Biotecnologia e Engenharia Genética

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Biotecnologia
Engenharia Genética
Terapia Genética
Alimentos Transgénicos
Microrganismos Transgénicos
Plantas Transgénicas
Animais Transgénicos
Biotecnologia e Ética
Biotecnologia: Conceitos
• Biotecnologia é tecnologia baseada na biologia, especialmente
quando usada na agricultura, ciência dos alimentos e medicina.
• Biotecnologia: conjunto de actividades baseadas em
conhecimentos multidisciplinares que utiliza agentes biológicos
(organismos, células, moléculas) para o desenvolvimento de
produtos úteis ou para a resolução de problemas.
• Biotecnologia é o uso de organismos vivos ou parte deles, para a
produção de bens e serviços. Nesta definição se enquadram um
conjunto de actividades que o homem vem desenvolvendo há
milhares de anos, como a produção de alimentos fermentados
(pão, vinho, iogurte, cerveja, e outros). Por outro lado a
biotecnologia moderna se considera aquela que faz uso da
informação genética, incorporando técnicas de DNA recombinante.
http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA_recombinante
A biotecnologia abrange os seguintes processos:
• obter ou modificar produtos para uso em saúde humana
ou animal;
• melhorar plantas e animais ou desenvolver
microrganismos para usos específicos;
• aplicar as capacidades de microrganismos, células
cultivadas de animais ou vegetais ou parte deles na
indústria, na saúde e nos processos relativos ao meio
ambiente e ao desenvolvimento sustentável;
• modificar e desenvolver novos processos industriais.
Engenharia genética
• Na engenharia genética, um gene ou, mais comumente, um
conjunto de alguns genes, é retirado do genoma de um
organismo e introduzido no ADN de outro organismo.
• Tecnicamente a engenharia genética é a inserção artificial
de uma sequência estranha de código genético no meio de
uma sequência ordenada do código genético de um
receptor, que levou milhões de anos para evoluir. Além
disso, construções genéticas artificiais poderosas são
adicionadas tendo potencialmente efeitos problemáticos.
Isto é uma profunda intervenção com consequências
imprevisíveis.
• Engenharia genética e modificação genética são
termos para o processo de manipulação dos
genes num organismo, geralmente fora do
processo normal reprodutivo deste.
• O objectivo é de introduzir novas características
num ser vivo para aumentar a sua utilidade,
introduzindo uma nova característica, ou
produzindo uma nova proteína ou enzima.
• Exemplos: produção de insulina humana através do uso
modificado de bactérias e da produção de novos tipos
de ratos como o OncoMouse (rato cancro) para
pesquisa, através de re-estruturamento genético.
• Já que uma proteína é codificada por um segmento
específico de ADN chamado gene, versões futuras
podem ser modificadas mudando o ADN de um gene.
Uma maneira de o fazer é isolando o pedaço de ADN
contendo o gene, cortando-o com precisão, e
reintroduzindo o gene em um segmento de ADN
diferente.
• Os vectores que são responsáveis por este
processo (clonagem), podem ser plasmídios,
vírus e outros, também manipulados
geneticamente. Como os plasmídios são
sequências circulares de DNA, que se
reproduzem de forma autónoma e são
elementos genéticos extracromossómicos,
tornaram-se portanto, ideais para a
transmissão de informação genética.
Terapia génica
• A terapia génica (TG) é um tratamento para doenças
hereditárias que se caracteriza pela inserção de um
gene funcional dentro da célula humana a fim de
conferir uma nova função ou melhorar os efeitos de
um gene anormal.
• Actualmente, 5% das crianças no mundo nascem com
uma doença hereditária ou congênita e quase 40% dos
adultos são geneticamente predispostos a desenvolver
doenças comuns, como câncer, diabetes, doenças do
coração, entre outras.
• Há dois tipos de técnicas utilizadas na terapia
gênica: a germinativa, que se caracteriza pela
introdução do material genético nos
espermatozóides ou óvulos (células
germinativas), e a somática, pela qual se
introduz o material genético em quaisquer
outras células.
