Superovulação e TE em bovinos

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Letícia Beatriz Mazo Pinho | UAM | Proibida comercialização desse resumo
Superovulação na transferência de embriões em bovinos 
A transferência de embriões em bovinos vem acompanhada de superovulação, nos eqüinos isso não é possível, e por isso não é feita nessa espécie. 
Na superovulação, buscamos que vários folículos chegam ao estado pré ovulatório e liberem vários óvulos. A transferência de embriões é uma biotecnologia que nos permite recolher embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para uma fêmea receptora. Na TE o embrião se desenvolve, inicialmente, dentro da fêmea doadora. Nesse momento, a produção dos embriões é in vivo, na FIV, os embriões não se desenvolvem na fêmea doadora. 
Produção in vivo e suas vantagens
Programa de Transferência de Embriões
Essa biotecnologia nos permite melhorar o aproveitamento do potencia genético das fêmeas; redução do intervalo entre gerações, já que no sistema natural essa fêmea gestaria um bezerro por ano (no melhor das hipóteses); controle da transmissão de doença infecto-contagiosas; facilidade de comércio, uma vez que, ao invés de vendermos um animal, coletamos e congelamos seu material genético (embriões) e o enviamos. Na IA, teremos em 5 anos, na melhor das hipóteses, 5 bezerros, enquanto na TE teremos no mesmo período de tempo, com por exemplo 4 coletas por ano, gerando por colega normalmente de 6-8 embriões, e considerando uma taxa de 40% de eficácia, 40 bezerros (8/ano).
Atualmente a TE é mais realizada nas fêmeas de raça taurina e de corte, isso não é uma regra e varia de acordo com a fazenda. As vacas holandesas, devido sua origem, sofrem muito com altas temperaturas, assim, e algumas fazendas fazem o uso estratégico da TE nas fases de menor eficiência da IA (vantagem). Assim, durante a época do calor, as novilhas de genética superior, uma vez que são mais novas, não estão em lactação e são mais férteis, farão a TE para as vacas. 
O gráfico mostra que em épocas mais frias do ano (junho-agosto) as vacas de bovinocultura de leite, uma vez que, não sofrendo com estresse térmico durante a lactação, haja visto que esse fator reduz a qualidade do seu óvulo, tendem a aumentar sua taxa de concepção. 
Produção in vivo e suas desvantagens
Programa de Transferência de Embriões
Quando comparada a IA, a TE é um processo mais trabalhoso, uma vez que, nos bovinos, além da TE, faremos a superovulação. Há necessidade de preparação técnica, enquanto na IA pessoas não especializadas podem realizá-las. Pelo uso de hormônios e ocorre lavagem do útero, temos maiores custos financeiros quando comparado a IA. 
Seleção de receptoras
A receptora deve estar em atividade cíclica regular e em condições corporais, pois iremos sincronizá-la junto a doadora, visto que o embrião deve chegar nas mesmas questões hormonais e ambientais quando saído da doadora. Além disso, ela deve estar livre de doenças ou anomalias do trato reprodutivo, seu porte deve ser adequado/parecido com o porte da raça do embrião a ser transferido, uma vez que isso pode causar problemas no parto, visto que uma vaca pequena está acostumada a gerar bezerros condizente com sua raça. 
O principal requisito buscado em uma receptora é a de boa habilidade materna e rusticidade (zebu+taurina), pois será ela que irá gestar e cuidar do bezerro nos primeiros meses de vida.
