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Aulas Práticas Tecnologia de Leite e Produtos Derivados Montes Claros 2021 FACULDADES INTEGRADAS DO NORTE DE MINAS - FUNORTE CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA PROFESSORA: PRISCILLA MARIA CARVALHO OLIVEIRA PRÁTICA 1 – QUANTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS E AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU REFRIGERADO, LEITE PASTEURIZADO PADRONIZADO E LEITE UHT. Introdução O método de contagem de microrganismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado tanto para contagem de grandes grupos microbianos, como os aeróbios mesófilos, os aeróbios psicrotróficos, os fungos filamentosos e leveduras e os clostrídios sulfito redutores, como também para a contagem de gêneros e espécies em particular, como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens, por exemplo. Essa versatilidade é decorrente do princípio do método, que se baseia na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado, uma colônia visível e isolada. Variando o tipo de meio (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio seletivo-diferencial) e as condições de incubação (temperatura e atmosfera), é possível selecionar o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar. Como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, tétrades, cachos, cadeias, etc.), não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de células. A relação correta é feita entre o número de colônias e o número de “unidades formadoras de colônias” (UFC), que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de certos microrganismos. Procedimento 01.Pesar 25 grama do alimento a ser analisado; 02. Colocar o material em recipiente contendo 225 ml de água tamponada estéril(diluição 10-1); 03. Transferir 1 ml para um tubo contendo 9 ml de água tamponada (diluição10-2); 04. Transferir 1 ml do tubo de diluição10-2 para um tubo contendo 9 ml de água tamponada (diluição10-3); 05. Inocular 0,1 ml de cada diluição em placas contendo agar padrão de contagem (PCA); 06. Espalhar com alça de Drigalski; 07. Incubar as placas em estufa a 35°C por 48 horas (aeróbios mesófilos) e em temperatura de refrigeração por 10 dias (aeróbios psicrotróficos) ; 08. Contar as placas, que tenham entre 25 a 250 UFC. Resultados: Para se obter o número de unidades formadoras de colônias por grama do substrato, multiplica-se o número de colônias obtidos pelo fator de diluição e divide-se o resultado pelo volume inoculado na placa. PRÁTICA 2: QUANTIFICAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES EM LEITE CRU REFRIGERADO, LEITE PASTEURIZADO PADRONIZADO E LEITE UHT. Introdução Definição do grupo de coliformes totais ou coliforme a 35°C: O grupo dos coliformes totais inclue as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a 35°C. O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais encontram-se tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal de humanos e outros animais de sangue quente, como também diversos gêneros e espécies de bactérias não entéricas, como Serratia e Aeromonas, por exemplo. Por essa razão, sua enumeração em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do que a enumeração de coliformes fecais ou E.coli. Porém, sua presença em alimentos processados é considerada uma indicação útil de contaminação pós-sanitização ou pós-processo (principalmente no caso da pasteurização), evidenciando práticas de higiene e sanificação aquém dos padrões requeridos para o processamento de alimentos. Definição do grupo de coliformes fecais ou termotolerantes: A definição é a mesma de coliformes totais, porém, restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24h a 44,5 45,5°C. Esta definição objetivou, em princípio, selecionar apenas os coliformes originários do trato gastrintestinal. Atualmente sabe-se, entretanto, que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três gêneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. Por esse motivo, a presença de coliformes fecais em alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do que a enumeração direta de E.coli, porém, muito mais signi- ficativa do que a presença de coliformes totais, dada a alta incidência de E.coli dentro do grupo fecal. E.coli. Dentre as bactérias de habitat reconhecidamente fecal, dentro do grupo dos coliformes fecais, E.coli é a mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos membros não fecais. Todos os demais membros do