imobilização enzimática

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EQB4383 – Enzimologia Industrial M.A.Z. Coelho
Enzimas Imobilizadas
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DEFINIÇÕES E HISTÓRICO
Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou quimicamente 
associada a um suporte ou matriz, usualmente sólida, insolúvel em 
água e inerte, que não seja essencial a sua atividade.
Objetivos da imobilização :
1- Reutizar a enzima
2-Aumento da estabilidade
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Histórico do Uso de Enzimas Imobilizadas
1916 - ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada (invertase
em carvão vegetal) por Nelson e Griffin. 
1960 - Katchalski introduziu os primeiros suportes úteis.
1978 - os processos com enzimas imobilizadas também têm 
utilização industrial em larga escala - aminoacilase imobilizada 
em DEAE–Sephadex para produção L-aminoácidos.
Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes de 
frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada em 
grande escala nos Estados Unidos
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Resolução de Misturas Racêmicas de Aminoácidos 
aminoacilase - tanto L como D-aminoácidos são completamente 
convertidos a L-aminoácidos.
Produção de Ácido 6-Aminopenicilâmico (6-APA) 
peniclina amidase e suporte bentonita entrecruzada . 
Produção de leites e soros deslactosados
lactase imobilizada em fibras de acetato de celulose ou vidro poroso 
ativado.
Produção de xaropes de frutose a partir de glicose 
glicose isomerase utilizando como suporte proteínas entrecruzadas ou 
vidro poroso ativado.
USOS EM ESCALA INDUSTRIAL DAS ENZIMAS 
IMOBILIZADAS
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Vantagens e Desvantagens
Vantagens Desvantagens
Desenvolvimento de sistemas
contínuos
Custo adicional de suportes, 
reagentes e da operação de 
imobilização
Maior estabilidade enzimática Perdas de atividade durante a 
imobilização
Uso mais eficiente do catalisador 
através de reutilizações
Possíveis exigências adicionais de 
purificação do catalisador
Flexibilidade no projeto de reatores Técnica pouco adequada a substratos 
insolúveis ou de alto peso molecular
Efluentes livres de catalisadores Maiores riscos de contaminação na
operação contínua dos reatores
Maior versatilidade na etapa de 
separação
Restrições difusionais e impedimento
estéreo
Menor custo de mão de obra
Facilidade de Automação e controle
Possibilidade de utilização das 
enzimas “in-natura”
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ESCOLHA DE MÉTODOS E DO SUPORTE DE 
IMOBILIZAÇÃO
Dependerá das características da enzima e das condições de uso da 
enzima imobilizada. 
Para uma escolha econômica do método de imobilização é necessário 
o conhecimento da reação desejada, o processo de aplicação da 
enzima imobilizada, condições do meio, modificações causadas na 
estabilidade, atividade, pH e demais fatores.
O binômio suporte–método mais adequado será aquele que 
propiciar uma maior atividade após imobilização. 
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Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em 
vários suportes e por diferentes métodos
SUPORTE MÉTODO POROS 
(A)
UI/g
Acetato de celulose Microencapsulamento 0,02 45
Poliacrilamida Microencapsulamento 2,5 50
Pérolas de vidro Ligação covalente 0,2-1,0 200
DEAE-Sephadex 
A25
Adsorção 0,1 650
Dowex 1X1 Adsorção 0,4 820
DEAE- Celulose Adsorção 0,06 4200
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Suportes de Imobilização
Os suportes podem ser orgânicos ou inorgânicos, sintéticos ou naturais. 
Suportes necessitam de mudanças ou inclusão de grupos reativos – ativação 
do suporte.
Classificação dos suportes utilizados na Imobilização de Enzimas
TIPO DE 
SUPORTE
MATERIAIS POROSIDADE ESTABILIDADE
Não poroso Vidro, sílica, aço - Alta
Microencapsulado Triacetato de celulose 35 A Moderada
Entrelaçado Poliacrilamida, PVP Variada Baixa
Macroporoso Alumina, sílica 200-1000 A alta
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Tipos de Suporte para Imobilização 
Vidro
Poliacrilamida
Aluminasílica
tela de nylon Fibra de casca de coco
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Critérios para avaliação de um sistema 
enzima-suporte
Estabilidade de fixação  a enzima deve estar bem fixa ao suporte. 
Estabilidade enzimática  a enzima não deve sofrer modificações 
como desnaturação. 
Resistência mecânica  o suporte deve resistir a várias condições 
desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do reator. 
Capacidade de carga  o suporte deve fixar um número elevado de 
unidades enzimáticas por unidade de área - um pequeno reator 
uma grande capacidade catalítica.
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Por Oclusão ou Aprisionamento - encapsulamento
Oclusão em matrizes: Podem ser géis (amido, borracha, nylon, 
poliacrilamida, sílica, alginato de cálcio, agarose, polietileno glicol) ou 
fibras. Nos géis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaços 
intersticiais da rede polimérica (enzima confinada no interior de micelas), 
enquanto que nas fibras o aprisionamento se dá nas micro-cavidades.
Métodos de 
Imobilização 
da enzima por 
encapsulamento 
em gel de ágar
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Microencapsulamento:
A enzima é oclusa em membranas poliméricas de porosidade de 
300 µm (celulose, policarbonato, colágeno, politereftalato, 
polímeros em geral), semi-permeáveis esféricas de pequeno 
diâmetro. 
