Roteiros_Métodos Instrumentais de Análises

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Roteiros 
Métodos Instrumentais de Análises 
Manual de Estágio
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de 
Análises
Análise em Espectrofotômetro I 
Determinação do Espectro de 
Absorção (Varredura)
AULA 1
MATERIAIS QUANTIDADE
Solução de Paracetamol (7,5 mg/L) – a 
ser preparado pelo técnico do laboratório 
e utilizando o comprimido de 500 mg 
dissolvido em solução de NaOH 0,01 M.
1 frasco 
Hidróxido de Sódio 0,01M 20 mL
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro UV/Vis 1 aparelho para cada 2 bancadas 
Pipeta Automática 1000 μL 1 unidade
Cubeta de Quartzo 1 unidade para cada 2 bancadas 
Papel Absorvente 1 unidade para cada 2 bancadas
OBJETIVO:
Efetuar a varredura para o Paracetamol em espectrofotômetro UV/Vis. Determinar o 
espectro de absorção do fármaco e definir o comprimento de onda a ser empregado na 
análise espectrofotométrica.
DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO
1. Verificar se o espectrofotômetro está com a lâmpada de deutério acionada para a 
correta medição no espectro UV.
Serviço Social
2. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para λ = 200 nm.
3. Adicionar hidróxido de sódio 0,01M à cubeta de quartzo tomando cuidado para que 
o volume adicionado permita a passagem pela amostra do feixe de luz emitido no inte-
rior do aparelho (80% do volume total da cubeta).
4. Limpar a cubeta com papel absorvente.
5. Zerar o aparelho.
6. Adicionar solução de paracetamol à cubeta de quartzo.
7. Anotar na tabela 1 o valor de absorbância (A) indicado pelo aparelho.
8. Ajustar novo comprimento de onda (λ) no aparelho e repetir os itens 2 a 6.
9. Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos em cada comprimento de 
onda ajustado no aparelho.
Tabela 1: Varredura de absorbância em diferentes comprimentos de onda para análise 
de solução do padrão de referência de Paracetamol (SR).
λ (nm) Absorbância (A)
200
220
240
250
257
260
280
300
400
500
540
Manual de Estágio
Obter o pico de absorbância para análise de solução de PARACETAMOL por espectrofoto-
metria. λ =____________________nm
Discussão:
Montar o gráfico que represente o espectro de absorção do PARACETAMOL tendo 
a absorbância (A) como ordenada e comprimento de onda (λ) como abscissa. Marcar 
o ponto onde ocorreu o pico de absorbância e indicar o comprimento de onda a ele 
relacionado. 
Serviço Social
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de 
Análises
Análise em Espectrofotômetro II 
Preparação de Solução de Paracetamol e 
utilização da Equação de Beer-Lambert
AULA 2
MATERIAIS QUANTIDADE
Água Destilada 1 frasco (Pisseta)
Paracetamol (500 mg) 2 comprimidos por grupo
Béquer (200 mL) 1 unidade
Hidróxido de Sódio 0,1M 100 mL
Hidróxido de Sódio 0,01M 20 mL
Almofariz e pistilo 1 unidade
Balão Volumétrico (200 mL) 1 unidade
Balão Volumétrico (100 mL) 2 unidades
Filtro Gravitacional 1 unidade
Papel de Filtro Gravimétrico 2 unidade
Pipeta Volumétrica 10 mL 3 unidades
Proveta 100 mL 1 unidade
Proveta 50 mL 1 unidade
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro UV/Vis 1 aparelho para cada 2 bancadas 
Balança Analítica 1 aparelho para cada 2 bancadas
Agitador Mecânico 1 unidade 
Pipeta Automática 1000 μL 1 unidade
Cubeta de Quartzo 1 unidade para cada 2 bancadas 
Papel Absorvente 1 unidade para cada 2 bancadas
Papel Manteiga ou Alumínio -----
Manual de Estágio
OBJETIVO:
Determinar a concentração de paracetamol utilizando a Equação de Beer-Lambert. 
