POP Análise Pseudomonnas

Prévia do material em texto

Procedimento Operacional Padronizado (POP)
	Emissão: 25/09/2019
	Nº Folha:1/2
	
	POP- Microbiologia de Alimentos: Contagem Presuntiva de Pseudomonas spp em Carne e Produtos Cárneos
	
1. Objetivo: Padronizar o procedimento de contagem total de Pseudomonas spp em carne e produtos cárneos.
2. Descrição e Responsabilidade: A metodologia deve ser realizada por pessoas treinadas, tendo o conhecimento da nocividade dos reagentes utilizados e da importância de se padronizar a realização da análise.
3. Princípio: Baseia-se na quantificação de Pseudomonas spp em carne e produtos cárneos, através de semeadura da amostra diluída em ágar específico, por plaqueamento em superfície, seguida de incubação em estufa a temperatura e tempo específicos.
4. Materiais:
4.1. Béquer
4.2. Pipetador automático
4.3. Bastão de vidro
4.4. Pipeta graduada
4.5. Placas de Petri
4.6. Frasco de vidro com tampa e/ou Erlenmeyer
4.7. Tubos de ensaio
5. Equipamentos:
5.1. Balança analítica;
5.2. Micro-ondas;
5.3. Estufa Bacteriológica
5.4. Autoclave
5.5. Bico de Bunsen ou capela de fluxo laminar
6. Reagentes:
6.1. Água destilada
6.2. Água Peptonada Tamponada (APT)
6.3. Ágar Pseudomonas Base.
6.4. Glicerina ACS
6.5. Suplemento Cefalotina Fusidato Cetrimida
6.6. Álcool etílico 70%
6.7. Tiras para teste de oxidase
7. Pré-procedimento:
7.1. Ligar e estabilizar a estufa a 25ºC
7.2. Separar todos os equipamentos, as vidrarias e reagentes 
7.3. Realizar os cálculos para cada meio de cultura e solução.
8. Preparo dos Meios de Cultura e Soluções:
8.1. Água Peptonada Tamponada (APT): Preparar de acordo com as especificações do fabricante. Esterilizar em autoclave a 125°C por 15 minutos.
8.2. Ágar Cefalotina Fusidato Cetrimida (CFC): Preparar o ágar Pseudomonas base de acordo com as especificações do fabricante. Esterilizar em autoclave a 125°C por 15 minutos. Adicionar 10 ml de suplemento Cefalotina Fusidato Cetrimida para 1000 ml de ágar base.
Obs: após incorporar o suplemento, utilizar o ágar imediatamente, não reaquecer em hipótese alguma.
9. Preparo da Amostra
Pesar 25 gramas de amostra em balança analítica e adicionar em 225mL de Água Peptonada Tamponada (APT) em frasco estéril e homogeneizar, obtendo-se a diluição inicial 10-1. A partir da mesma, realizar as demais diluições decimais seriadas, transferindo assepticamente 1 ml da diluição 10-1 para tubo de ensaio contendo 9mL de APT, obtendo-se a diluição 10-2 e assim sucessivamente, conforme o necessário para a análise do produto.
10. Procedimento da Análise
10.1. Inoculação e Incubação
Selecionar três diluições e transferir assepticamente, com auxílio de pipeta automática, 0,1 ml de cada diluição sobre a superfície seca de placas de Petri contendo ágar CFC e identificadas. Espalhar o inóculo por toda a superfície do meio com auxílio de alça de Drigalski e deixar secar em superfície plana. Incubar as placas invertidas em estufa a 25° C durante 48 horas.
Realizar a leitura das placas, selecionando as placas com 150 colônias e contar todas. Selecionar cinco colônias presentes e submeter ao teste de oxidase para confirmação.
10.2. Teste de oxidase
Com auxílio de alça de platina ou palitos estéreis, transferir uma alçada da colônia presente na placa para uma tira de oxidase observando se ocorre o desenvolvimento de uma cor azul intensa, em 10 segundos, que indica teste positivo. O não aparecimento de cor azul nesse intervalo de tempo indica teste negativo.
Pseudomonas spp apresenta reação de oxidase positiva.
11. Cálculo
Após os testes confirmativos, calcular o resultado utilizando a seguinte equação:
R = (C x c x d) / r
Onde: 		
R = Resultado 		
C = número de colônias contadas		
c = número de colônias confirmadas		
d = diluição utilizada		
r = número de colônias repicadas
12. Referências Bibliográficas
BRASIL, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA. Instrução Normativa 62 de 26 de agosto de 2003 que oficializa os métodos analíticos para análises microbiológicas para controle de produtos de origem animal e água, Diário Oficial da União. Brasília-DF, p. 14-18, 2003.
SILVA, N. da. et al. Manual de Métodos de análise de microbiológica de alimentos e água. 5º ed. – São Paulo: Blucher, 2017.