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Diferentes classes de RNA; Os principais componentes necessários para a transcrição. O processo de transcrição: procariotos x eucariotos O que são íntrons? 1. RNA - ASPECTOS GERAIS O RNA é um polímero composto por nucleotídeos unidos por ligação fosfodiéster, possui a ribose como açúcar (grupo hidroxila livre no átomo carbono 2’ do açúcar ribose). Ele é rapidamente degradado em condições alcalinas. Outra Particularidade dessa molécula é que a timina, uma das duas pirimidinas encontradas no DNA, é substituída pela uracila. Apesar da estrutura de fita simples, pode formar estruturas secundárias (grampo-alça). 1.1.A MOLÉCULA DE RNA APRESENTA MUITAS FUNÇÕES DIFERENTES: Classe de RNA Tipo de célula Localização da função nas células eucarióticas* Função RNA ribossômico (rRNA) Bacteriano e eucariótico Citoplasma Componentes estruturais e funcionais do ribossomo RNA mensageiro (mRNA) Bacteriano e eucariótico Núcleo e citoplasma Carreia o código genético para proteínas RNA transportador (tRNA) Bacteriano e eucariótico Citoplasma Ajuda a incorporar os aminoácidos na cadeia de polipeptídios RNA nuclear pequeno (snRNA) Eucariótico Núcleo Processamento do pré- mRNA (imediatos a transcrição nas células) RNA nucleolar pequeno (snoRNA) Eucariótico Núcleo Processamento e montagem do rRNA MicroRNA (miRNA) Eucariótico Núcleo e citoplasma Inibe a tradução do mRNA RNA de interferência pequeno (siRNA) Eucariótico Núcleo e citoplasma Aciona a degradação de outras moléculas de RNA RNA de interação com Piwi (piRNA) Eucariótico Núcleo e citoplasma Suprime a transcrição dos elementos transponíveis nas células reprodutoras CRISPR RNA (crRNA) Procariótico – Auxilia na destruição de DNA estranho 2. APARATO UTILIZADO PARA A SÍNTESE DE RNA: • É a RNA polimerase quem realiza todas as funções necessárias para a síntese, ela possui várias proteínas acessórias que executam funções diferentes. • A RNA polimerase procariótica: possuem 4 subunidades (duas alfas, uma beta e uma beta linha) responsáveis pela síntese e outros processos de transcrição, também possui uma subunidade gama que estabiliza a enzima e uma subunidade sigma que controla a ligação do cerne enzimático ao promotor. A subunidade sigma é muito importante, pois sem ela a holoenzima não consegue se ligar ao promotor corretamente. • A RNA polimerase eucariótica: diferentes dos procariotos, os eucariotos possuem diversos tipos de RNA polimerases, cada uma é responsável por transcrever um tipo de RNA. Todas são multiméricas (várias subunidades proteicas), algumas subunidades são comuns à todas, já outras não. Tipo Encontrada em Transcreve RNA polimerase I Todos os eucariotos rRNAs grandes RNA polimerase II Todos os eucariotos Pré-mRNA, alguns snRNAs, snoRNAs, alguns miRNAs RNA polimerase III Todos os eucariotos tRNAs, rRNAs pequenos, alguns snRNAs, alguns miRNAs 3. TRANSCRIÇÃO: • DNA usado como molde; • Apenas pequenas partes da molécula são utilizadas (Genes); • Transcrição ocorre em apenas uma das fitas da molécula de DNA (fita molde). ps.: Na maioria dos organismos, cada gene é transcrito a partir de uma fita simples de DNA, mas diferentes genes podem ser transcritos a partir de cada fita de DNA. • O RNA é sintetizado na direção 5’ > 3’, logo, a fita utilizada como molde possui polaridade oposta (3’ > 5’). Além disso, a direção de síntese do RNA é no mesmo sentido da fita NÃO molde. • Unidade de transcrição: um segmento de DNA que codifica uma molécula de RNA e as sequências necessárias para sua transcrição. Esse segmento é divido em três regiões. Promotor, uma sequência codificadora de RNA e um terminador. - Promotor (-upstream) = indica onde o aparato de transcrição deve se ligar, fica próximo ao sítio inicial, no entanto, não é transcrito, eles têm sequências consenso curtas e localizadas mais ou menos no mesmo local (-35, -10), elas são importantes para o