grupo têm uma associação duvidosa com a contaminação fecal e E.coli, embora também possa ser introduzida nos alimentos a partir de fontes não fecais, é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido até o momento. Procedimento 1. Pesar 25 g grama do alimento a ser analisado e triturar em liquidificador doméstico com 225ml de água peptonada (diluição 10-1) ; 2. Pipetar 1 ml do frasco de 250 ml em tubo contendo 9 ml de água peptonada estéril (diluição 10-2); 3. Transferir 1 ml do tubo (diluição 10-2) para um tubo contendo 9 ml de água tamponada (diluição10-3); 4. Transferir 1 ml de cada diluição para os tubos contendo caldo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) – Teste presuntivo; 5. Incubar os tubos de LST a 35°C por 24 horas e observar se há crescimento com produção de gás. Em caso positivo passar para os íntens subseqüentes. Em caso negativo, reincubar até completar 48 horas e repetir a leitura; 6. Contagem de Coliformes totais: Tomar os tubos de LST com produção de gás e transferir uma alça bem carregada de cada cultura para tubos de caldo Verde Brilhante Bile (VB). Incubar a 35°C por 24-48 horas e observar se há crescimento com produção de gás. 7. Anotar o número de tubos de VB com gás, confirmativo da presença de coliformes totais e determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou ml na tabela. 8. Contagem de coliformes fecais ou termotolerantes: Tomar os tubos de LST com produção de gás e transferir uma alça bem carregada de cada cultura para tubos de caldo E.coli (EC). Incubar em banho Maria a 45,5°C por 24 horas e observar se há crescimento com produção de gás. 9. Anotar o número de tubos de EC com produção de gás, confirmativo da preença de coliformes fecais ou termotolerantes e determinar o Número Mais Provável (NMP)/g ou ml na tabela. RESULTADOS Coliformes Totais ou a 35°C Caldo VB 10-1 10-2 10-3 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Resultado Coliformes Totais ou termotolerantes Caldo EC 10-1 10-2 10-3 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Resultado PRÁTICA 4 - PROVA DO ALIZAROL Introdução Essa prova é conhecida por muitos como “o teste de plataforma”, pois é utilizado como teste para verificar a acidez e estabilidade térmica de todo leite que o laticínio recebe. Esse teste é conveniente pela rapidez e baixo custo. O teste utiliza uma a solução de alizarol, que é uma combinação entre uma solução alcoólica a 68° GL mais um indicador, a alizarina. A solução alcoólica mede a estabilidade do leite, ou seja, capacidade de suportar tratamentos térmicos elevados, e a alizarina indica o grau de acidez do leite. Material necessário: - solução de alizarol a 68°GL - tudo de ensaio - suporte para tubos de ensaio - pipetas volumétricas de 2 ml Procedimento Transferir para o tubo de ensaio, 2 ml do leite a ser analisado e 2 ml da solução de alizarol. Foi criado um procedimento mais rápido utilizando um equipamento denominado “acidímetro de salut” (pistola de alizarol) que dosa automaticamente oleite e a solução, tornando a prova muito rápida. Interpretação dos resultados: - coloração parda-avermelhada (tijolo) sem coagulação: leite normal (acidez entre 14 e18°D) - coloração parda-avermelhada com coagulação fina: acidez entre 19 a 20°D - coloração amarela com coagulação: leite ácido maior que 21°D - coloração violeta: leite alcalinizado ou fraudado com água. PRÁTICA 5 - ACIDEZ PELO MÉTODO DE DORNIC (MÉTODO VOLUMÉTRICO) Introdução O leite fresco apresenta acidez devido à presença de caseína, fosfatos, albumina, dióxido de carbono e citratos. Esta acidez natural varia entre 0,13% e 0,17%, expressa como massa de ácido lático (13°D a 17°D). A acidez do leite pode aumentar através da hidrólise da lactose por enzimas microbianas (fermentação), que leva à formação de ácido láctico. Se esta acidez desenvolvida for muita elevada, o leite é impróprio para consumo, pois ela indica alta atividade microbiana. A determinação da acidez do leite é uma das medidas mais usadas no controlo de matéria-prima pela indústria leiteira e permite avaliar o estado de conservação do produto. Caso o leite não tenha sido acondicionado adequadamente após a ordenha, o número de microrganismos presentes será bastante elevado. Como resultado do metabolismo dos microrganismos, teremos um aumento da acidez do produto. O teste é usado para classificar o leite e também como um guia para controle da manufatura de produtos como o queijo. A acidez titulável é expressa