Aula 4 parte 2 pdf

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ELISA
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS VIROSES
Immunoblotting 
Western Blotting 
(WB)
Blotting significa 
transferência de 
DNA.
Separação das 
proteínas virais 
usando o método 
de eletroforese 
em gel de 
poliacrilamida.
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA - ROTAVÍRUS
Detecção do Ácido Nucléico Viral
Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)
Reação de Hibridização in situ
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
 Para o estudo de vírus que não podem ser isolados em cultura de
células, como os papilomavírus e alguns agentes associados a
gastrenterites,
 Para vírus com alta diversidade antigênica, como os enterovírus, o
que dificulta a utilização de técnicas sorológicas de detecção de
antígeno,
 A análise do genoma viral diretamente da amostra clínica pode ser
vantajosa principalmente para aqueles vírus com genoma RNA, que
podem sofrem mutações através de sucessivas passagens in vitro.
QUANDO A DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL É 
PARTICULAMENTE IMPORTANTE:
PRINCÍPIO
Todo ser vivo tem seqüências de ácido nucléico que são
específicas e podem ser detectadas por uma reação de
hibridização ou de amplificação
Técnicas de Biologia Molecular:
DNA
RNA
As fitas da molécula de 
DNA (dupla hélice) podem 
ser separadas. Esse 
processo é denominado
desnaturação.
A renaturação ocorre 
quando se volta às 
condições físico químicas 
iniciais.
Uso de sondas marcadas para detecção de genoma 
em tecido com alterações patológicas (material de 
arquivo)
SONDA: fragmento de DNA marcado com substância 
reveladora (radioisótopo, enzima...)
 Triagem X Tipagem
 Sensibilidade: 100 cópias DNA/célula
 Relevância clínica
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
Sonda
REAÇÃO DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
Uso de sondas marcadas para detecção de genoma em membrana de 
nitrocelulose.
Amostra clínica: soro, fezes, tecido
 Triagem
 Sensibilidade: 10-50 cópias DNA/célula
 Pode ocorrer falso-positivos
Dot blot
Dot Blot
Sonda marcada com P32
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A
B
C
D
E
F
G
H
Sonda marcada com biotina
DOT BLOT
REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE : 
PCR
• Método para produzir cópias de uma segmento de DNA específico
• Polimerização de DNA em Cadeia
• Polimerização é feita por uma DNA polimerase termoestável
• São utilizados dois “primers”, o que delimitam o segmento amplificado e 
determinam o crescimento exponencial do número de moléculas de DNA
• Sensibilidade : 10 cópias de genoma
• Primers genéricos x primers específicos
PCR AMPLIFICA UMA SEQÜÊNCIA ALVO
ALTERNÂNCIA DE TEMPERATURAS A CADA CICLO:
DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO
POLIMERIZAÇÃO
Replicação “in vitro” do DNASeqüência AlvoDNADNA 
SupercoiledCromossomo
Extensão
Seqüência alvo 
DNAPolymerase
5’
5’
Anelamento dos 
primers 55-64°C
Denaturaçãopelo calor 
95°C 
REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE : PCR
Qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR
A localização da seqüência alvo é feita pelos “primers”. 
Oligonucleotídeos com 20 -24 bases são usualmente seletivos o suficiente para 
localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o 
genoma humano.
O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo se faz pelo estabelecimento 
de pontes de hidrogênio, segundo o pareamento convencional descrito por 
Watsone Crick:
A =T
C =G
VISUALIZAÇÃO DO PRODUTO DA PCR
Cuba de eletroforese
Produtos da reação de PCR em um gel de agarose
Herpesvírus Nested PCR
150pb
150pb
NESTED PCR PODE SER UMA ALTERNATIVA PARA MELHORAR A 
ESPECIFICIDADE E A SENSIBILIDADE DA PCR
 427bp
MW 1 2 3 4 MW 5 6 7 8
Primers externos Primers internos
681 pb 
PADRÃO DE RESTRIÇÃO:
Sítios de reconhecimento para ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO são curtas sequências de 
nucletídeos reconhecidas e clivadas por 
várias endonucleases
EIA - DNA
ENSAIO DE CAPTURA DE HÍBRIDO
 Detecção e tipagem de HPV
SEQUENCIAMENTO DE DNA
Citosina
Dideoxicitosina
 Detecção de IgM específica
 Conversão sorológica: 
 soro de fase aguda
 soro de fase de convalescência
Diagnóstico de infecção recente:
MÉTODOS INDIRETOS: DETECÇÃO DE AC NO SORO
 Reações Imunológicas
Imunofluorescência (IF)
Ensaio Imunoenzimático (EIE)
Radioimunoensaio (RIE)
Western Blot
MÉTODOS INDIRETOS: DETECÇÃO DE 
AC NO SORO