início da transcrição e também é onde as holoenzimas (RNA polimerase) se ligam, fracamente na sequência -10 e fortemente na -35, o que possibilita a separação da dupla hélice. É importante ressaltar onde, de fato, começa o desenrolamento do DNA, pois é na sequência localizada a -10 que essa separação tem início e se entende por 14 nucleotídios, + downstream); - sequencia codificadora = como o próprio nome diz, é a sequência que será copiada. Ela inicia-se com o sítio de início da transcrição (+1); é onde a RNA polimerase pareia o primeiro trifosfato de ribonucleosídio complementar ao molde de DNA e depois acrescenta mais nucleotídeos, complementares ao molde de DNA, nas extremidades 3’ da fita de RNA que está sendo formada. - Terminador (+downstream) = indica onde a transcrição deve terminar. São partes da sequência codificadora de RNA. A transcrição só termina quando ele é copiado em RNA. • A chegada de trifosfato de nucleosídios (substrato) e a formação da ligação fosfodiéster é semelhante a que ocorre na replicação de DNA, no entanto, não necessita de primer. 3.1.O PROCESSO GERAL DE TRANSCRIÇÃO É DIVIDIDO EM TRÊS ETAPAS: INICIAÇÃO, ALONGAMENTO E TERMINO - A iniciação: quando o aparato de transcrição se encaixa no promotor e inicia a síntese. Ou seja, são todas as etapas necessárias para o início da síntese (identificação do promotor, formação da bolha de transcrição, primeiras ligações entre trifosfato de nucleotídeos- rNTPs e saída do aparato do promotor (a saída ocorre após a subunidade sigma se solta da holoenzima). - Alongamento: mudança conformacional da RNA polimerase, após a saída da subunidade sigma , o que a torna incapaz de se ligar as sequências consenso, logo, a polimerase abre o DNA e sai da região de promotor – formando a bolha de transcrição, que possui, em geral 18 pares de base desenrolados - e adiciona novos nucleotídios, um por vez, à extremidade 3’da fita de RNA crescente. Conforme a fita de RNA vai sendo sintetizada (downstream) a borda livre da bolha vai sendo aberta e a outra, que já foi utilizada (upstream), vai sendo enrolada novamente. (É a RNA polimerase -uma de suas subunidades- que também faz a revisão dos nucleotídeos). Desse modo, é provável que as enzimas topoisomerases aliviem a tensão associada ao desenrolamento e enrolamento do DNA na transcrição, como fazem na replicação do DNA. Além disso, também é importante ressaltar as pausas transcricionais que ocorrem durante a síntese, elas são basicamente um recuo da RNA polimerase que solta o último grupo 3’ OH livre, esse recuo pode ser causado por várias características tanto da molécula de DNA quanto da de RNA. - Término: identificação da extremidade da unidade de transcrição e a separação da molécula de RNA do molde de DNA. Quando o terminador é localizado na fita de RNA e completamente transcrito, a síntese termina. As células bacterianas apresentam dois tipos principais de terminadores: Os terminadores dependentes de Rho- podem levar ao término da transcrição apenas quando houver uma proteína auxiliar chamada de fator Rho. É composto por um sequência de DNA que faz com que a RNA polimerase pare, essa sequência de DNA codifica um segmento de RNA upstream do terminador, normalmente rico em nucleotídios citosina e sem estruturas secundárias, ela é chamada de sítio de utilização de Rho (rut) e serve como sítio de ligação para a proteína Rho. Uma vez que Rho esteja ligado ao RNA, ele se move para a extremidade 3’, seguindo a RNA polimerase. Quando a RNA polimerase encontra o terminador, ela faz uma pausa, tornando possível que Rho seja alcançado. A proteína Rho tem atividade helicase, usada para abrir o híbrido RNA-DNA na bolha de transcrição, encerrando a transcrição. Os terminadores independentes de Rho- (também conhecidos como terminadores intrínsecos) podem levar ao términoda transcrição na ausência de Rho, apresentam duas características em comum. Primeiro, eles contêm repetições invertidas – sequências de nucleotídios em uma fita que estão invertidas e são complementares. Quando as repetições invertidas são transcritas para o RNA, forma-se uma estrutura secundária em grampo (quando as repetições se pareiam). Segundo, nos terminadores independentes de Rho, uma fita de 7 a 9 nucleotídios de adenina segue a segunda repetição invertida no DNA molde. Sua transcrição produz uma fita de nucleotídios de uracila após o grampo no RNA transcrito. 