• Quando os genes estão alterados, as proteínas
codificadas por eles são incapazes de desenvolver
sua função biológica normal, dando origem às
“desordens genéticas”. A TG é o meio de colocar a
informação correta de volta nas células. De certa
forma, funciona como um transplante de genes.
• A chave do sucesso da terapia génica é a entrega
do gene correcto para as células que dele
necessitam.
• Na maioria dos estudos de TG, um gene normal é
colocado dentro do genoma para substituir um gene
anormal, causador de alguma doença. A molécula
carregadora, denominada vector, é usada para levar o
gene terapêutico para as células-alvo do paciente.
• Actualmente, o vector mais comum é o vírus, alterado
geneticamente para carregar o DNA humano normal.
Os cientistas têm tentado tirar vantagem da
capacidade do vírus de infectar a célula humana,
porém, no caso da terapia gênica, o genoma do vírus é
modificado para remover os genes causadores de
doença e inserir os de interesse terapêutico.
• O vector viral, portanto, leva o material contendo o
gene humano terapêutico para dentro da célula-alvo. A
produção de uma proteína funcional, produto do gene
terapêutico, restabelece a célula-alvo, o que pode
representar a cura da doença.
• Infelizmente, desordens multigênicas ou multifatoriais,
tais como doenças do coração, pressão alta, mal de
Alzheimer, artrite e diabetes, seriam especialmente
difíceis de serem tratadas usando essa terapia, pois são
causadas por efeitos combinados de variações em
muitos genes.
• Um dos principais fatores que ainda mantém a
TG fora dos tratamentos de escolha para
doenças genéticas é a possível resposta imune
desencadeada por um objecto estranho
introduzido no organismo. Há sempre a
insegurança de que o vector viral atenuado,
sem os genes responsáveis pela sua própria
replicação, poderia readquirir a habilidade de
se replicar e causar a enfermidade no
paciente.
Animais transgénicos
• Genes exógenos sintécticos, modificados
podem ser introduzidos em plantas ou animais
e os organismos transgénicos resultantes
podem ser usados para estudar as funções dos
genes, para produzir novos produtos ou pra
servir como modelos animais de estudos sobre
doenças humanas hereditárias.
• Para produzir animais transgénicos, é usado
método de microinjecção de DNA em zigotos.
• Os ovócitos são cirurgicamente removitos do
genitor feminino e são fertilizados in vitro.
• O DNA é microinjectado no pronucleo
masculino do ovocito fertilizado.
• Algumas células da linhagem germinativa
podem levar o transgene.
Plantas transgénicas
• Manipulação agrícola.
• Um procedimento usado é o bombardeio de 
microprojecteis que envolve disparar 
partículas de tungsténio ou ouro revestidas 
com DNA em células vegetais.
• Outro procedimento é a electroporação, que 
usa um choque eléctrico para introduzir o 
DNA na célula.
• O método mais comum em dicotiledóneas é a
transformação mediada por Agrobacterium
tumifaciens. É uma bactéria do solo que
contém um segmento de DNA que é
transferido da bactéria para células vegetais.
• O Plasmídeo Ti de Agrobacterium tumifaciens 
é uma ferramenta importante de transferência 
de genes de plantas. 
ANÁLISE E MANIPULAÇÃO DE 
DNA
Tecnologias da Informação
com Base no DNA
Genes podem ser isolados por 
clonagem do DNA
Um clone é uma cópia idêntica. Esse termo foi
originalmente aplicado a células de um único tipo,
isoladas e cultivadas para criar uma população de células
idênticas.
Quando aplicado ao DNA, um clone representa muitas
cópias idênticas de um segmento particular do gene. O
gene é cortado de um cromossomo maior, anexá-lo a
uma porção muito menor de DNA transportador e permitir
que microrganismos façam muitas cópias dessa porção
para ela. Esse é o processo de clonagem de DNA. O
resultado é a amplificação selectiva de um determinado
gene ou segmento de DNA, facilitando seu isolamento e
estudo.
Etapas da Clonagem
1. Cortar o DNA-alvo em locais precisos. Endonucleases específicas de
sequência (endonucleases derestrição) fornecem as tesouras moleculares
necessárias.