Microencapsulamento de enzima em material polimérico
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Reticulação ou Ligação Cruzada
Método que envolve o uso de agentes bifuncionais ou multi-funcionais, 
em geral diaminas alifáticas (di-isocianato) ou glutaraldeído, que induzem a 
auto-reticulação das enzimas, resultando assim na formação de uma rede 
tridimensional de moléculas de enzima
Ligação Covalente
A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos do suporte, 
matrizes como vidro, cerâmica, polímeros sintéticos, celulose, nylon e 
alumina, ativado ou não, com os grupos funcionais da enzima ligação de 
grupos - NH2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, preferencialmente em 
condições fisiológicas brandas, baixa temperatura, baixa força iônica, pH 
ótimo e muitas vezes na presença do substrato, a fim de proteger o sítio 
ativo da enzima evitando que haja diminuição da atividade da mesma
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Adsorção Física
Utiliza força de Van der Waals; método simples que se baseia na adsorção física em 
superfícies sólidas, como alumina, carvão, argila, sílica gel, colágeno, vidro, por 
ligações iônicas, polares ou de Van der Waals. 
Ligação Iônica
Ligação de grupos com cargas opostas através de forças eletrostáticas. Processo 
simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo inclusive 
desprezíveis os efeitos difusionais.
Ligação Metálica
Forma quelatos pela ativação da superfície do suporte por meio do metal ou por seu 
óxido.
Nos dois primeiros métodos por adsorção, as forças são fracas levando a pequenas 
modificações conformacionais na enzima e, conseqüente, possibilidade de 
dissolução da mesma (perda).
De uma forma geral, os processos de imobilização por ligação são preferidos quando 
se confronta eficiência, apesar da inclusão em géis ou matrizes ser mais barato.
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Imobilização de -amilase por adsorção física em 
carvão de casca de coco
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EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO
Retenção da Atividade Enzimática
- algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em uma 
configuração que impede completamente o acesso do substrato ao 
centro ativo;
- o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação ao 
suporte (a proteção do sítio ativo da enzima através de um inibidor 
reversível durante a ligação pode resultar em aumento na retenção da 
atividade;
- moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração que as 
torne inativas;
- as condições de reação no processo de imobilização podem causar 
desnaturação ou inativação.
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Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase na 
forma solúvel e imobilizada em três diferentes suportes (alginato de cálcio, 
quitina e polietileno ativado, respectivamente)
PARÃMETRO INVERTASE SOLÚVEL INVERTASE IMOBILIZADA
Km 26,0 mM 8,1 mM
52,2 mM
32,2 mM
Vmáx 1,10 U 0,25 U
0,74 U
0,32 U
pH
(para atividade máxima)
4,6 4,6
4,0
4,6
pH
(maior estabilidade)
4,0-4,6 4,5 – 6,5
5,0 – 6,0
4,6
T
(para atividade máxima)
55-60 C 60 C
60 C
70C
T
(maior estabilidade)
25-37 C 45-50 C
25-40 C
25-40 C
Ea
(energia de ativação a 37C)
27,8 kJ/mol 24,4 kJ/mol
51,9 kJ/mol
37,5 kJ/mol
H
(variação de entalpia a 37C)
25,2 kJ/mol 21,9 kJ/mol
49,3 kJ/mol
34,9 kJ/mol
G
(variação de energia livre de 
Gibs a 37C)
-13,6 kJ/mol -13,9 kJ/mol
-11,5 kJ/mol
-14,7 kJ/mol
S
(variação de entropia a 37C)
0,125 kJ/mol 0,115 kJ/mol
0,196 kJ/mol
0,160 kJ/mol
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Efeitos Difusionais
Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que difundir na 
solução através de um filme líquido estacionário presente nas 
superfícies do suporte e, se este é poroso, através dos poros 
até alcançar o sitio ativo das enzimas - pode restringir a taxa de 
reação
velocidade de difusão do substrato < velocidade de 
transformação pela enzima
Vmáx mais baixa 
não se atinge a saturação.
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Resistência Difusional Externa
Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio 
da solução até a superfície de catalise, devendo, por conseguinte 
atravessar uma camada líquida, assim o consumo de substrato 
através da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de 
um gradiente.
A difusão do substrato e produtos dos centros ativos para a solução (ou 
vice-versa) ocorre através de mecanismos de difusão molecular e 
convectiva. 
Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e podem 
ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso de reatores 
continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de 
substrato, caso do reator pistonado (PFR).
Efeitos Difusionais Internos
Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio 
catalítico - difusão e reação ocorre simultaneamente
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Efeitos Microambientais
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente 
diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz 
ou suporte possui carga. Os efeitos de circunvizinhança, que 
dependem da natureza física e química do suporte, podem 
acarretar uma distribuição desigual do substrato, produtos e 
cofatores entre a região vizinha ao sistema imobilizado e o resto 
da solução.
Efeitos Estereoespecíficos
Existem situações onde a atividade da enzima frente a um substrato 
com elevado peso molecular é reduzida durante o processo de 
imobilização, de uma forma mais extensa que frente a um 
substrato com menor peso molecular - resultado de 
impedimento estéreo, formado pelo suporte,ao acesso de 
moléculas grandes ao centro ativo da enzima (impedimento 
estérico).