3.2. PECULIARIDADES DA TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS: • A estrutura da cromatina é modificada (remodelagem da cromatina) antes da transcrição, de modo que o DNA esteja em uma configuração mais aberta e mais acessível para o maquinário de transcrição; vários tipos de proteínas têm papéis na modificação da cromatina. As acetiltransferases Curiosidades :mRNA policistrônico. Nas bactérias, um grupo de genes é transcrito em uma molécula de RNA, que é chamada de RNA policistrônico. Assim, o RNA policistrônico é produzido quando um único terminador se encontra na extremidade de um grupo de vários genes que são transcritos juntos, em vez de cada gene ter seu próprio terminador. O mRNA policistrônico surge em alguns eucariotos, como Caenorhabditis elegans, mas é incomum. adicionam grupos acetila a aminoácidos nas extremidades das proteínas histonas, o que desestabiliza a estrutura do nucleossomo e torna o DNA mais acessível. Outros tipos de modificação de histona também podem afetar o empacotamento da cromatina, como por exemplo a RNA polimerase II, que é capaz de transpor os nucleossomos com a ajuda de um complexo proteico denominado FACT ( em português: facilita a transcrição da cromatina), que remove os dímeros de histona H2A/H2B dos nucleossomos, deixando "hexassomos" de histona. Depois que a polimerase II transpõe o nucleossomo, FACT e outras proteínas acessórias ajudam a depositar novamente os dímeros de histona, restaurando a estrutura do nucleossomo. • Muitos dos transcritos eucarióticos caracterizados contêm a região codificadora de um único gene (são monogênicos) • Os transcritos de RNA resultantes passam por três modificações importantes. Caps de 7- metilguanosina são acrescentados às extremidades 5' dos transcritos primários, por uma ligação de fosfato 5'-5'/ Caudas poli(A) são acrescentadas às extremidades 3'dos transcritos, gerados por clivagem e não por término da extensão da cadeia/Quando presentes, as sequências de íntrons são cortados dos transcritos. As sequências nucleotídicas de alguns transcritos de RNA são modificadas após a transcrição por edição do RNA (descrito resumidamente mais a frente). • Cada RNA polimerase identifica um tipo diferente de promotor, pois sua natureza de identificação do promotor e do início são diferentes. a) Iniciação: Nas células eucarióticas, a identificação do promotor é feita pelas proteínas acessórias (fatores de transcrição gerais) que se ligam ao promotor e então recrutam uma RNA polimerase específica (I, II ou III). Formando, então, o aparato basal de transcrição. Os exemplos de promotor logo abaixo, são referentes as polimerases II: - Ele é formado por um cerne :o cerne do promotor está upstream do gene, é onde o aparato basal se liga, o cerne possui uma ou mais sequências consenso (TATA box, CAAT, GC). Essas sequências são reconhecidas pelos fatores de transcrição (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH, no qual TFII representa o fator de transcrição para RNA polimerase II, e a letra final indica o fator individual, são semelhantes a função sigma dos procariotos) que se ligam a elas e servem como uma plataforma para a montagem do aparato basal de transcrição. - Possui uma região chamada de promotor regulador: O promotor regulador está localizado imediatamente upstream do cerne do promotor. Possui varias sequencias consenso diferentes. As proteínas ativadoras de transcrição