Aula_de_HPLC_15

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CROMATOGRAFIA
LIQUIDA de ALTA EFICIÊCIA
(HPLC)
Fase Móvel 
Líquida
Fase Estacionária 
Sólida
Partículas sólidas
A retenção dos solutos sobre a coluna 
cromatográfica
1 Forças de dispersão de London ou de Van der Waals
2 Interações de dipolo induzido (moléculas apolares);
3 Ligações de hidrogênio
4 Interações dielétricas
5 Interações eletrostática e coulombianas
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CG X CLAE
Quando utilizar CG ou a CLAE? 
Em CG a amostra tem que ser volátil e termicamente
estável nas condições de análises
Limitada na separação de substâncias com caráter
Iônico, foto termicamente sensíveis e que apresentam
massa molecular alta.
Métodos de detecção utilizados são mais rápidos e 
sensíveis 
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CG X CLAE
Quando utilizar CG ou a CLAE? 
Em CLAE a amostra tem que ser solúvel na 
fase móvel
Separação de espécies iônicas ou macromoléculas de interesse biológico e produtos naturais labéis (variedade de compostos de alta massa molecular eou baixa estabilidade
A maioria das separações ocorrem em temperatura 
Ambiente
É uma técnica analítica que pode ser adaptada para
a escala preparativa.
Permite posterior caracterização estrutural
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CARACTERÍTICAS DA CG E DA CLAE
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VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA CLAE
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Características das Fases Estacionárias
Propriedades Físicas dos Recheios
Sólidos rígidos: base de sílica, resiste pressões
 relativamente alta. Muito utilizado.
Semi-rígidos: partículas porosas de poliestireno 
 entrecuzadas com divinilbenzeno. 
 Pressões até 350bars. 
 CLAE por exclusão com fase
 móvel orgânica. Troca iônica.
Sólidos não rígidos: agarose ou dextrose.
 CLAE por exclusão.
 Separação de moléculas grandes
 solúveis em água (proteína)
 Não resistem as pressões altas.
 
A eficiência da separação  menor variação de diâmetro.
 (partículas esféricas são melhores do que irregulares)
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Características das Fases Estacionárias
Propriedades Físicas dos Recheios
O tamanho 
da partícula 
Controla o processo de difusão
das moléculas da amostra
 o tamanho mais lento o processo
de difusão - mais lenta a transferência
de massa entre a fase estacionária e 
fase móvel.
 da vazão da FM - as moléculas
migram com velocidade superior às
da FE resultando no alargamento
do pico
diminuição- profundidade dos poros
diminui - análises rápidas e sem perda
na eficiência
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Características das Fases Estacionárias
Características de diferentes recheios 
para CLAE
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Fase Normal
Atualmente pouco utilizado 
Recomendado para compostos polares
FM é apolar. Mistura de hexano com outro 
solvente mais polar.
FE é polar, sílica pura, ou ainda sílicas 
modificadas com aminopropil, diol ou ciano.
Compostos mais polares tendem a ficar mais 
retidos na coluna.
hidrocarbonetos saturados<olefinas<aromáticos
haletos<sulfetos<éteres<esteres aldeídos cetonas
<álcoois aminas<amidas<ácidos carboxílicos.
Mecanismo de separação: interações por ligação 
de Hidrogênio e interações do tipo dipolo-dipolo.
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Fase Reversa
Modo de separação mais utilizado 
FM (polar) é uma mistura de solvente orgânico 
com água. Mais utilizados MeOH, ACN ou THF.
FE é apolar, ou seja hidrofóbica. Sílicas 
modificadas com grupos octil, octadecil, fenil,
cianopropil e nitrila
Também pode ser utilizado polímeros orgânicos
Mecanismo de separação: compostos hidrofóbicos
tendem a ficar mais retidos.