Seleção de doadoras
Os índices zootécnicos são importantes na escolha das doadoras, tanto em performance produtiva quanto reprodutiva: 
· Alta produção de leite
· Curva de lactação longa
· Livre de mastite
· Sem problemas de casco 
· Fértil e sem problemas ao parto 
· Maior rendimento de carcaça
A doadora terá potencial genético superior, pensando na receptora, esse critério não se aplica. A doadora não deve estar em anestro, no protocolo hormonal temos objetivo de produção de muitos óvulos, por isso ela deve estar em atividade cíclica regular, e para isso ela deve: 
· Boa condição corporal 
· Livre de doenças infecto-contagiosas 
· Não apresentar anomalias congênitas ou hereditária
Superovulação
Nas vacas, o programa de TE começa com o protocolo de superovulação, onde o objetivo é que os folículos que na fase de seleção não entrem em atresia, uma vez que houve diminuição do FSH, já que o folículo dominante além de ter mais receptores para LH também produz a inibina. 
Assim, o protocolo de superovulação é baseado na administração exógena de FSH para que haja desenvolvimento dos outros folículos, isso deve ser feito na fase de recrutamento, uma vez que, na fase de seleção ou desvio, o folículo dominante vai para cima e os demais para baixo, entrando em atresia. 
Na superovulação temos dois protocolos: 
Observação de cio: nesse protocolo se observa o cio da doadora, a superovulação será feito na doadora, lembrando sempre da manipulação do ciclo de ambas para que estejam sincronizadas. No estro iremos marcar D0, após o estro vem o metaestro com ovulação e formação do corpo lúteo, após a ovulação ocorre uma onda folicular (7 dias), e por volta do D9, quando ocorre a segunda onda folicular, se inicia o tratamento superovulatório, pois o protocolo de faz na fase de recrutamento. Esse tratamento se faz com 8 aplicações em doses decrescente de FSH a cada 12h, no 3º dia de tratamento (D11), iremos fazer a aplicação de PGF2a para luteólise do CL, pois enquanto o corpo lúteo produzir progesterona não temos a ovulação e conseqüentemente não se tem pico de LH. O tratamento se inicia na segunda e não na primeira onda folicular (D9 – 9 dias após o estro na fase de recrutamento da segunda onda folicular), pois no 3º dia da primeira onda folicular essa fêmea estaria no metaestro e o CL não responde a PGF exógena nessa fase, além da progesterona estar alta impedindo a ovulação. No D11 iremos aplicar PGF para que os níveis de progesterona caia, os folículos estarão se desenvolvendo e produzindo estrógeno, com a lise de CL e queda da produção de progesterona, temos o pico de LH e depois ovulação. Após o tratamento e com a fêmea entrando no cio se inicia a primeira inseminação que será baseada no padrão convencional. Nem todos os folículos irão ovular no mesmo momento, e por isso, na superovulação, se faz uma inseminação 12h após a manifestação do estro e a outra 12h após a primeira inseminação.	Comment by Letícia Beatriz : Quanto tempo dura uma onda, exemplo, o protocolo com observação de cio é feito na segunda onda folicular pq se feito na primeira, no 3º dia ela estaria no metaestro, mas como eu sei que no 3º dia a onda está no metaestro? 
Protocolo com observação de cio – desvantagens 
· Impossibilidade de controle da emergência folicular 
· Grande variabilidade de resultados 
· Necessidade da espera da manifestação de cio 
· Grande variação do desenvolvimento dos embriões coletados 
Protocolo de superovulação e transferência de embriões em tempo fixo – SOVTF/TETF
Nesse protocolo não se observa o cio das vacas doadoras, será feita aplicação de estrógeno e implante de progesterona na tentativa de induzir atresia do folículo dominante e reinicio de uma nova onda
Nesse protocolo, o D0 não será a manifestação do cio das vacas, mas sim o dia que iremos aplicar E2 e colocar o implante de P4 (retirado no D7). Os folículos das vacas vão entrar em atresia e irá começar uma nova onda folicular na seqüência (normalmente após 2 dias), onde no D4, faremos um tratamento com FSH com 8 aplicações em doses decrescentes a cada 12h, no 3º dia de tratamento com o FSH ou D6 faremos a aplicação da PGF 2ª (lise do corpo lúteo e diminuição da P4 endógena). No D7 retirada a fonte exógena de progesterona teremos vários folículos produzindo E2, assim, no D8, aplicamos o hCG de manhã, que tem ação estimulante na liberação do núcleo pulsátil fazendo o pico de LH e após 12h da aplicação faremos a primeira inseminação e após 12h da primeira inseminação fazemos a segunda. 
