Tecnologia Bioquímica

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Tecnologia Bioquímica 
Diferentes possibilidades de desenvolver um processo biotecnológico 
Células 
● fonte de genes para biotecnologia (nativos) > Kollagenase - usam um microorganismo que 
eles mesmo isolaram do ambiente que produz de maneira anaeróbica uma colagenase que é 
utilizada numa pomada 
● vetores para clonagem de outros genes 
Bactérias 
● organismo procariotos de células individuais que não possuem núcleo verdadeiro 
● algumas bactérias absorvem nutrientes do meio ambiente circundante e algumas produzem 
seu próprio nutriente por fotossíntese 
● algumas bactérias estão livres no ambiente enquanto outras permanecem aderidas 
● são unicelulares (exceto os actinomicetos - importantes por serem produtores de 
metabólitos) 
● material genético não envolto por membrana 
● podem apresentar flagelos 
● reprodução por fissão binária 
● arqueobactérias 
○ habitam ambientes extremos 
○ se desconhece que produzem doenças em humanos 
○ metanogênicas: produzem metano, vivendo apenas em ambientes anaeróbicos 
como pantanos e intestino de ruminantes 
○ halofílicas extremas: vivem em ambientes muito salinos 
○ termofílicas extremas: habitam águas quentes e sulfurosas 
Escherichia coli 
● Simplicidade genética: genoma relativamente pequeno com cerca de 4400 genes 
● Taxa de crescimento: cresce rapidamente, a uma de uma geração por 20 minutos em 
condições de crescimento típicas. Num processo biotecnológico em escala industrial temos 
uma produção acelerada ou mais rápida dos metabólitos. 
● Segurança: é naturalmente encontrada nos tratos intestinais de humanos e animais 
● O genoma é bem compreendido: foi completamente sequenciado em 1997, com isso é o 
organismo mais estudado 
● Capacidade de hospedar DNA exógeno: a maioria das técnicas de clonagem de genes foram 
desenvolvidas usando esta bactéria e ainda são mais bem sucedidas ou eficazes do que em 
outros microrganismos 
● Importante: as proteínas recombinantes obtidas em E.coli não possuem as modificações 
pós-tradução (PTMs) que estão presentes na maioria das proteínas eucarióticas 
Outros vetores 
● Bacillus 
● Actinomicetos 
● Cianobactérias (usam energia solar - vantagem biotecnológica/ desvantagem - taxa de 
conversão) 
● Microalgas (para gerar biomassa principalmente) 
Eucariotos - Fungos e leveduras 
● Micologia 
● estudo dos fungos, tipicamente microscópicos que absorvem nutrientes do meio que vivem 
● diferenciam-se das bactérias por possuírem núcleo 
● apresentam parede celular bem rígida composta por quitina 
● unicelulares: leveduras 
● pluricelulares: bolores, chamado micélio 
● podem apresentar dimorfismo 
● reprodução sexuada ou assexuada 
● nutrição geralmente heterótrofa 
● processos infecciosas: micoses 
● micetismo: ingestão e intoxicação por cogumelos 
● micotoxicoses: ingestão contínua e prolongada de alimentos embolorados que contenham 
fungos produtores de micotoxinas 
● ambiental: reciclagem de nutrientes, decomposição de agentes poluidores 
● agricultura: fertilidade do solo 
● indústria: álcool, cerveja, vinho, antibióticos 
● alimentação: cogumelos comestíveis 
Saccharomyces cerevisiae (vetor) 
● importância gigantesca por ser o principal hospedeiro para genes exógenos (importante 
biofábrica) 
● faz transformações pós-traducionais 
● organismo extremamente conhecido, tem crescimento relativamente rápido, tem base dados 
grandes, é seguro, vetor versátil 
● limitação: alguns tipos de tradução pós-tradução colocam nas proteínas alto teor de manose, 
o que pode diminuir a meia vida in vivo dessas proteínas 
● exemplos de produtos: albumina, insulina, para uso em vacinas de HPV 
Células mamíferas 
● aproximadamente 40% dos produtos biofarmacêuticos são produzidos por culturas de células 
de mamíferos, principalmente usando linhagem celular de ovário de hamster - células CHO 
● cultura mais caros: meio de culturas muito mais caro 
● secretam a proteína no meio de cultivo com facilidade de purificação 
● modificações pós-traducionais carboxilação, hidroxilação, sulfatação, fosforilação e 
especialmente glicosilação 
● alta atividade biológica, alta estabilidade, baixa imunogenicidade 
● células CHO tem padrão de glicosilação adequado e baixa susceptibilidade a vírus que 
afetam humanos 
 