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Fase Reversa
Alifáticos > dipolos induzidos (CCl4) > dipoplo
 permanetes > bases de Lewis fracas (eteres, aldeídos,
cetonas) > bases de lewis fortes (aminas) > ácidos 
de lwis fracos (álccois, fenóis) > ácidos de lewis
fortes (ácidos carboxílicos)
Quanto menor o diâmetro da partícula e a película
 que recobre o suporte mais rápida e Eficiente 
será a transferência das substância entre
a FM e a FE.
tr aumenta com nº de átomos de C na série 
homóloga (função da área de contato)
ramificação diminui o tr
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por Troca Iônica
Os materiais usados tem grupos (cátions ou ânions) 
Micropartículas porosas de Resinas poliméricas
Superfície e poros com grupos trocadores
(aminoácidos, peptídeoas e carbohidratos)
Capacidade elevada miliequivalente por grama
Micropartículas porosas de sílica com camadas 
pelicular
Partícula vítrea de forma esférica recoberta com
fina camada de poliestireno-divinilbenzeno. 
Capacidade reduzida (10g/g) mais muito eficaz
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por Troca Iônica
SO-3 - trocadores fortes de cátons
CO2- - trocadores fracos de cátions
NR3+ - trocadores fortes de ânions.
NH2R+ - trocadores fracos de ânions.
Para que haja separação deve-se considerar
O tipo de trocadores
-pH da fase móvel
Força Iônica da fase Móvel
-o tipo dos contra-íons na fase móvel
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por Troca Iônica
O tipo de trocadores 
Capacidade de troca - função do pH
Tipo Capacidade plena
Catiônica forte pH > 3
Catiônica fraco pH > 8
Aniônica forte pH < 9
Aniônica fraco pH < 6
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por Troca Iônica
Capacidade
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por Troca Iônica
Escolha dos contra-íons também influencia na 
separação
-íon com maior carga
-ion com menor diâmetro
-íon com melhor polarizabilidade
Na troca de cátions tR aumenta na seguinte ordem:
Ba2+, Pd2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+,
Mg2+, Mn2+, Te+, As+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, 
Li+
Na troca aniônica tR aumenta c/ a substituição do 
contra-íon na seguinte ordem:
Citrato, sulfato, oxalato, tratarato, iodeto, borato,
nitrato, fosfato, cromato, cianeto, nitrito, cloreto, 
formiato, acetato, fluoreto, hidróxido, perclorato
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por Troca Iônica
Influencia da Fase Móvel
concorrência entre íons da amostra e contra-íons
força iônica dos contra-íons
Força iônica dos íons da amostra
Basicidade da amostra
acidez do trocador
pH da FM
Consequências:
1. Aumentar a concentração de contra-íons < tR
2.  pH (na troca de cátions) < tR
3.  pH (na troca de ânions) < tR
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por por Adsorção (CLS)
Competição entre o solvente e o soluto sobre o sítio
ativo.
Adsorvente com superfície polar absorverá grupos
 polares
Moléculas polarizáveis com interação de dipolo 
induzido (benzeno) serão retidas.
Importante: apresentar um grande número de sítios
ativos. 
Ter cuidado com materiais muito polares (álcoois)
muda as propriedades da FE.
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MODOS DE SEPARAÇAO EM CLAE
Por por Partição (CLL)
FE  água em sílica
FM  clorofórmio 
Baseia-se na solubilidade da amostra na FE e naFM
Compostos solúveis na FE são retidos
Está técnica é utilizada  levemente polares PM<2000
 
Importante:
solubilização da FE na FM
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Fase estacionária a base de sílica para 
CLAE 
Vantagens
Pode ser modifica
É resistente às pressões
Tem grande área superficial
Vários formatos e tamanhos
Desvantagens
Silanóis residuais podem causar adsorção de 
Compostos básicos
Estabilidade química limitada em pH menor que
3 e em meio básico (pH>9)
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Coluna
Detector
Registador
Coluna
Detector
Registador
Coluna
Detector
Registador
Fase estacionária 
Fase móvel 
Características das colunas usadas em 
CLAE 
São constituídas de um pedaço de tubo (aço inoxidável)
com diâmetro interno uniforme com resistência as
pressões. 
O diâmetro varia: colunas analíticas – 3 a 5mm
 colunas preparativas - > 10mm
 colunas com micro diâmetro –0,05
 e 2mm.