· Eliminam a detecção de cio 
· Evita a necessidade de IA noturna 
· Melhor sincronização da ovulação e estágio de desenvolvimento dos embriões 
· Melhor aproveitamento do sêmen 
· Melhor taxa de ovulação 
Após o protocolode superovulação e IA, aguardaremos alguns dias para lavagem do útero (6-8d) para coleta dos embriões (fecundação e desenvolvimento dos óvulos). No dia da coleta de embriões devemos chegar se o animal respondeu ao tratamento de superovulação, sabendo que o corpo lúteo nas vacas se projeta para superfície e é mais firme, podemos por palpação senti-los, além disso podemos fazer o uso da US durante ou após o tratamento superovulatório, onde veremos a formação dos folículos
Colheita de embriões
· Após lavagem do útero e confirmação da resposta superovulatória do animal preparamos o material com ambiente limpo, sonda, mangueira e filtros siliconados estéreis além da higienização da doadora (1L PBS + 1% SFB a 37º). 
· Anestesia epidural: para retirar sensibilidade de reto, vagina e útero, aplicação de lidocaína na articulação sacrococcígea ou entre as vértebras coccígea
· Limpeza da região perineal para introdução e fixação da sonda dentro do útero. Introduziremos a sonda de Folley, lembrar de utilizar o mandril para que ela fique estável e que possa passar pelos anéis cartilaginosos (cervicais) do animal, e então, com a palpação retal, diferente da IA onde paramos no útero, vamos até o início do corno uterino que possuí o ovário superovulado e iremos inflar o balão para fixação da sonda. 
· Proceder a lavagem do útero colocando e retirando o PBS do filtro, acompanhando a sonda de Folley temos o tubo Y, uma extremidade será acoplada na bolsa de PBS e a outra no filtro, esse é um circuito fechado pois permitimos que o PBS entre dentro do útero enquanto os embriões entrem do animal para o filtro. Esse procedimento corre junto a massagem pela palpação retal na tentativa de estimular a saída dos embriões do útero.
Manipulação e avaliação 
· Lavar o filtro e colocar o líquido em placas de petri para que os embriões continuem em condições úmidas (similares ao do útero) 
· Localizar os embriões com lupa 10 a 20x (embriões de eqüinos são vistos a olho nu)
· Localizados os embriões, iremos realizar uma avaliação quanto ao estágio e qualidade embrionária
· Estágio: sincronia com a receptora (embriões mais velhos [blastocisto] serão colocados em receptoras no final do diestro e vise versa)
· Qualidade: capacidade de resistir ao congelamento/transferência 
· Meio holding
 Estágio embrionário
Após a fecundação (união do gameta feminino e masculino) teremos a formação do zigoto (primeiro dia após a ovulação), essa célula passará a sofrer mitose, onde uma célula mãe produz duas células filhas, que com o passar do dia sofrerá sucessivas clivagens. No caso da TE, utiliza-se 5 estágios de desenvolvimento: 
· Mórula inicial: embrião com aglomerado de blastômeros distinguidos, com sua superfície celular delimitada (5-6d após ovulação)
· Mórula compacta: não é possível identificar e distinguir os blastômeros, mas sim um aglomerado celular único (6d) 
· Blastocisto inicial: formação de cavidade com líquido (blastocele) (7d)
· Blastocisto: aumento da blastocele (7-8d)
· Blastocisto expandido: (8-9d)
Qualidade do embrião
A qualidade do embrião irá influenciar no congelamento e destino do embrião, embriões de melhor qualidade serão destinados a receptoras boas. Na literatura podemos encontrar várias formas de classificação do embrião: 
Classificação de acordo com a Sociedade Internacional de Transferência de Embriões
Grau 1: Embrião excelente ou bom
Será o embrião com estágio de desenvolvimento compatível ao esperado, ele possui massa embrionária simétrica, de coloração e tamanho uniforme, com zona pelúcida lisa e intacta, além de ter menos de 15% de células extrusadas (célula que não segue a seqüência de divisões celulares e se degenera)
Grau 2: Embrião Regular
Será o embrião com estágio de desenvolvimento compatível ao esperado, apresenta irregularidades moderadas na forma geral, com alteração de tamanho, formato, massa embrionária, cor e densidade. Sua zona pelúcida estará intacta além de ter mais de 15% de células extrusadas. Os embriões somente serão congelados até o grau 2.