em graus Dornic (oD) ou em porcentagem (%) de ácido láctico. O leite fresco normal não contém ácidos, mesmo assim ele apresenta uma acidez detectável pela técnica da titulação. Isso indica que a substância química usada no teste da determinação na titulação combina com algumas substâncias presentes no leite fresco e lhe confere essa acidez aparente; O método de determinação de acidez por graus Dornic baseia-se na neutralização do ácido láctico do leite, através da adição de uma solução diluída de hidróxido de sódio, na presença de um indicador, que permite visualizar quando todo o ácido foi neutralizado, e desta forma pelo volume gasto, de hidróxido de sódio, podemos determinar a acidez exata de um determinado leite, desde que a amostra coletada seja representativa da totalidade do leite (FOSCHIERA, 2004). Material necessário - bureta com capacidade de 10 ml com intervalo de graduação de 0,05 ml ou acidímetro de Dornic; - pipeta volumétrica de 10 ml - erlenmeyer de 125 ml ou um Becker de 50 ou 100 ml -soluções: - NaOH 1/9 mol/L (solução Dornic) - indicador fenolftaleína 1% - amostra devidamente coletada Procedimento: -Transferir 10 ml do leite para o erlenmeyer utilizando a pipeta volumétrica; - adicionar 5 gts do indicador; - titular com a solução Dornic até ponto de viragem (coloração rosa claro); - proceder a leitura do volume gasto de sol. Dornic. Cada 0,1 ml gasto na titulação corresponde a 1°D que por sua vez corresponde a 0,1 g de ácido lático por litro ou 0,01% de acidez, a qual é expressa em ácido lático. Resultados A acidez do leite pode vir expressa em várias formas: ml NaOH normal/l de leite: Acidez = 10 × V; ˚ Dornic: Acidez = 9 × V; ˚ Soxhlet – Henkel: Acidez = 4 × V; % de ácido láctico (g/100ml): Acidez = 0,9 × V; PRÁTICA 6 - PROVA PELO ÁLCOOL Introdução A prova pelo álcool destina‐se a verificar se o leite coagula devido á adição de álcool. É uma prova muito simples e de rápida execução, econômica e considerada a prova de tampar o tubo e inverte-se, lentamente, observando a escorrência nas paredes do tudo. Materiais Os materiais, reagentes e equipamentos utilizados para a prova do Álcool são: Tubos de ensaio marcados com 5 e 10cc e álcool a 68‐70%; Pipetas. Amostras As amostras utilizadas para a determinação do álcool são: A. Leite normal (vaca); B. Leite ácido; C. Colostro Procedimento Num tubo de ensaio deitam‐se volumes (5cc) iguais de leite a analisar e álcool. Rolhar e inverter o tubo, lentamente, 2 vezes e observar a escorrência nas paredes do tubo. Resultados A prova é negativa, se o leite escorre sem formar grumos ou flocos (leite com uma acidez normal não coagula). A prova é positiva quando da formação de grumos ou flocos e indica que o leite tem acidez elevada ou pode ocorrer quando da existência de leites mamíticos ou de colostro (ricos em sais minerais/desequilíbrio salino). PRÁTICA 7- DETERMINAÇÃO RECONSTITUINTES DE DENSIDADE Introdução O objetivo é Identificar a presença de substâncias adicionadas ao leite a fim de aumentar o teor de sólidos ou mascarar fraude por aguagem. Cloretos (sal) Fundamento da Análise O nitrato de prata reage com os cloretos, em presença de cromato de potássio como indicados. Teores superiores à concentração norma de cloretos no leite produzem coloração específica no teste. Materiais Pipeta graduada de 1 ml; Pipeta graduada de 5 ml; Pipeta graduada de 10 ml; Tubo de ensaio de 20 x 200 mm; Solução de cromato de potássio a 5% (m/v); Solução de nitrato de prata 0,1 N ou 0,1 mol/L. Procedimento Em tubo de ensaio colocar 10 ml de leite. Adicionar 0,5 ml de solução de cromato de potássio 5% e 4,5 ml de solução de nitrato de prata 0,1 N ou 0,1 mol/L. Agitar. Resultado Positivo – presença de cloretos em quantidades superiores à faixa normal (0,008 a 0,1 %): coloração amarela. Negativo – coloração marrom avermelhada (variando de alaranjado escuro ao vermelho-tijolo). PRÁTICA 8 - DETERMINAÇÃO DE AMIDO Introdução O aquecimento da amostra promove a abertura da cadeia helicoidal da molécula de amido e ocorre então a formação de um composto azul de adsorção do iodo (solução de iodo/iodeto de potássio – lugol), como o desenvolvimento da coloração característica após resfriamento. Materiais Bico de Bunsen; Pipeta de ensaio de 10 ml; Tubo de ensaio de 25 ml; Conta - gotas; Solução de Lugol; Pinça para tubo de ensaio; Estante para tubos de ensaio. Procedimento Transferir 10 ml de leite para tubo de ensaio. Aquecer até ebulição em banho-maria, e deixar por 5 