PRATICA-CBL-Petrifilm (1)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO 
Fundação Instituída nos termos da Lei nº 5.152, de 21/10/1966 – São Luís - Maranhão. 
 
  
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CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS - PETRIFILMTM 
 
1. OBJETIVO 
 
Verificar a conformidade do suco clarificado de uva com a instrução normativa no 60, de 23 de 
dezembro de 2019 da ANVISA. 
 
2. INTRODUÇÃO 
 
Dentre os micro-organismos de importância em alimentos, os fungos compreendem um grupo de 
extrema importância, tanto por aspectos positivos quanto negativos. Vale ressaltar que dentro da 
classificação de fungos estão contidos os fungos filamentosos, popularmente denominados de 
“bolores”, e as leveduras. 
Os fungos filamentos impressionam, já a olho nu, pela variedade de formas, cores e texturas. Tal 
diversidade pode, também, ser observada no metabolismo destes micro-organismos e, 
consequentemente, nos problemas que podem vir a causar para a indústria de alimentos: desde o 
simples amolecimento e podridão de um vegetal, por exemplo, até a contaminação do leite por 
aflatoxina M1 devido, por exemplo, à ingestão pelo gado leiteiro de ração contaminada com 
aflatoxina B1. 
A contaminação de alimentos por fungos filamentosos tem origem, na maior parte das vezes, em 
práticas inadequadas de manipulação e estocagem. Isto porque, esporos destes micro-organismos 
podem ser encontrados distribuídos em todos os tipos de ambientes e destes ambientes podem ser 
carregados, pelo ar, para os locais de processamento de alimentos ou mesmo entrar em contato com 
produtos acabados. Não sendo possível evitar o contato de alimentos e/ou matérias-primas primas 
alimentares com esporos fúngicos, deve-se ter atenção ao controle de parâmetros como atividade de 
água, umidade do ar, temperatura e embalagem, entre outros, a fim de se evitar a proliferação do 
micro-organismo no produto. A adequada higienização do ambiente de processamento e utensílios 
torna-se, também, procedimento de extrema importância para redução da contaminação ambiental. 
A avaliação microbiológica dos alimentos constitui-se em um dos parâmetros mais importantes 
para se determinar: a vida de prateleira de um alimento, se este oferece algum risco à saúde do 
consumidor, sua microbiota e as condições de higiene em que este foi preparado. Esta avaliação é 
igualmente importante para verificar se padrões e especificações microbiológicas, nacionais ou 
internacionais, estão sendo cumpridos adequadamente. 
 
 
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Os métodos tradicionais recebem essa denominação, porque foram desenvolvidos há muitos anos 
e desde então vêm sendo empregados como métodos oficiais na maioria dos laboratórios brasileiros 
e também em outros países. Sendo esses descritos em publicações consideradas de referência, 
internacionalmente aceitas. Do ponto de vista laboratorial, as principais características desses 
métodos são: necessidade de muito material (vidraria, meios de cultura, reagentes, incubadoras, 
banhos, etc), muito trabalho, longo tempo para obtenção de resultados e a grande possibilidade de 
erro, tanto durante a execução da análise quanto durante a leitura e interpretação dos resultados. 
Devido estas características, estes métodos que têm sido empregados durante décadas, hoje se 
revelam bastante limitados para atender as novas necessidades do controle de qualidade de 
alimentos. 
A necessidade de maior agilidade no controle de qualidade na indústria de alimentos, em geral, 
apressou o desenvolvimento dos chamados métodos rápidos. Miniaturizados, modificados, semi ou 
totalmente automatizados, esses métodos são chamados rápidos ou porque requerem menos tempo 
para a execução da análise, ou porque permitem leitura mais rápida dos resultados. O uso desses 
métodos permite aumentar o número total de amostras analisadas por dia, mesmo que em alguns 
deles, o tempo de incubação seja similar ao dos métodos convencionais. 
Visando tornar mais eficiente a etapa de preparação do material necessário para efetuar contagens 
de micro-organismos em alimentos, vários sistemas comerciais “prontos para o uso” foram 
desenvolvidos. O mais antigo e o mais amplamente empregado nos laboratórios de alimentos do 
mundo inteiro são as placas PetrifilmTM, que foi desenvolvido pela 3M Company (St. Paul, MN, 
EUA) na década de 80, destacando-se como método alternativo para enumeração de micro-
organismos indicadores de higiene em alimentos em geral. 
A tecnologia PetrifilmTM está disponível no momento, para enumeração dos seguintes grupos de 
microrganismos: bactérias aeróbias totais, bolores e leveduras, coliformes totais e fecais, bactérias 
láticas, Escherichia coli, Enterobacteriaceae e Staphylococcus aureus. Os resultados destas 
contagens podem ser obtidos em 24 - 48 horas, com exceção dos bolores e leveduras, que são 
obtidos em 3 - 5 dias. Recentemente, foram desenvolvidas placas para contagem de coliformes em 5 
ml de produto, chamadas placas PetrifilmTM de Alta Sensibilidade (HSCC) e as placas PetrifilmTM 
RCC série 2000, que permitem “observar” coliformes presuntivamente a partir de 6 horas. 
A placa PetrifilmTM para a contagem de bolores e leveduras (YM), surgiu em 1991, e é 
constituída de meio saboraud modificado, goma guar, cloranfenicol e clortetraciclina, e um indicador 
de fosfatase. A incubação deve ser feita a 20 - 25°C por 3 a 5 dias. A área inoculada é de 30 cm2 e a 
 
 
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faixa de contagem entre 15 - 150 colônias. As figuras 1 e 2 mostram as placas PetrifilmTM YM, após 
incubação a 25°C por 5 dias, evidenciando o desenvolvimento na primeira de leveduras, e na 
segunda de bolores. 
 