Aula prática 1 
● Ágar-leite: usado como meio indicador. por ter caseína, uma vez que o 
microrganismo a degrade, indica que ele tem uma enzima, em específico, uma 
protease. 
● protease: grande classe de enzimas, importantes industrialmente, representam 
40-50% de vendas de enzimas no mundo, estão presentes nos detergentes 
industriais e caseiros 
● bactéria que degrada caseína do leite forma um halo translúcido no meio 
● depois de 24h replicar apenas com as bactérias que produzem protease 
 
 
Matérias-primas 
Fatores importantes 
● o meio de cultura deve ser balanceado de forma suprir todos os elementos 
essenciais para o microrganismo 
● a composição do meio de cultura deve ser adaptada ao processo fermentativo 
● facilidade do fornecimento dessas matérias-primas, principalmente quando se tratar 
de subprodutos, sazonalidade de distribuição 
● custos 
● facilidade de separação do produto de interesse após realizada a fermentação 
Tipos de matérias-primas 
Fonte de carbono 
● Amiláceas: todas as farinhas - farinha de mandioca, milho e trigo, amido 
● Sacarínicas: melaço de cana (Br), beterraba 
● Celulósicas: serragem, bagaços, cascas, sabugo 
● Outras: extrato de malte, licor sulfítico, óleos de plantas e sementes, leiteiro, soro de 
queijo, metanol, etanol, alcanos, esteróis 
Fontes de nitrogênio 
● Inorgânicas: as mais utilizadas são sais de amônio, amônia gasosa, nitratos e nitritos 
● Protéicas: milhocina, extrato de levedura, extrato de carne, peptonas, proteína de 
soja, farinha de peixe, farinha de camarão 
Controle 
● Assegurar que o processo fermentativo seja bem conduzido (teor de substrato 
fermentável) 
● Não conter contaminantes que inibam o crescimento microbiano 
● Controle microbiológico 
○ busca por aeróbios mesófilos e bolores 
○ a esterilidade do meio vai depender do teor de microorganismos iniciais 
○ algumas vezes se faz uma pré-esterelização antes de entrar 
Milhocina 
● é um subproduto da indústria fécula, também conhecida por agia de milho. é obtida 
da água de maceração do milho na obtenção de amido de milho 
● é rico em nitrogênio protéico 
● matéria-prima nobre para indústria fermentativa sendo muito utilizada na produção 
de antibióticos 
Extrato de malte 
● é um extrato aquoso da cevada malteada, é um excelente substrato para fungos e 
actinomicetos. contém de 90 a 92% de carboidratos e um pouco de substâncias 
nitrogenadas 
Extrato de levedura 
● uma mistura complexa com todo tipo de material 
Processos 
Esterilização 
● destruição completa dos microrganismos ou a inativação reprodutiva destes 
● desinfecção: redução dos microrganismos a nível razoável de segurança 
● pasteurização: destruição de microrganismos patogênicos 
● sanitização: diminuição de microrganismos sobre superfícies 
● assepsia: destruição de microrganismos patogênicos sobre tecidos vivos 
● tindalização: destruição das células vegetativas por exposição a vapor 
● esterilização pode ocorrer por processo físico, químico ou físico-químico 
 
Aula prática 2 
● Evita-se usar materiais de origem material para evitar dificuldades com a anvisa no 
futuro (demora para ser aprovado) 
 
