Prática como Componente Curricular Biologia Molecular

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UNIP
Universidade Paulista
Prática como Componente Curricular Biologia Molecular
5º semestre
Aluno: Leandro Thomazini Caetano da Silva
Matricula: 2016826
Polo
Jundiai- SP
 Enzimas de restrição
 As enzimas de restrição são endonucleases que clivam em sequências específicas do DNA. Quase todas as enzimas de restrição reconhecem sequência palíndrômicas, isto é, quando uma das fitas for lida de 5’ - 3’ e a outra no mesmo sentido, elas serão as mesmas. 
Exemplos:
1) A enzima EcoRV reconhece a seguinte sequência: 5’ GATATC 3’ 3’ CTATAG 5’ 
2) A enzima TaqI reconhece a seguinte sequência : 5’ TCGA 3’ 3’ AGCT 5’ 
A enzima 1 foi isolada da Escherichia coli (Eco) e a enzima 2 foi isolada de Thermus aquaticus (Taq). A sequência reconhecida pela enzima de restrição é chamada de sítio de restrição.
As enzimas de restrição são muito utilizadas em laboratórios de Biologia Molecular.
Atividade
A sequência abaixo foi obtida de um banco de dados que armazena sequências. Essa sequência é fita simples e está representada seguindo a convenção, ou seja, de 5’ - 3’. 
GCCTTCAATGGCAAGCGGTCTGGAATCCTACTTCTTGAATCGGCACGGTGTCATTACGGGCGGGGGCCAGAACAACGTCCCTGGACATCACACCTAGCCCGTGCGA
CGGCGGAAACCTTCGCCGGCGCAGGCTTCGACGTGACCCTCATCGCGGAACCCTCCCCCACCCCAGTGTTGGCGTGGCTGGTGCGCTCACGGCGAATGGACGTG
GGCGTGCAGATCACCGCCTCGCACAATCGAATTCAGGACAACGGCTACAAGCTGTACCTGGACGGCGGCTCTCAGCTGGTCTCCCCCGCCGACCGGCAGATCGAG
GAGCACATTGCCGCCCAGCCAACTGACGCGGCGAAGATCCCCCGCTCCGAGGCGAAGTCTGTAGACCTGTCCGTAGTCTCCGGCTATGTCACCGAGCTAAGTACC
CTGGTGGCCACCGGCCGCCAATCCGAGCTGGCGCCGCGGCGGAAGCTGAAGATCCTCTACACCCCCATGCACGGCGTGGGCGGCAATGCCCTGGAGTGGGCCT
TACGTGAATTCGGCTTCGGCAACGTGCACGCGGTGGCCTCGCAGCGCTGGCCGGACCCGACCTTCCCGACTGTGGACTTCCCCAACCCTGAGGAGCCGGGTGCC
ACCGACGCGCTGCTGGAAGAAGCCCGCGCCATCGATGCGGACCTGCTGATCGCCCTGGATCCGGATGCGGACC 
Sabe-se que a enzima de restrição BamHI corta um DNA fita dupla do seguinte modo e no seguinte sítio (veja figura).
GGATCC
CCTAGG
a) Quantos sítios de restrição existem nessa sequência? 
R: Foram localizadas na primeira linha 10 sítios de restrição na sequencia apresentada existe um desalinhamento onde dificulta um pouco a localização. Na última linha não tem como seguir com a sequência por não completar os pares.
 
b) Faça uma pesquisa sobre os tipos de cortes das enzimas de restrição. Descreva-os e classifique o corte da enzima BamHI.
R: Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, em vez de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. BamHI é uma enzima de restrição, derivada de Bacillus amyloliquefaciens. A sua sequência de reconhecimento é (G'GATCC), e deixa uma extremidade coesiva.
c) O gel abaixo apresenta, na canaleta 1, um padrão de peso molecular onde as bandas representam sequências com 50bp, 80bp, 200bp e 1000pb. Suponha que o DNA acima tenha sido clivado pela enzima PvuII e represente, na canaleta 2, os fragmentos resultantes do corte.
1 2
_ _ _ _
- -
= -
-
R: O sitio de clivagem identificado por PyuII: 5’ C AGCTG 3’
H á apenas um sitio de restrição na sequência acima, dividindo a fita simples em 
duas partes. O fragmento menor tem cerca de 280 bases nitrogenadas, portanto 140pb, ficando entre as sequencias 80 e 200pb. O fragmento maior tem em torno de 410 bases, ou seja, 205 pb, ficando um pouco depois dos 200 pb.