se ligam a essas sequências e fazem contato direto ou indireto com o aparato basal de transcrição, e afetam a taxa na qual a transcrição é iniciada. - Os promotores de genes transcritos pelas polimerases I e III são muito diferentes dos usados pela polimerase II, embora às vezes eles contenham alguns elementos reguladores iguais. - A transcrição nos eucariotos é de fato iniciada pela montagem do maquinário de transcrição no promotor, no entanto, a montagem do maquinário de transcrição só começa quando as proteínas reguladoras se ligam ao DNA próximo do promotor e modificam a estrutura da cromatina para que ocorra a transcrição. Essas e outras proteínas regulatórias, então, recrutam o aparato basal de transcrição para o cerne do promotor. O aparato basal é formado por: fatores gerais de transcrição, RNA polimerase e um complexo proteico conhecido como mediador. Eles posicionam a polimerase sobre o sítio de início da transcrição, o que causa mudança conformacional na fita de DNA, esse molde que é formado será posicionado dentro do sítio ativo da RNA polimerase, criando uma estrutura chamada de complexo aberto. Após o complexo aberto ter sido criado, a síntese de RNA começa à medida que os grupos fosfato são separados dos trifosfatos de nucleosídio e os nucleotídios são unidos para formar uma molécula de RNA. b)Alongamento: Após cerca de 30 pares de base de RNA serem sintetizados, a RNA polimerase deixa o promotor e entra no estágio de alongamento da transcrição - muitos dos fatores de transcrição são deixados para trás no promotor e podem servir para reiniciar rapidamente a transcrição com outra enzima RNA polimerase- e é nessa etapa que as extremidades 5' dos pré-mRNA eucarióticos são modificadas pelo acréscimo de caps de 7-metilguanosina (7-MG) (Os caps de 7-MG são reconhecidos por fatores proteicos que participam da iniciação da tradução e também ajudam a proteger as cadeias de RNA em crescimento contra a degradação por nucleases. c) Termino: As três RNA polimerases eucarióticas usam diferentes mecanismos para o término da transcrição. A RNA polimerase I requer o fator de término semelhante ao fator Rho usado no término de alguns genes bacterianos, no entanto, ele liga-se a uma sequência de DNA downstream do sítio de término. Já a RNA polimerase III termina a transcrição após transcrever uma sequência terminadora que produz uma fita de nucleotídeos uracila na molécula de RNA, como a fita produzida pelos terminadores independentes de Rho das bactérias, entretanto ela não necessita formar uma estrutura em grampo. O término da transcrição pela RNA polimerase II não ocorre em sequências específicas. Ao contrário, ela continua a sintetizar RNA por centenas ou até milhares de nucleotídios depois da sequência de codificação necessária para produzir mRNA. Por isso, ocorre uma clivagem que corta somente o pré-mRNA e o “restante” é degradado por um exonuclease chamada Rat1, esse mecanismo só termina quando ela alcança o maquinário de transcrição. Após a clivagem, a enzima polimerase poli (A) acrescenta caudas poli(A), com aproximadamente 200 nucleotídios. 4. EDIÇÃO: Os processos de edição de RNA alteram o conteúdo de informações dos transcritos gênicos de duas maneiras: modificação das estruturas de bases individuais e inserção ou deleção de resíduos de monofosfato de uridina. 1- A produção de um códon UAA na região codificadora de um mRNA causa a interrupção prematura do polipeptídio durante a tradução, com síntese de um produto gênico incompleto. A conversão C ~ U é catalisada por uma proteína de ligação ao RNA sequência-específica com atividade de retirada de grupos amino dos resíduos de citosina. 