Tipos de processos fermentativos 
● Descontínuo ou por batelada 
○ esterilizar o meio de cultivo no reator 
○ adição de inóculo 
○ determinação dos parâmetros de cultivo 
○ durante o processo se faz adição de: ar ou outro gas; antiespumante;ácido/base para controle de pH 
○ finalização do cultivo e líquido é transportado para as etapas posteriores 
○ lavagem e nova esterilização 
○ vantagens: processo fechado (dificulta contaminação); processo bem 
caracterizado que facilita rastreabilidade; tipicamente é utilizado como 
primeiro processo para desenvolvimento de produto, dada a praticidade 
devido a relativo baixo custo 
○ desvantagens: pode levar ao acúmulo de metabólitos que podem reduzir a 
produção e/ou desviar a rota para produção de outros metabólitos; “tempo 
morto” - carga, descarga, limpeza e esterilização 
● Descontínuo alimentado 
○ adição de meio virgem e retirada de certa quantidade a cada X tempo 
● Descontínuo alimentado ou semi-contínuo 
○ pode ser utilizado quando o valor agregado do produto é um pouco mais alto 
○ 3 ou 4 reatores sempre com 1 limpo para receber 
○ vantagens: não possui tempo morto; não possui acúmulo de metabólitos 
○ desvantagens: maiores chances de contaminação; rastreabilidade se faz 
mais complexa; possui uma pequena taxa de diluição do produto;perda da 
capacidade produtiva de cepas geneticamente modificadas 
Condução do processo fermentativo 
● controle da quantidade de células: o cultivo deverá conter a quantidade de células 
suficientes para garantir a máxima produtividade e sem contaminantes. 
● controle do substrato: a adição de substrato pode e deve ser adicionado em qualquer 
dos tipos de fermentação apresentado 
○ a sua falta prejudica a formação do produto desejado 
○ seu excesso em alguns casos contribui para: inibição da formação do 
produto; aumento do custo de produção; prejuízos no processo de 
purificação 
● controle de temperatura: algumas biofábricas são extremamentes sensíveis a 
pequenas variações de temperatura (0,5º) 
● controle de pH: intervenção para deixar no pH ótimo ou monitorização 
● controle da pressão: a manutenção da pressão de ar positiva dentro do fermentador 
é fundamental para a manutenção do meio sem contaminação 
● controle de espuma: formação de espuma nos processos industriais é bastante 
comum, principalmente devido aos altos teores de proteína. Quando não controlada 
diminui a aeração e permite a perda do caldo fermentativo e aumenta as chances de 
contaminação pelo contato da espuma com retentor do eixo e tubulações. O nível da 
espuma pode ser detectado por sensores dentro do reator e adição produtos na 
maioria dos casos é automática. O controle pode ser feito por cisalhamento 
mecânico quando o nível de espuma é muito alto. 
Classificação dos processos fermentativos 
Fermentação com relação ao oxigênio 
1. anaeróbica: processos não utilizam oxigênio, em alguns casos de forma estrita. ex.: 
alcoólica e lática 
2. aeróbica: processo que utiliza oxigênio. ex.: acética e cítrica 
3. sem aeração forçada: é o caso dos processo que não necessitam de anaerobiose 
estrita. ex.: produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae ou processos 
aeróbicos que a agitação é suficiente para suprir o oxigênio necessário ao processo, 
como produção de ácido cítrico. 
4. com aeração forçada: quase todos os processos biossintéticos possuem aeração 
forçada (estéril) 
Fermentação com relação ao metabolismo 
1. assimilativa: ocorre síntese de produtos, usualmente os produtos são mais 
complexos que os substratos (maior peso molecular) e.: síntese de vitaminas e 
antibióticos (açúcar + fonte de nitrogênio = substrato de maior peso molecular) 
2. dissimilativa: há degradação do substrato e o produto apresenta peso molecular 
menor que o substrato. 
Fermentação com relação ao crescimento celular e formação de produto 
1. processo associado: a formação do produto é associada o crescimento celular, isto 
é, ocorrem ao mesmo tempo. São produtos do metabolismo primário. 
2. processo semi-associado: embora a formação do produto tenha correlação com o 
crescimento celular, eles não ocorrem exatamente ao mesmo tempo, seja por desvio 
no metabolismo primário para uma rota lateral, ou pelo tempo necessário para fazer 
indução de enzimas específicas. ex.: ácido lático 
3. processo não-associado: quando as células atingem a fase estacionárias, começa a 
formação do produto. ex.: produto metabolismo secundário 
Fermentação com relação ao grau de esterilidade 
1. estéril: também chamada de asséptica, é conduzida em condições de absoluta 
esterilidade. ex.: produção de antibióticos, vitaminas, acetona-butanol 
2. semi-estéril: fermentação semi-asséptica onde é feito um tratamento térmico para 
diminuir a contaminação do meio, mas a fermentação não é conduzida de forma 
asséptica. ex.: produção de etanol 
3. não-estéril: fermentação não asséptica onde a manipulação das condições de 
fermentação (pH muito ácido, temperaturas extremas, pressão osmótica elevada) 
evitam a ocorrência de contaminações. ex.: produção de ácido acético e de iogurte 
 
Fermentadores 
 Todo processo começa com escalonamento: estudo de pH, oxigenação… 
1. Biorreatores de tanque de mistura - bags descartáveis 
2. Fermentador do tipo air-lift: funcionam por circulação de fluidos. utilizado 
essencialmente com ​líquidos viscosos 
a. Tipo gangorra - meios de cultura 
3. Biorreatores de leito fluidizado 
4. Fotobiorreatores - para micro algas 
 
Fermentadores em estado sólido: usualmente para fungos, pouco utilizados 
1. 
2. Fermentador de leito estático e túnel - permite a alimentação e retirada do produto de 
modo contínuo, uma adaptação melhorada dos fermentadores de bandeja 
3. Fermentador de leito fluidizado - é o próprio substrato 
Outros reatores (meios líquidos) 
1. Biorreatores de membrana 
2. Biorreatores com células de planta 
3. Biorreatores com células animais imobilizadas 
Outros reatores (meio sólido) 
1. Fermentador de discos rotatórios 
2. Fermentador de pás rotatórias (ou tanque de agitação) 
3. Fermentador de rosca contínua