2. Selecionar uma pequena molécula transportadora de DNA capaz de
autorreplicação. Esses DNAs são chamados vectores de clonagem
(vectores são agentes de entrega). São geralmente plasmídeos ou DNAs
virais.
3. Juntar dois fragmentos de DNA de modo covalente. A enzima DNA-ligase
liga o vector de clonagem e o DNA a ser clonado. Moléculas de DNA
compostas por segmentos ligados de modo covalente a partir de duas ou
mais fontes são chamadas de DNAs recombinantes.
4. Transportar o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula
hospedeira que irá proporcionar a maquinaria enzimática para a replicação
do DNA.
5. Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contêm DNA
recombinante.
Os métodos utilizados para realizar essas e
outras tarefas relacionadas são
colectivamente chamados de tecnologia
do DNA recombinante ou, de modo mais
informal, de engenharia genética.
Os vetores de clonagem permitem a amplificação dos
segmentos de DNA inseridos
Plasmídeos: é uma molécula de DNA circular que se
replica separadamente do cromossoma hospedeiro. A
grande variedade de plasmídeos bacterianos que ocorre
naturalmente varia de tamanho de 5.000 a 400.000 pb.
Para sobreviver na célula hospedeira, os plasmídeos
incorporam várias sequências especializadas que os
tornam capazes de utilizar a energia das células para sua
própria replicação e expressão génica
No laboratório, os pequenos plasmídeos podem ser
introduzidos em células bacterianas em um processo
chamado de transformação.
Bibliotecas de DNA são catálogos especializados de
informação genética
Uma biblioteca de DNA é uma colecção de clones de
DNA reunidos para fins de sequenciamento do genoma,
descoberta de genes ou a determinação da função de um
gene/proteína. A biblioteca pode ter diversas formas,
dependendo da fonte de DNA e do propósito final da
biblioteca.
Proteínas de fusão e imunofluorescência podem localizar
proteínas em células
Um marcador particularmente útil é a proteína fluorescente verde (GFP).
Um gene-alvo (que codifica a proteína de interesse) fundido ao gene de
GFP gera uma proteína de fusão altamente fluorescente – ela literalmente
acende quando exposta à luz azul – e pode ser visualizada directamente
em uma célula viva. A GFP é uma proteína derivada da água-viva
Aequorea victoria
O sequenciamento genómico é auxiliado por novas
gerações de métodos de sequenciamento de DNA
As tecnologias de sequenciamento de DNA continuam a
evoluir. Um genoma humano completo pode agora ser
sequenciado em um ou dois dias, e um genoma
bacteriano, em poucas horas.
Esses avanços se tornaram possíveis com métodos
chamados de sequenciamento de última geração, ou
“nextgen”. Às vezes, a estratégia de sequenciamento é
semelhante ou bastante diferente da utilizada no método
de Sanger.
A eletroforese em gel separa moléculas de DNA de 
diferentes tamanhos
Os fragmentos de DNA maiores migrarão mais lentamente, pois seu
progresso e impedido pela matriz do gel. Após algumas horas, os
fragmentos de DNA se espalham pelo gel de acordo com seu tamanho,
formando bandas individuais, cada uma composta por um conjunto de
moléculas de DNA de mesmo comprimento.
As bandas de DNA em geis de agarose ou de poliacrilamida são
invisíveis, a menos que o DNA seja marcado ou corado de alguma
maneira. Um método particularmente sensível para corar DNA e
mergulhar o gel no corante brometo de etídio, que fluoresce sob luz
ultravioleta quando estiver ligado ao DNA.
Genes podem ser clonados in vitro 
utilizando PCR
Um método poderoso e versátil para amplificar DNA, conhecido como
reacção em cadeia da polimerase (PCR), fornece uma abordagem mais
rápida e directa para clonar DNA, particularmente de organismos cuja
sequência genómica complete seja conhecida. Actualmente, uma vez que
as sequencias genômicas são abundantes, a maior parte das clonagens e
realizada por PCR.
Iniciando a partir de um genoma inteiro, a PCR permite a amplificação do
DNA de uma região especifica, selecionada pelo pesquisador, “purificando”
de forma efetiva este DNA a partir do restante do genoma que não é
amplificado.