 Figura1. Leveduras Figura 2. Bolores 
 
3. METODOLOGIA 
3.1. Materiais 
 
- Diluente: Água Peptonada 0,1%; 
- Tubos de ensaio; 
- Ponteiras; 
- Pipetas; 
- Placas PetrifilmTM YM Contagem Total (3M Company); 
- Difusor; 
- Estufa incubadora regulada a 20-25oC. 
 
3.2. Procedimento 
 
a. Preparação das diluições seriadas: transferir assepticamente, 25 mL de suco para 225 mL do 
diluente obtendo diluição 10-1. Em seguida, transferir 1,0 mL da diluição 10-1 para tubo de ensaio 
com 9,0 mL de diluente (10-2). Para obter a diluição 10-3, transferir 1,0 mL da diluição 10-2 para 9,0 
mL de diluente. 
b. Inoculação: posicionar as placas numa superfície plana. Selecionar três diluições adequadas da 
amostra para inoculação. Levantar o filme superior das placas PetrifilmTM para contagem de bolores 
e leveduras, e dispensar 1,0 ml da diluição da amostra sobre o centro do filme inferior. Colocar o 
filme superior sobre o inferior, e em seguida, posicionar o difusor Petrifilm TM para as placas 
especificadas, no centro destas. Distribuir a amostra uniformemente, pressionando o centro do 
 
 
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difusor. Após isto, remover o difusor e deixar a placa em repouso durante pelo menos 1 minuto para 
que o gel se forme. 
 
c. Incubação: incubar as placas na posição horizontal, com o lado transparente para cima em pilhas 
que não ultrapasse 20 placas, durante 5 dias a 20-25º C. 
 
 
 
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d. Contagem: após este período proceder a contagem das colônias características. O resultado será 
expresso em UFC/ ml. 
 
 
Para diferenciar colônias de fungos e leveduras, identifique uma ou mais das seguintes 
características: 
Leveduras – colônias pequenas; colônias que possuem bordos definidos; cor marrom-rosada ou 
verde-azulada; as colônias parecem elevadas (“3D”); as colônias possuem uma cor uniforme. 
Bolores – colônias grandes; colônias que possuem bordos difusos; cor variável; as colônias parecem 
planas; as colônias possuem centro escuro. 
Devido ao fato de que alguns bolores podem crescer rapidamente na placa PetrifilmTM, pode ser 
interessante ler e contar as placas com 3 dias e registrar os resultados, pois, pequenas colônias 
podem ser ocultadas pelos bolores maiores crescidos em 5 dias. Se isto acontecer, a contagem com 3 
dias pode ser usada; contudo deve ser reportada como uma contagem estimada. 
 
4. EXERCÍCIO DE FIXAÇÃO 
 
4.1. Por que quantificar fungos em alimentos? 
4.2. Diferencie os métodos tradicionais dos métodos rápidos. 
 
 
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4.3. Por que na contagem de bolores e leveduras utilizando a tecnologia PetrifilmTM, se faz 
necessário a leitura das placas com 3 dias? 
4.4. Qual a área inoculada e a faixa de contagem das placas PetrifilmTM para a contagem de bolores e 
leveduras? 
4.5. Quais as características das colônias de leveduras e bolores na contagem de bolores e leveduras 
pela tecnologia Petrifilm? 
4.6. Após a realização da contagem de bolores e leveduras obtivemos o seguinte panorama: 
10-1: Placa 1: 200 UFC/ g; Placa 2: 200 UFC/ g; 
10-2: Placa 1: 100 UFC/g; Placa 2: 100 UFC/ g; 
10-3: Placa 1: 10 UFC/ g; Placa 2: 10 UFC/ g. 
Qual diluição seria selecionada para contagem? Por quê? Expresse o resultado dessa análise. 
4.7. Cite 2 diferenças entre os métodos de contagem de bolores e leveduras pela técnica PetrifilmTR e 
Spread Plate. 
 
5. Referências bibliográficas 
 
- PEREIRA, K. S. Fungos e a contaminação de alimentos. 3M Food Safety, Edição 04, Julho 
2014. Disponível 
em:<http://solutions.3m.com.br/3MContentRetrievalAPI/BlobServlet?lmd=1410352958000&locale
=pt_BR&assetType=MMM_Image&assetId=1361815958348&blobAttribute=ImageFile>. Acesso 
em: 25 de Out. 2014. 
- SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A.; TANIWAKI, M. H.; SANTOS, R. F. 
S.; GOMES, R. A. R. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. São Paulo: 
Blucher, 5a ed., 2017. 560 p. 
- 3MTM Petrifilm. Guia de interpretação. Placa para a contagem de leveduras e bolores. 
Disponível em:<http://multimedia.3m.com/mws/media/587518O/guia-iterpretacao-petrifilm-
bolores.pdf?&fn=GuiaPetriLeveduraBolorYM.pdf>. Acesso em: 25 de Out. 2014. 
 
BOM ESTUDO!