Aula6_Genes_e_Genomas

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3/4/2011
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Explorando Genes e Genomas
Tecnologia do DNA recombinante
• Surgida na década de 1970.
• Permite que se possa, através de enzimas, 
cortar, juntar e replicar o DNA; e fazer 
transcrição reversa do DNA.
• Baseada na enzimologia de ácidos nucléicos.
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Tipos de técnicas
• Análise com enzimas de restrição
– Permitem clivar o DNA de forma específica
• Técnicas de transferência
– Podem separar e caracterizar o DNA (Southern
blot) e o RNA (Northern blot)
• Seqüenciamento de DNA
– Permite saber a exata seqüência de nucleotídeos 
de uma molécula de DNA
• Síntese de ácidos nucléicos
• Reação em cadeia da polimerase (PCR)
– Permite “amplificar” uma cadeia de DNA
Enzimas de restrição
• Enzimas ou endonucleases de restrição são 
capazes de reconhecer seqüências específicas 
de bases na dupla hélice de DNA e cortá-las 
em locais específicos.
• Descobertas na natureza (com o intuito de 
cortar moléculas exógenas de DNA), são 
usadas em laboratório desde o final dos anos 
60.
• Costumam agir em seqüências palindrômicas:
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Enzimas de restrição
• Seus nomes geralmente refletem o 
organismo e a linhagem onde foram 
descobertas, além de um número em 
algarismos romanos para o caso de 
mais de uma endonuclease no mesmo 
organismo: EcoRI (E. coli), Hin (H. 
influenzae), etc.
• Como cada uma pode ter sítios de 
clivagem diferentes, é possível cortar 
DNA de múltiplas formas combinando 
enzimas diferentes.
Separação de fragmentos de 
restrição
• Os fragmentos obtidos pela 
ação de enzimas de restrição 
podem ser separados por gel de 
eletroforese.
• Esses géis, geralmente de 
poliacrilamida (até 1000 pares 
de bases) e agarose (até 20kb) 
são posteriormente corados 
para visualização das bandas.
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Southern blot
• Aplicando uma sonda de DNA marcada com 
fósforo 32P, a hibridização pode ser revelada 
por radiografia, identificando um fragmento 
específico dentre milhares de outros.
Seqüenciamento de DNA
• O DNA pode ser seqüenciado através da 
produção de fragmentos cujo tamanho 
depende da última base na seqüência.
• Eles podem ser gerados pelo término 
controlado da replicação (método didesoxi de 
Sanger), feito em quatro misturas de reação 
ao mesmo tempo.
• Os fragmentos são submetidos a eletroforese, 
permitindo a identificação de cada base.
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Seqüenciamento de DNA
Síntese de DNA
• Muitas técnicas (como o próprio 
seqüenciamento) necessitam de pequenas 
seqüências de DNA.
• O DNA pode ser sintetizado automaticamente 
em fase sólida.
• Hoje é possível encomendar comercialmente 
desde pequenas seqüencias de DNA 
destinadas a serem utilizadas como 
iniciadoras, até genes inteiros.
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PCR – A reação em cadeia da polimerase
• Método criado por Kary Mullis em 1984 para 
amplificar seqüências de DNA. Necessita de:
– DNA alvo
– Um par de primers para delimitar a região a ser 
amplificada
– Todos os quatro trifosfatos de 
desoxirribonucleosídeos (dNTPs)
– Uma DNA polimerase termoestável.
PCR – A reação em cadeia da polimerase
• As etapas do PCR são
– Separação de filamentos, através do aquecimento 
da solução a 95oC por 15s.
– Hibridação dos primers
– Síntese de DNA, pelo aumento da solução para a 
temperatura ótima da polimerase (em geral usa-se 
72oC, temperatura ótima para a Taq polimerase).
• Amplificações de 1 milhão de vezes ocorre em 
apenas 20 ciclos, e de um bilhão em apenas 
30 ciclos.
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PCR – A reação em cadeia da polimerase
Usos do PCR
• Detecção de vírus e bactérias (e.g. HIV em 
pacientes sem resposta imune)
• Detecção precoce de cânceres (identificação 
de genes controladores de crescimento).
• Monitoramento de quimoterapia.
• Uso médico-legal
– Identificação de indivíduos
– Casos de paternidade
• Análise de DNA antigo.
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DNA Ligase
• Ligases são enzimas capazes de unir porções 
de DNA.
• Usadas em conjunto com as endonucleases e 
o PCR, permitem ao biólogo molecular 
recortar, copiar e colar trechos de DNA como 
desejar.
DNA recombinante - plasmídeos
• Pode-se inserir genes em porções de DNA 
circular (plasmídeos), que por sua vez podem 
ser inseridos em bactérias para a produção de 
uma proteína específica.
• Usando endonucleases 
específicas, pode-se cortar o 
plasmídeo em pontos 
específicos para inserir 
fragmentos de DNA 
posteriormente pela ação de ligases.