Pelo seu poder de amplificar grandes quantidades de ácidos nucleicos, a
PCR é notavelmente sensível: o método pode ser utilizado para detectar
traços de quantidades de DNA em uma gota de sangue deixada em uma
cena de crime ou em algumas copias do genoma viral em uma amostra de
sangue do paciente.
(1) O DNA de fita dupla é aquecido brevemente para separar as duas fitas. (2) O
DNA é exposto a uma quantidade excessiva de um par iniciadores específicos –
projetados para limitar a região do DNA a ser amplificada – e a amostra é
resfriada para permitir que os iniciadores hibridizem com as sequências
complementares nas duas fitas de DNA. (3) Essa mistura é incubada com DNA-
polimerase e os quatro desoxirribonucleosídeos trifosfato, de modo que o DNA
possa ser sintetizado, a partir dos dois iniciadores. Para amplificar o DNA, o ciclo
é repetido muitas vezes por meio do reaquecimento da amostra para separar as
fitas de DNA recém-sintetizadas.
Breves considerações sobre o 
projecto do Genoma Humano
Sequenciamento de DNA
Bioinformática
Fingerprints de DNA
• Tinha como objectivo: sequenciar todos os 
3x109 pares de nucleotideos no genoma 
humano.
• Mapear todos os genes humanos.
• Construir um mapa físico detalhado de todo o 
genoma humano.
• Determinar as sequências de nucleotídeos de 
todos os 24 cromossomas humanos.
• Foi iniciado por James Watson e
posteriormente dado prosseguimento por
Francis Collins.
• A disponibilidade da sequência do genoma
humano pode gerar polémica relativas a
descoberta de doenças genéticas incuráveis
em algumas famílias.
Bioinformática
• É a ciência de reunir, manipular, estocar,
recuperar e classificar informacoes biologicas
relativas a sequencias de DNA e proteinas
registradas.
• Como saber por exemplo se alguém já
sequenciou um determinado fragmento de
DNA?
• Pesquisar Bancos de Dados.
Sequenciamento de DNA
• O sequenciamento de DNA ou sequenciação 
de ADN é uma série de métodos bioquímicos 
que têm como finalidade determinar a ordem 
das bases nitrogenadas adenina (A), guanina
(G), citosina (C) e timina (T) da molécula de 
DNA.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Guanina
Métodos de sequenciamento
• O método tradicional de sequenciamento de DNA
(sequenciação didesoxi ou método de
sequenciação enzimatico) foi proposto por
Frederick Sanger na década de 70 e consiste na
adição de nucleotídeos modificados, chamados
didesoxirribonucleotídeos, que impedem o
crescimento de um fragmento de DNA em
replicação pela DNA polimerase após sua adição.
• Tem sido largamente utilizado por centros de
pesquisa ao redor do globo.
• Pelo método de Sanger, uma fita simples de DNA que será
sequenciada, é hibridizada com um primer de desoxinucleotídeos
marcado na ponta 5´. Quatro misturas de reacção são preparadas
onde os primers utilizados serão elongados por uma DNA
polimerase. Cada mistura contém os quatro desoxinucleosídeos
trifosfato normais mais um dos quatro didesoxinucleosídeos
trifosfato em uma razão de aproximadamente 1/100. Uma vez que
um didesoxinucleotídeo não tem ponta 3´-OH, não é possível haver
elongação a partir do nucleotídeo adicionado, parando a reacção.
Desta forma, cada mistura de reação produzirá cadeias
prematuramente terminadas de acordo com toda ocorrência de um
didesoxinucleotídeo adicionado.
• Cada mistura é então separada em um gel de sequenciamento por
eletroforese para se detectar cada um dos nucleotídeos presentes
na sequência de DNA lida.
http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA
http://pt.wikipedia.org/wiki/Primer
http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerase
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese
Fingerprints de DNA
• Baseado na premissa de que não existem duas 
pessoas com impressões digitais identicas.
• Excepto gémeos idênticos, não existem duas 
pessoas com genomas de mesmas sequências 
denucleotideos.
• Sequências de DNA que se repetem em muitos 
locais cromossomicos.