Grau 3: Embrião Pobre
Seu estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, terá 50% da massa embrionária viável com irregularidades maiores na forma, tamanho, cor e densidade. Apresenta 75% de células degeneradas. Na TE a fresco, colocaremos os embriões até o Grau 3.
Grau 4: Embirão Degenerado ou Morto 
Não será usado nem congelado nem a fresco. Seu estágio de desenvolvimento não é compatível ao esperado, somente 25% da sua massa embrionária é viável, apresenta irregularidades maiores na forma, tamanho, cor e densidade, e a massa embrionária é menos de 25% de todo material presente na zona pelúcida. 
Envase embrião a fresco 
Para transferência ou criopreservação dos embriões iremos envasar o material (colocá-los dentro da palheta). A palheta em uma extremidade terá o algodão (mandril) e do outro lado o lacre. Iremos colocar dentro da palheta puxaremos uma coluna de meio (PBS ou holding que mantenha o embrião viável), uma coluna de ar, uma coluna de meio junto ao embrião, uma coluna de ar e outra de meio. Sem essas barreiras de coluna de ar, o embrião, dependendo da posição, poderia andar até o algodão e se grudar à ele, ou ainda, poderia se grudar ao lacre e vazar para o ambiente no momento da transferência. 
· Palhetas de 0,25mL 
· Identificação do lacre: touro, doadora, data, estágio e qualidade do embrião
Criopreservação
No método rápido ou convencional a palheta demora mais a congelar do que no método de vitrificação, onde o embrião será colocado em meios que ele desidrata com rapidez e seu congelamento é por essa desidratação.
Inovulação
A transferência dos embriões é por via vaginal (não-cirúrgica), as receptoras devem estar sincronizadas as doadoras, o ideal é que a receptora manifeste cio junto às doadoras ou no máximo 24h antes/depois. Devemos fazer uma avaliação prévia das receptoras, sejam com palpação retal e/ou US, para identificação do corpo lúteo. 
A inovulação é feira com um inovulador francês ou alemão, o embrião será colocado no corno do útero. Por cima dele, colocaremos a bainha azul, e ainda a camisa sanitária, um plástico que, antes de passar a cervix será rompido o plástico, evitando sugidades na região de transferência. 
Preparo do inovulador: 
· Limpeza do reto e higiene da receptora 
· Anestesia epidural 
· Deposição do embrião no corno ipsilateral ao CL, próximo à junção útero tubárica no corno esquerdo
No caso de um embrião congelado, iremos descongelá-lo por 10 segundos no ar (evitar fratura na ZP pelos cristais de gelo) ou 20 segundos em água à 25º. 
Diagnóstico de gestação
Irá nos dizer se o procedimento de TE deu certo, pode ser feito de forma precoce com o US com 25 dias, com a palpação retal de 45 a 60 dias. 
Sucesso para a TE
· Qualidade do embrião 
· Estágio do desenvolvimento 
· Treinamento técnico (avaliação da receptora e inoculação) 
· Qualidade da receptora (boa condição corporal com nutrição e sanidade adequada) 
· Período entre a colheita e a TE/congelamento