2- Um segundo tipo, mais complexo, de edição de RNA ocorre, nesse caso, os resíduos de monofosfato de uridina são inseridos em (às vezes deletados de) transcritos gênicos, causando importantes modificações nos polipeptídiosespecificados pelas moléculas de mRNA. Essa edição de RNA é mediada por RNA-guias transcritos de genes mitocondriais distintos. Os RNA-guias contêm sequências parcialmente complementares aos prémRNA a serem editados. O pareamento entre RNA-guia e pré-mRNA produz lacunas com resíduos de A sem par no RNA-guia. Os RNA-guias servem de molde para edição, pois há inserção de U nas lacunas das moléculas de pré-mRNA diante de A nos RNA-guias. 5. O QUE SÃO ÍNTRONS? São sequência não codificadora entre as sequências codificadoras. Alguns genes possuem inúmeros íntrons, e alguns possuem poucos, mas a maioria possui íntrons. Na verdade, os genes interrompidos são muito mais comuns que os genes ininterruptos nos animais e vegetais superiores. Em alguns casos os genes possuem poucos íntros, no entanto, eles ocupam uma grande área de núcleotídios. É importante ressaltar que mesmo que seja muito mais comum que haja íntrons na sequência de genes de algumas espécies não possuem eles. O significado biológico dos íntrons ainda está em discussão 5.1.COMO OS ÍNTRONS SÃO REMOVIDOS DO PRÉ-mRNA? • Por vários mecanismos diferentes, mas o que importarão no momento serão três tipos de excisão de íntrons dos transcritos de RNA. 1.Os íntrons de precursores do RNA transportador são excisados por clivagem endonucleotídica precisa e reações de ligação catalisadas por atividades de endonuclease e ligase de recomposição especial. A excisão de íntrons ocorre em dois estágios. No estágio I, uma endonuclease de recomposição ligada à membrana nuclear faz dois cortes precisos nas extremidades do íntron. Depois,no estágio II, a ligase de recomposição une as duas metades do tRNA e produz a forma madura da molécula de tRNA. 2.Os íntrons de alguns precursores de rRNA são retirados por mecanismo autocalítico em uma reação específica mediada pela própria molécula de RNA. (Não há participação de atividade enzimática da proteína.) o mecanismo de autorrecomposição é semelhante ao mecanismo de recomposição observado nos precursores de mRNA nuclear, porém sem participação do espliceossomo. O mecanismo de recomposição conta com a participação de uma série de transferências de ligação fosfoéster, sem perda nem ganho de ligações no processo. A reação requer um nucleosídio ou nucleotídeo guanina com um grupo 3'-0H livre (GTP, GDP, GMP ou guanosina) como cofator mais um cátion monovalente e um cátion divalente. A G-3' -OH é indispensável; não pode ser substituída por nenhuma outra base no cofator do nucleosídio ou nucleotídio. O íntron é excisado por duas transferências de ligação fosfoéster e, depois, o íntron excisado pode ser circularizado por meio de outra transferência de ligação fosfoéster 3. Os íntrons de transcritos de pré-mRNA nucleares (hnRNA) são excisados em reações em duas etapas efetuadas por partículas de ribonucleoproteína complexas chamadas espliceossomos. • As sequências totalmente conservadas de diferentes íntrons são as sequências dinucleotídicas nas extremidades dos íntrons; • As junções éxon-íntron são diferentes nos genes para tRNA e genes estruturais nas mitocôndrias e cloroplastos, que usam diferentes mecanismos de recomposição do RNA. Referências: 1- Pierce, Benjamin A. Genética: um enfoque conceitual / Benjamin A. Pierce; tradução Beatriz Araujo do Rosário. -5. ed. - Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 3- Snustad, D. Peter, 1940- Fundamentos de genética I D. Peter Snustad, Michael J. Simmons; tradução Cláudia Lúcia Caetano de Araújo. - 6. ed . -Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013 . “Foco sempre!” esse é um resumo das ideias principais dos dois livros citados acima, caso tenha alguma dúvida é só dar uma olhadinha no livro completo. Aqui vai um link de um vídeo que pode ajudar a entender/integralizar o funcionamento dos mecanismos de transcrição: https://youtu.be/6nxRxoGME_I . https://youtu.be/6nxRxoGME_I
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