PROCEDIMENTO:
PARTE I: OBTENÇÃO DA SOLUÇÃO DE PARACETAMOL (AMOSTRA).
1. Pesar e pulverizar 2 comprimidos de paracetamol (500 mg). 
2. Em um béquer de 200 mL, adicionar 0,15 g do comprido triturado, adicionar 50 mL 
de hidróxido de sódio 0,1 M e 100 mL de água destilada.
3. Agitar mecanicamente por 15 minutos e transferir quantitativamente para um balão 
volumétrico de 200 mL (BALÃO 1), completando com água destilada.
4. Homogeneizar, filtrar e diluir 10 mL do filtrado para 100 mL com água destilada, em 
balão volumétrico (BALÃO 2).
5. Transferir 10 mL da solução resultante para balão volumétrico de 100 mL, adicionar 
10 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e completar o volume com água destilada. (BALÃO 3). 
6. Esta solução de paracetamol será considerada como a 100% e será utilizada nos 
roteiros 3 e 4.
PARTE II: DETERMINAÇÃO DA ABSORBÂNCIA (A) PARA A SOLUÇÃO DE 
PARACETAMOL.
1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para = 257 nm.
2. Adicionar hidróxido de sódio 0,01 M à cubeta de quartzo, tomando cuidado para 
que o volume adicionado permita a passagem pela amostra do feixe de luz emitido no 
interior do aparelho (80% do volume total da cubeta).
3. Limpar a cubeta com papel absorvente.
4. Zerar o aparelho.
Serviço Social
5. Adicionar a solução de paracetamol (contida no BALÃO 3) à cubeta de quartzo.
6. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (repetir a leitura por três vezes).
7. Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela.
Tabela 1: Absorbância obtida pela leitura de solução de Paracetamol.
Replicata Absorbância (A)
1
2
3
Média
8. Calcular a concentração de paracetamol (c) a partir da equação da Lei de Beer-
Lambert. Dado: ε = 13000. 
A= ε ×b × c
Observação: necessário determinar o caminho óptico para a cubeta empregada 
(b; cm)
Manual de Estágio
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de 
Análises
Análise em Espectrofotômetro III
Montagem de Curva de Calibração 
para Análise do Paracetamol 
(Avaliação da Linearidade do Método)
AULA 3
MATERIAIS QUANTIDADE
Água Destilada 1 frasco (Pisseta)
Paracetamol (solução estoque – 7,5 mg/100 mL)
Obs.: preparado em solução de NaOH 0,1M. 
Preparado pelo técnico a partir do comprimido 
de 500 mg.
1 frasco (200 mL)
Hidróxido de Sódio 0,01 M 200 mL
Hidróxido de Sódio 0,1 M 200 mL
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
Pipeta Graduada de 20 mL e 10 mL 1 unidade de cada
Pera para pipeta 1 unidade 
Béquer (50 mL) 1 unidade
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro UV/Vis
1 aparelho para cada 2 bancadas 
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
Micropipeta Automática (1000 μL) 1 unidade
Ponteiras de 1000  μL 10 unidades
Balão Volumétrico (100 mL) 5 unidades
Papel Absorvente 1 unidade
Cubeta de Quartzo 1 unidade para cada bancada
Serviço Social
OBJETIVO:
Montagem da Curva de Calibração (concentração versus absorbância) para análise do 
Paracetamol por espectrofotometria. Avaliação da linearidade do método instrumental. 
PROCEDIMENTO:
Parte I: Preparo dos Padrões de Paracetamol em Balão Volumétrico:
1. Transferir parte da solução estoque de Paracetamol para um béquer de 100 mL.
2. Nomear cinco balões volumétricos de 100 mL indicando as concentrações:
3. O volume de solução estoque a ser adicionado em cada balão volumétrico de 100 mL 
para obter a concentração final desejada será:
Concentração (μg/L) VEstoque (mL)
9,0 12
7,5 10
6,0 8,0
4,5 6,0
3,0 4,0
Solução 
Estoque 
(7,5 mg/100 mL)
9,0μg/mL 7,5μg/mL 6,0μg/mL 4,0μg/mL 2,0μg/mL
Manual de Estágio
4. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, o volume de solução estoque calculado 
para o balão volumétrico correspondente, adicionar 10 mL de solução de NaOH 0,1 M e 
completar com água destilada. Homogeneizar (evitar erro de paralaxe). 