Comprimento da coluna: 10 e 50cm. Ou até maior.
A capacidade da coluna é
determinada pelo seu 
comprimento, diâmetro e material de recheio.
As colunas são retas para diminuir a perda da
 eficiência.
Nas colunas atuais é comum obter eficiência na 
ordem de 50.000 pratos teóricos por metro de coluna.
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Coluna
Detector
Registador
Coluna
Detector
Registador
Coluna
Detector
Registador
Fase estacionária 
Fase móvel 
Colunas cromatográficas para CLAE 
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Características das Fases Móveis em CLAE 
Viscosidade
A viscosidade afeta a queda de pressão dentro da 
Coluna afetando sua eficiência de separação.
Viscosidade alta afeta no bombeamento.
São utilizados álcool, metanol e todos os compostos
que tem viscosidade inferior a um.
Compatibilidade com tipo de detector
Espectrofotométrico é o mais usual
O solvente tem quer transparente no comprimento de onda de trabalho. 
UV (190 a 350 nm) 
Etanol (205 nm) e a acetonitrila (190nm) são os preferidos
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Características das Fases Móveis em CLAE 
Compatibilidade com tipo de detector
Índice de refração (IR) → escolha da FM
Compostos alifáticos simples IR =1,3 1,4
Maior PM ou clorados IR=1,3 e 1,5
Compostos aromáticos IR=1,5 1,55
Quanto maior a diferença entre IR da amostra 
Analisada com o IR da FM, menor a quantidade de 
amostra detectada, maior a sensibilidade.
Alimentação por gravidade ou através de bomba
adequado às amostras
deve-se evitar solvente tóxicos e com alta pressão de
vapor.
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Características das Fases Móveis em CLAE 
Polaridade da Faz Móvel
Quatro tipos de interação entre molécula do solvente e
analito:
1)Dispersão: ocorre através da formação d um momento 
dipolar temporário numa molécula acarretando numa 
atração eletrostática dessas moléculas.
2)Interação dielétrica: Interação dos íons da amostra 
com os líquidos de alta constante dielétrica.
3)Dipolos: moléculas de solventes e analitos que tem
dipolos permanentes. Ocorrem geralmente entre
 grupos funcionais das próprias moléculas.
4)Pontes de hidrogênio: O par clorofórmio/trimetilamina
é um bom exemplo de doador de prótons (clorofórmio) 
e um aceptor (trimetilamina)
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Tipos de Detectores 
UV ou UV/Visível
Índice de refração
Condutividade elétrica
Fluorescência
Eletroquímico
Amperométrico
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Não existe um detector ideal único ou universal
Seletivos:
Respondem a uma faixa limitada de compostos
Sensíveis a alguma propriedade própria do soluto
UV, fluorescência e eletroquímica são os mais
 sensíveis e menos influenciados pela troca de
 solventes.
Gerais:
Respondem a uma ampla faixa de compostos
Medem uma variação físico-química 
(índice de refração e condutividade elétrica), 
da fase móvel contendo o analito em comparação 
com a mesma fase móvel pura.
Classificação dos Detectores 
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Podem ser destrutivos e não-destrutivos
Sensibilidade:
É a razão entre a resposta do detector e a quantidade 
da amostra
Resposta para uma determinada quantidade de amostra.
Detectabilidade:
Diminuição da concentração da amostra, a resposta 
do detector apresenta maior ruído
Boa detectabilidade pode ser usado em concentrações
 baixas.
Linearidade:
Um detector apresenta resposta linear se a 
diferença na resposta para duas amostras d um 
determinado composto é proporcional à diferença na 
quantidade das duas amostras
Caractarização dos Detectores 
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Repetibilidade:
Necessidade absoluta de que a resposta do detector 
seja reprodutível durante a análise. Calibração
Principais características dos detectores
Apresentar ruído baixo, pois quanto maior o ruído 
pior será o valor do limite de detecção.
Velocidade de resposta alta.
Precisão e exatidão
Caractarização dos Detectores 
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SISTEMA CROMATOGRAFICO EM CLAE