Deixou arrefecer até aproximadamente 40ºC e adicionou-se 4 mL de greensafe a seguir, 
contornou-se a solução na cama de molde e inseriu o pente (de modo a fazer poços) 
Após aproximadamente 20 minutos o verificou que o gel se encontrava solidificado. 
II. Preparação da amostra para a eletroforese 
• Adicionou-se: 
✓ 1μL de corante (azul de bromofenol); 
✓ 6 μL da amostra de DNA; 
✓ 1/10 do greensafe directload. 
 
III. Realização da eletroforese 
✓ Deitou-se 1x TAE na tina para electroforese; 
✓ Inseriu a cama contendo gel de agarose na tina contendo 1x TAE; 
✓ Inseriu nos poços: 
1º- 4 μL de marcador de tamanho; 
2º- a mistura da amostra de DNA anteriormente feita. 
✓ Tampou-se a tina e ajustou a voltagem a aproximadamene 90volts 
 
Reagentes: 
• 1 x TAE 100mL 
• Agarose –1.5 
• Solução de greensafe 
• Azul de bromofenol 
• Amostra de DNA 
 
7 
 
5 Discussão dos resultados 
A. Extração de DNA do sangue 
 
O procedimento de extracção do DNA envolveu 3 etapas: a lise celular, o isolamento do 
DNA e a purificação. As primeiras células a sofrerem a lise foram as células vermelhas 
do sangue pois estas por não possuírem DNA devem ser separados dos glóbulos brancos 
antes da etapa do isolamento. São lisadas pela acção do tampão de lise de glóbulos 
vermelhos (RBC) que foi concebido, formulado e testado para garantir a lise óptima de 
glóbulos vermelhos em suspensões de células únicas com efeitos mínimos nos 
leucócitos. (Biolegent,2013) 
 
A lise dos glóbulos brancos é provocada pela acção da proteinase K adicionada, que 
quebra todas as membranas celulares e degrada todas as proteínas. O citoplasma e o 
nucleoplasma ao serem rompidos provocam a saída do DNA do núcleo, estando este 
agora sujeito a acção das enzimas chamadas DNAses, que quebram a sua estrutura. Para 
evitar essa quebra misturou-se o sangue com EDTA, pois este sendo um ligante 
quelante, liga-se aos iões Mg2+ que são essenciais às funcionalidades das DNAses, 
privando-as de qualquer acção sobre o DNA. 
 
Com a liberação do DNA, pôde-se passar para a fase do isolamento em que adicionando 
um buffer de ligação permitiu-se a ligação do DNA na mini-coluna, estando assim agora 
isolado dos outos componentes das células. 
 
Já na etapa da purificação, foram feitas lavagens com 2 tampões de modo a permitir 
remover todas as impurezas. O DNA purificado, de seguida, foi eluído usando um 
tampão de baixa força iónica, sendo posteriormente armazenado. 
 
B. Eletroforese em gel de agarose 
 
A concentração da agarose desempenha papel importante na separação eletroforética, 
pois determina a porosidade do gel, que por sua vez, influencia diretamente na 
capacidade de migração das moléculas de DNA. Portanto, o tamanho dos poros desta 
matriz é inversamente proporcional à concentração de agarose utilizada e diretamente 
proporcional ao tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja separar. 
 
Cálculos auxiliares: 
 
Diluição da solução TAE 50x presente no laboratório para solução TAE 1x que seria 
utilizada na preparação do gel: 
 
C1= 50x n1 = n2 
C2 = 1x <=> C1.V1 = C2.V2 
8 
 
 
V2 = 1000 mL <=>V1 = (C2.V2)/C1 
V1 = ? <=>V1 = (1x.1000 mL)/50x 
 <=>V1 = 20 mL Volume da solução TAE 
50x necessária para preparar 1000 mL da solução TAE 1x, logo a solução a ser utilizada 
para preparar o gel conterá 20 mL da solução 50x e 980 mL de água destilada. 
 
Onde:mbolo Descrição 
• n1 Quantidade química na solução 1x TAE 
• n2 Quantidade química na solução 50x TAE 
• C1 Concentração da solução 1x TAE 
• C2 Concentração da solução 50x TAE 
• V2 Volume da solução diluída (1x TAE) 
• V1 Volume de solução 50x TAE necessária para a diluição 
 
Obteve-se um gel sólido ligeiramente mole após a mistura dos reagentes, aquecimento e 
resfriamento. No nível molecular, o gel é uma matriz de moléculas de agarose que são 
mantidas unidas por ligações de hidrogênio e formam micro poros. 
 
Com este gel sólido pôde-se aplicar a técnica de eletroforose nas nossas amostras. Uma 
vez que o gel esteja na cuba electroforese e cada uma das amostras de DNA em seu 
respectivo poço, liga-se e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de 
DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-
fosfato, assim elas começam a se mover através da matriz de gel, para o polo positivo. 
 
A figura abaixo mostra os resultados das bandas de DNA das 4 amostras após concluir a 
electroforese. 
 