Parte 2: Dosagem dos Padrões em Espectrofotômetro: 
1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para = 257 nm.
2. Adicionar hidróxido de sódio 0,01M à cubeta de quartzo (branco). 
3. Limpar a cubeta com papel absorvente.
4. Zerar o aparelho.
5. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar as soluções preparadas, uma a 
uma, à cubeta de quartzo e efetuar a leitura no aparelho. Lavar a cubeta com água des-
tilada entre cada solução padrão analisada.
6. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho.
7. Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos.
Obs.: Descartar as amostras lidas no aparelhoem frasco de descarte adequado.
Tabela: Resultados de Absorbância (A) para as diferentes concentrações de Paracetamol
Concentração (mg/L) Abs
2,0
4,0
6,0
7,5
9,0
11
Serviço Social
OBSERVAÇÃO: MONTAGEM DA CURVA DE CALIBRAÇÃO E EQUAÇÃO DA RETA:
Utilizando software apropriado, montar a curva de calibração Abs Vs. Concentração. 
Determinar a equação da reta e coeficiente de correlação. 
Equação de Reta (Calibração):
Abs = _______ x [Concentração] + ______
Análise do coeficiente de correlação (r): o valor calculado deverá estar próximo a 1,000, 
que seria o indicativo de boa correlação entre a absorbância lida no aparelho e a concentração 
da substância na amostra. Segundo a RDC 166/2017, o método será considerado LINEAR 
quando apresentar r≥0,990.
Manual de Estágio
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de 
Análises
Avaliação da Seletividade, Precisão e 
Exatidão
AULA 4
MATERIAIS QUANTIDADE
Água Destilada 1 frasco (Pisseta)
Ácido Cítrico (2 mg/L). Preparado pelo técnico. 1 frasco (200 mL)
Solução de Referência (solução de paracetamol 
preparado pelo técnico – 2,0 mg/L). Preparado 
a partir do comprimido de paracetamol e 
dissolvendo em NaOH 0,01M.
1 frasco (200 mL)
Amostra (solução de paracetamol preparado pelo 
grupo – 7,5 mg/L)
1 frasco 
Hidróxido de Sódio 0,01 M 200 mL
Recipiente para descarte de líquido 1 frasco
Béquer (50 mL) 1 unidade
Tubos de ensaio 11 unidades
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE
Espectrofotômetro UV/Vis
1 aparelho para cada 2 bancadas 
(Recomendado: 2 a 4 grupos)
Micropipeta Automática (1000 μL) 1 unidade
Ponteiras de 1000 μL 10 unidades
Balão Volumétrico (50 mL) 5 unidades
Papel Absorvente 1 unidade
Cubeta de Quartzo 1 unidade para cada bancada
Serviço Social
Observação: A solução de referência de ácido cítrico (2 mg/L) deverá ser preparada 
pelo técnico do laboratório. 
OBJETIVO:
Realizar os ensaios de seletividade, precisão e exatidão para a validação parcial do 
método instrumental. 
PROCEDIMENTO:
PARTE I: ENSAIO DE SELETIVIDADE.
1. Nomear dois tubos de ensaio como:
 A – Amostra (solução preparada pelo grupo na aula 2 – 7,5 mg/L)
 B - Amostra COM ADIÇÃO DE ÁCIDO CÍTRICO 2 mg/L (preparado pelo técnico).
2. Adicionar, com auxílio de micropipeta automática, 2 mL da solução amostra no tubo 
“A”.
3. Ao tubo “B” adicione 1 mL de solução de ácido cítrico em 1 mL de solução amostra.
4. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para = 257 nm.