minutos. Esfriar em água corrente. Adicionar 2 gotas de solução de Lugol. Observar a coloração produzida. Resultado Positivo – presença de amido: coloração azul Negativo – ausência de amido: coloração laranja da solução de lugol. PRÁTICA 9 - DETERMINAÇÃO DE CONSERVADORES Objetivo Tem por objetivo avaliar a presença de substâncias adicionadas, fraudulentamente, ao leite, a fim de conservar suas propriedades físico-químicas, inibindo o desenvolvimento de microrganismos contaminantes. Esse tipo de fraude mascara deficiências da higiene nas etapas de ordenha, acondicionamento e transporte. Pesquisa de Peróxido de hidrogênio (Água Oxigenada) Método Guaiacol Fundamento da Análise A peroxidase, enzima natural do leite, age sobre o peróxido de hidrogênio, liberado oxigênio, permitindo a reação com o guaiacol. Este é modificado da forma leuco para sua forma corada, e a reação é percebida pelo desenvolvimento da coloração salmão. O teor de peroxidase é mais alto em leite cru, contribuindo para sensibilidade do teste. Materiais Banho – Maria; Pipeta graduada de 2 ml; Pipeta graduada de 10 ml; Tubo de ensaio; Estante para tubos de ensaio; Solução hidroalcoolica de guaiacol a 1 % (v/v). Procedimento Transferir 10 ml da amostra para tubo de ensaio, e aquecer em banho – Maria até 35ºC. Adicionar 2 ml da solução hidroalcoolica de guaiacol a 1% e 2 mL de leite cru. Agitar. Resultado Positivo : desenvolvimento de coloração salmão PRÁTICA 10 - PROCESSAMENTO DE QUEIJO Processamento de Queijo Minas Frescal IntroduçãoO queijo tipo minas frescal é de massa crua, coagulação enzimática, moldado na forma de um cilindro baixo e pesa de 0,5 kg a 1 kg. É um queijo que apresenta consistência macia e pequenas aberturas mecânicas nos pontos onde a massa não se uniu completamente. Devido a adoção de diferentes métodos de fabricação além do tradicional (adição de ácido lático, ultrafiltração, variação na temperatura de coagulação e mesmo prensagem) é um queijo bastante irregular em termos de padrões de consistência, textura, sabor, vida útil e rendimento. Materiais - 5 litros de leite pasteurizado (em saquinho) tipo B ou tipo C - 3 ml de cloreto de cálcio - 1 ml de coagulante quimase - 1 termômetro para laticínio - 2 formas para queijo Minas Frescal (500g) Métodos 1. Depositar o leite na panela e aquecer até atingir a temperatura de 37 C (utilizar o termômetro para controlar a temperatura). 2. Desligar a chama e fazer a adução dos ingredientes, distribuindo de forma uniforme sobre o leite mexendo por 1 minuto para cada adição na seguinte ordem (cloreto de cálcio e por ultimo o coagulante quimase). 3. Após a adição do coagulante deixar o leite em repouso por um período de 20 a 30 minutos, verificando se ocorreu a formação de uma coalhada lisa, firme e compacta. Observe se a mesma começou a desprender da panela, este é um sinal do ponto para se cortar a coalhada). 4. Com auxilio de uma faca, faça cortes paralelos e cruzados pela extensão da panela, numa distancia de uns três centímetros entre um corte e outro corte. 5. Após o corte deixe em repouso por um período de 5 min (observe a formação de soro com uma tonalidade esverdeada, sinal de que o processamento esta ocorrendo de forma correta). 6. Após o repouso, inicie a mexedura, com movimentos circulares pro toda a extensão e profundidade da panela. A medida que a massa vai se firmando, mais soro vai sendo expulso de seu interior e a massa vai ficando mais rígida. 7. O ponto do queijo ocorre após 20 a 30 min contados a partir do momento do corte. A massa mais firme deposita-se com facilidade no fundo da panela e apresenta certa rigidez. 8. A massa deverá então, ser colhida com auxílio da concha e depositada na forma. Observe que quando isto ocorre, o soro flui com certa velocidade pelos furos da forma, ficando somente a massa. A altura do queijo é regulada neste momento (importante lembrar que a massa deverá ainda se acomodar, com a expulsão de mais soro). 9. Após a enformagem, deixar em repouso por 10 minutos e fazer a viragem do queijo. 10. Após a viragem do queijo, adicionar 10 gramas de sal sobre cada superfície distribuindo de forma uniforme. 