Figura.1.Visualização das bandas de DNA sob luz 
9 
 
A fluorescência das bandas deve-se ao corante adicionado, o azul de bromofenol que 
facilita a aplicação da amostra no gel e auxilia no monitoramento da corrida, já que 
apresenta velocidade conhecida durante a migração na matriz em direção ao pólo 
positivo. Por exemplo, o azul de bromofenol migra juntamente com um fragmento de 
DNA de aproximadamente com 0,3kb em gel de agarose de 0,5 a 1,4% em TAE. 
(Corrêa, Elisete. Possik,Patricia.nd) 
 
Analisando as bandas, no canto esquerdo encontra-se o marcador de tamanho e logo a 
seguir as amostras analisadas. Fazendo uma numeração da esquerda para a direita, 
contado as amostras após o marcador, as amostras 2 e 4 foram as que apresentaram 
melhor banda o que pode ser justificado pela presença de melhores fragmentos de DNA, 
já no grupo 1 e 2 as bandas permitem ver que houve uma certa danificação do DNA. 
 
Observou-se que a migração do DNA nas amostras foi reduzida, poderia dizer-se que os 
fragmentos de DNA obtidos são grandes e lineares mas esta dedução não é suficiente 
para justificar a migração sendo que nem sempre os fragmentos encontram-se lineares e 
descondensados e tais fatores podem alterar a migração do fragmento no gel, pois 
interferem na passagem da molécula de DNA pelos poros. As moléculas de DNA 
circular podem assumir formas como: relaxada ou superenovelada. Estas formas não 
migram de acordo com o tamanho do DNA durante a eletroforese, podendo atravessar a 
malha do gel em velocidades superiores ou inferiores ao padrão. (Corrêa, E. 
Possik,P.nd) 
 
Já o DNA genômico, sua estrutura condensada e complexa não permite que os 
fragmentos migrem de acordo com o tamanho em pares de base e sim, fiquem presos 
nos poros do gel devido à sua estrutura densa e irregular que não permite que os 
fragmentos atravessem. (Corrêa,E.Possik,P.nd) 
Assim, a mobilidade das formas do DNA no gel não depende somente do tamanho da 
molécula, mas da densidade, torção do DNA e de outros factores. 
 
6 Conclusão 
A extração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) é o primeiro passo para a realização da 
maioria das metodologias de biologia molecular. Pode ser obtido DNA a partir de 
inúmeros tipos de tecidos e células. 
Existe uma infinidade de protocolos para realização de tal procedimento. A escolha do 
protocolo de extração de DNA dependerá de diversos fatores como: tipo de tecido a ser 
utilizado, grau de pureza e de integridade necessária para a aplicação em que o DNA 
será utilizado (PCR, sequenciamento, clonagem gênica, etc.). 
10 
 
A extração de DNA, sendoassim, é importante para a execução de análises de 
expressão gênica, bem como para a análise de proteínas que futuramente serão 
formadas. Para que se obtenham resultados desejáveis é necessário que as sequências de 
DNA estejam puras e em sua forma mais íntegra possível, pois moléculas fragmentadas 
originam dados de baixa qualidade e pouco confiáveis. (COSTA, M. e MOURA, 
E.2001) 
É de se referir que a eletroforese se mostra mais eficiente para determinar fragmentos de 
DNA do que outros processos como a centrifugação através de gradiente de 
concentração, e é utilizada em testes de paternidade, identificação de criminosos e 
ainda, quando combinada a outras técnicas como por exemplo enzimas de restrição 
possibilita à indústria farmacêutica produção de vacinas, remédios e à agropecuária 
produção de transgénicos. (MARTINEZ e PAIVA, 2006) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
7 Bibliografia 
Albert, B. (2010). Biologia molecular da célula (5ª edição ed.). Porto Alegre: Garland 
Science. 
Dulcos, C. (2004). biomol.org. Obtido em 14 de novembro de 2018, de História: 
Descoberta do DNA: http://www.biomol.org/historia/existencia.shtm 
Martinez, M. e Paiva, L.(2006) Eletroforese de ácidos nucléicos: uma prática para o 
ensino da genética. < http://www.geneticanaescola.com.br/ano3vol 1/9.pdf> Acessado 
em 15 de Novembro de 2018 
Costa, M. e Moura, E(2001). Manual de Extração de DNA. 
Teixeira, A. B.(2001) Manual da aula prática de eletroforese para DNA. < 
http://br.geocities.com/andbt/biofisica/Manual.PDF> Acessado em 15 de Novembro de 
2018 
Biolegend,(2013). RBC Lysis Buffer (10X). Disponivel em: 
https://www.biolegend.com/enus/products/rbc-lysis-buffer-10x-1498. Acessado em 13 
de Novembro de 2018. 
 
Corrêa, E. Possic,P. A análise de DNA por electroforese. Disponivel em: 
http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-
moleculartecnicas- moleculares/. Acessado em 13 de Novembro de 2018. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12