5. Adicionar hidróxido de sódio 0,01M à cubeta de quartzo (branco). 
6. Limpar a cubeta com papel absorvente.
7. Zerar o aparelho.
8. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo A à cubeta de 
quartzo e efetuar a leitura no aparelho. Lavar a cubeta com água destilada.
9. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (A).
10. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução matriz (solução de 
paracetamol preparado pelo grupo) à cubeta de quartzo e efetuar a leitura no aparelho. 
Lavar a cubeta com água destilada.
Manual de Estágio
11. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo B à cubeta de 
quartzo e efetuar a leitura no aparelho. Lavar a cubeta com água destilada.
12. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (AC).
Tabela de Resultados
Tubo Absorbância (A)
A (Amostra) A = 
B (Amostra + Ácido Cítrico) AC =
13. Utilizar os resultados para o cálculo da porcentagem de recuperação e avaliação da 
seletividade do método de acordo com a RDC 196/2017.
PARTE II: ENSAIO DE PRECISÃO.
1) Cálculo do teor a 80% da concentração da Solução de Paracetamol:
a) Transferir 8 mL da solução referência (7,5 mg/L) para balão volumétrico de 100 mL.
b) Adicionar 10 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e completar o volume com água 
destilada. 
c) Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fazendo 
o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 257 nm utilizando hidróxido 
de sódio 0,01 M para ajuste do zero. 
d) Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela.
Serviço Social
Tabela 1: Absorbância obtida pela leitura de solução de Paracetamol.
Replicata (80% da concentração) Absorbância (A)
1
2
3
Média
2) Cálculo do teor a 120% da concentração da Solução de Paracetamol.
a) Transferir 12 mL da solução referência (7,5 mg/L) para balão volumétrico de 100 mL.
b) Adicionar 10 mL de hidróxido de sódio 0,1 M e completar o volume com água 
destilada. 
c) Medir três vezes (descartando e colocando novamente a solução na cubeta e fazendo 
o ajuste do zero) as absorbâncias das soluções resultantes em 257 nm utilizando hidróxido 
de sódio 0,01 M para ajuste do zero. 
d) Registrar as medidas de Absorbância (A) na tabela.
Tabela 1: Absorbância obtida pela leitura de solução de Paracetamol.
Replicata (120% da concentração) Absorbância (A)
1
2
3
Média
Obs.: Os valores correspondentes a 100% da concentração já foram obtidos na aula 2.
Manual de Estágio
3) Utilizar os resultados para o cálculo do coeficiente de variação (CV%) e avaliação da 
precisão do método de acordo com a RDC 166/2017. 
PARTE III: ENSAIO DE EXATIDÃO A PARTIR DA PORCENTAGEM DE RECUPERAÇÃO.
 
1. Nomear dois tubos de ensaio como:
2. A – Amostra (solução preparada pelo grupo na aula prática anterior – 7,5 mg/L)
3. B – Amostra COM ADIÇÃO DA SOLUÇÃO REFERÊNCIA DE PARACETAMOL (2 mg/L)
4. Adicionar, com auxílio de micropipeta automática, 2 mL da solução amostra no tubo 
“A”.
5. Ao tubo “B”, adicione 1 mL de solução referência (paracetamol – 2mg/L) em 1 mL de 
solução amostra.
6. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para = 257 nm.
7. Adicionar hidróxido de sódio 0,01M à cubeta de quartzo (branco). 
8. Limpar a cubeta com papel absorvente.
9. Zerar o aparelho.
10. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo A à cubeta de 
quartzo e efetuar a leitura no aparelho. Lavar a cubeta com água destilada.
11. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (A).
12. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução amostra (solução de 
paracetamol preparado pelo grupo) à cubeta de quartzo e efetuar a leitura no aparelho. 
Serviço Social
Lavar a cubeta com água destilada.
13. Com auxílio da micropipeta automática, adicionar a solução do Tubo B à cubeta de 
quartzo e efetuar a leitura no aparelho. Lavar a cubeta com água destilada.