11. Após a salga os queijo devem ser levados para a geladeira sendo virados em torno de 30 minutos. Obs.: Em caso de queijo condimentado, antes de enformar a massa retirar a metade da quantidade de soro, adicionar os condimentos (pimenta calabresa, orégano, pimenta do reino) e misturar a massa (antes do momento do ponto) e enformar normalmente. PRÁTICA 11 - PROCESSAMENTO DE RICOTA Introdução A ricota é obtida com o soro desprezado durante a fabricação de outras qualidades de queijos, com grande porcentagem de albumina, proteína não coagulada pela ação enzimática do coalho, porém elevado valor nutritivo. Possui baixo teor de gordura e por isso é indicada para pessoas em regime dietético ou doentes, por ser a ricota de fácil digestão. Usa-se para a fabricação de ricota, soro fresco de queijos comuns, dando-se preferência para soros de queijos de massa crua. Materiais - 10 litros de soro de queijo - 1 copo de leite desnatado ou integral - 1 envelope de ácido cítrico - 1 envelope de bicarbonato de sódio - 1 termometro para laticínio - 1 tela refratária - 1 forma de queijo Métodos 1. Para o preparo da ricota utiliza-se o soro fresco que deve ser utilizado imediatamente após a fabricação do queijo e coado. 2. Ao soro já depositado na panela e devidamente coado, adiciona-se o envelope de bicarbonato de sódio. 3. Aqueça o soro utilizando tela refratária, mexendo até que o soro atinja a temperatura de 75C. Neste momento adicione o leite e continue o aquecimento. 4. Para a extração da proteína do soro que na realidade é a ricota é necessário a continuidade do aquecimento até que se atinja a temperatura de 90 C, mexendo sempre e medindo a temperatura com o termômetro. 5. Quando a temperatura de 90 C for atingida, diminuir a fonte de calor e adicionar o ácido cítrico previamento dissolvido em 1 copo de água filtrada. 6. Ao adicionar o ácido cítrico, reduza a chama ao mínimo e observe a formação de uma massa subindo a superfície. A massa forma-se completamente sobre a superfície da panela e o soro apresenta nova tonalidade, mais esverdeada. Desligue a chama e recolha a massa levemente, depositando na forma. 7. O sal é opcional e pode ser polvilhado sobre a superfície da ricota ou adicionado sobre a massa antes da enformagem. Decorridos 30 min de enformagem, a ricota pode ser virada para outra forma, permitindo o acabamento externo. Deve ser acondionada na geladeira e consumida imediatamente, refrigerada ou adicionada de condimentos. PRÁTICA 12 - PROCESSAMENTO DE IOGURTE Introdução Depois do queijo, o iogurte pode ser considerado o produto lácteo fermentado mais importante no mercado brasileiro. Existem muitos tipos de iogurtes de fabricação industrial: iogurte de consistência firme, iogurte batido, iogurte líquido, aromatizados, com polpa de frutas, etc. No entanto, a mistura básica de ingredientes é essencialmente a mesma. Iogurte é um produto lácteo obtido pela fermentação láctica, através da ação de Streptococcus salivarius subsp thermophillus e do Lactobacillus debrueckii subsp bulgaricus, do leite integral ou desnatado e produtos lácteos (leite pasteurizado ou concentrado) com ou sem adição de opcionais (leite em pó integral ou desnatado, soro em pó, etc). O leite pode ser integral ou parcialmente desnatado e deve ser de boa qualidade bacteriológica, isento de antibióticos ou outros agentes microbianos. Os microrganismos inoculados ao produto devem ser viáveis e abundantes. Materiais - 3 a 5 litros de leite - 1 envelope de fermento - Adicionar o açúcar (opcional) - 1 termômetro para laticínio - 1 tela refratária Procedimento 1. Em uma panela adicione o leite e açúcar (mantendo a tela refratária no fundo da panela para evitar a queima do leite no decorrer do aquecimento) e aquecer até atingir a temperatura de 80 C, sempre mexendo e conferindo a temperatura do leite com o termômetro. 2. Atingida a temperatura desligue a chama e mantenha a panela tampada por 10 min. 3. Após 10 min, inicie o resfriamento do leite até atingir a temperatura de 42 C (esta temperatura proporciona o desenvolvimento do fermento) 4. Após atingir a temperatura de 42C adicionar o fermento e mexer por alguns segundos. Tampe a panela e deixe fermentar (neste período o fermento consome parte da lactose). A partir deste momento inicia-se o processo de fermentação do leite e sua transformação em iogurte. Esse processo ocorre em um período de até 6 horas. 5. Durante este período é importante que o leite fique o mais próximo possível com a temperatura mantida em 42 C nos quais o fermento foi adicionado. 6. Após o período de fermentação (4 a 6 horas) verifique a formação de uma massa firme, compacta, com brilho e aromática. 7. Armazene o iogurte em potes de plástico devidamente higienizados e mantenha-os refrigerados.
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