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DNA recombinante – fagos λ
• O fago λ é um vírus bacteriófago capaz de 
inserir DNA em bactérias com grande 
eficiência (mais que pelo método da inserção 
de plasmídeo).
• Assim, ele também pode ser usado como 
ferramenta em biologia molecular.
BACs e YACs
• Outra alternativa, útil para trechos muito 
maiores de DNA, é a utilização de 
cromossomos artificiais.
• Eles possuem telômeros, um centrômero, uma 
seqüência de replicação e podem ser inseridos 
em bactérias (BACs – aceitam insertos de até 
300kb) e leveduras (YACs – até 1000 kb).
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Mutagênese sítio-dirigida
• Proteínas modificadas podem ser geradas por 
mudanças no DNA:
– Deleções, através do corte de um plasmídeo em 
dois pontos por uma endonuclease, seguida de 
uma ligação subseqüente.
– Substituições, através da mudança de uma base 
induzida por nucleotídeo mal-pareado.
– Inserções, cortando o plasmídeo em dois pontos, 
inserindo um cassete com pontas que pareiam nas 
regiões cortadas seguida de ligação.
Proteínas quiméricas
• Proteínas diferentes podem ser fundidas em 
uma só (quimera), de modo a efetuarem duas 
funções distintas.
• Outra utilidade das quimeras é facilitar a sua 
produção heteróloga, promovendo a 
solubilidade ou a ligação por afinidade a uma 
coluna de purificação.
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cDNA
• Para produzir proteínas de forma recombinante, nem 
sempre se utiliza o gene tal qual ele existe no 
organismo original.
• Isso se deve porque os sistemas de expressão utilizados 
podem ser incapazes de lidar com íntrons e éxons, caso 
de E. coli.
• Assim para produzir uma proteína em E. coli, insere-se 
não a seqüência original do gene, mas o cDNA da 
proteína de interesse, isto é, uma seqüência de DNA 
correspondente apenas à proteína final, gerada por 
tradução inversa.
• O nome vem de DNA complementar, e pode ser 
sintetizado a partir de um mRNA maduro através da 
transcriptase reversa.
Genomas
• As técnicas de biologia molecular foram 
capazes de desvendar a seqüência de 
genomas inteiros de diversos organismos, de 
vírus a eucariotos, incluindo o humano.
• A estratégia utilizada consiste em gerar muitos 
fragmentos e sequencia-los, “montando” o 
genoma posteriormente usando métodos 
computacionais.
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Genomas
• 1977: Bacteriófago PhiX-174 (5386bp, 11 genes)
• 1995: H. influenza (causador da meningite, 1.8Mbp, 
1813 genes, 1737 proteínas).
• 1996: S. cerevisiae (levedura, 12Mbp, 16 
cromossomos, 6000 genes).
• 1997: E. coli (4Mbp, 4377 genes, 4290 proteínas)
• 1998: C. elegans (97Mbp, seis cromossomos, 20.000 
genes)
• 2003: H. sapiens (3Tbp, 30.000 genes)
Expressão gênica - microarranjos
• A técnica automatizada do 
microarranjo é capaz de analisar o 
padrão de expressão gênica de um 
dado tecido, comparando-o com 
uma biblioteca de genes.
• A biblioteca é inserida num chip, e 
usando DNA marcado com 
fluorescência é possível identificar 
hibridização e, assim, quais genes 
estão sendo expressos.
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Transgênicos e nocautes
• A inserção de novos genes em organismos que 
originalmente não o continham dá origem aos 
transgênicos.
• Técnicas para evitar que um gene seja 
expresso em um organismo dá origem aos 
nocautes, capazes de dar indícios à função de 
um gene.
– O RNA de interferência, técnica que usa pequenos 
fragmentos de RNA que interagem com o mRNA
relativo ao gene que se quer silenciar, é capaz de 
evitar a sua transcrição.
Terapia gênica
• Uma técnica promissorapara a medicina é a 
terapia gênica, que consiste na indução da 
expressão de genes específicos (já presentes 
ou especificamente induzidos).
• Tal área ainda se encontra em estágio inicial –
porém, já há casos relatados de sucesso para 
algumas enfermidades.
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Planejamento de fármacos – uma 
abordagem molecular
• Doença causada por um parasita
– Determinação de seu genoma
– Identificação de genes potencialmente 
importantes
– Nocaute de genes, identificação daqueles sem os 
quais o parasita é inviável
– Clonagem do gene
– Expressão e caracterização da proteína
• Estudo in vitro: triagem de compostos químicos
– Determinação da estrutura da proteína
• Estudo in silico: triagem virtual de compostos.
Planejamento de fármacos – uma 
abordagem molecular
• Doença relacionada a um gene humano
– Microarranjo comparativo entre pessoas 
saudáveis e doentes.
– Identificação de genes potencialmente 
importantes
– Expressão é indesejável � planejamento de um 
inibidor
– Expressão é desejável � terapia gênica