14. Anotar o valor de absorbância indicado pelo aparelho (AP).
15. Tabela de Resultados
Tubo Absorbância (A)
A A = 
B AP =
16. Utilizar os resultados para o cálculo da porcentagem de recuperação e avaliação da 
seletividade do método de acordo com a RDC 166/2017. 
Em que:
- AP: concentração para a amostra com adição do padrão de referência.
- A: concentração para a amostra sem adição do padrão de referência.
- P: concentração do padrão de referência.
No método da adição de padrão, os valores aceitos são entre 80% – 120% de recuperação 
para que o método possa ser considerado seletivo. 
Manual de Estágio
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de 
Análises
Análise por Cromatografia em 
Camada Delgada I 
Análise Cromatográfica de Ácido 
Acetilsalicílico e Paracetamol
AULA 5
EQUIPAMENTOS
1 Cuba Cromatográfica a cada 3 grupos
1 Banho de Aquecimento (40 °C) a cada 3 grupos
Lâmpada de UV 
Reagentes
50 mL de Solução de Extração (25 partes de acetato de etila, 1 parte de etanol e 1 parte 
de ácido acético) por grupo
Ácido Acetilsalicílico e Paracetamol (1 comprimido triturado de cada medicamento) – 
100 mg de cada substância (amostra)
OBJETIVO:
Avaliar a separação de princípios ativos de ação analgésica pela técnica da CCD. Estudar 
o emprego de técnicas cromatográficas para separação e análise de substâncias em função 
de sua estrutura química e do fenômeno de adsorção cromatográfica. Serão analisadas 
amostras de aspirina, paracetamol e coristina D.
PROCEDIMENTO:
Parte 1: Preparação das Amostras de Analgésicos (Técnico do Laboratório)Serviço Social
1. Transferir para béquer, previamente, a amostra triturada de ácido acetilsalicílico e 
paracetamol (substância a ser analisada). Um béquer para cada amostra triturada.
2. EM CAPELA: A cada béquer, adicionar 10 mL de solução de extração.
3. Com auxílio de bastão de vidro, efetuar agitação.
4. Levar os béqueres a banho de água e deixar por 5 minutos em aquecimento mod-
erado (40 °C).
5. Aguardar a decantação das partículas insolúveis.
PARTE 2: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA:
O técnico deverá deixar preparada uma cuba contendo a fase móvel (acetato de etila 
com 0,5% de ácido acético glacial). Deverá esperar tempo suficiente para que ocorra a 
completa saturação. Manter a cuba coberta até o momento da análise.
O aluno deverá iniciar o seguinte procedimento:
1. Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm) efetue duas marcações (cerca de 1 a 2 cm da 
extremidade), indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto em que se indicará 
o final da corrida.
2. Utilizando um capilar, aplique duas porções de cada extrato sobre uma placa de 
sílica (2,5 x 7,5 cm) a 1,0 cm de uma das extremidades.
3. Colocar, cuidadosamente, a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de aplicação 
da amostra mergulhe no solvente.
4. Aguardar até que o solvente atinja cerca de 0,5 cm do topo da placa, remover a placa 
e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel).
5. Para que seja possível a visualização na placa de sílica, é necessário levar até 
uma lâmpada de UV (utilizar óculos de segurança e obedecer a todas as regras de 
Manual de Estágio
segurança quanto ao uso deste tipo de lâmpada passadas pelo professor no momento 
da visualização).
6. Marcar, com auxílio de lápis, o ponto visualizado para cada analgésico após a corrida 
na placa de sílica. 
7. Com auxílio de régua, determinar a distância de cada ponto e calcular os valores de Rf.
8. Analise o resultado da CCD e indique qual a molécula presente em cada mancha 
cromatográfica obtida.
9. Relacione a molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha:
Molécula Rf
Paracetamol
Ácido Acetilsalicílico
Serviço Social
Principais Princípios Ativos presentes nos Analgésicos:
Manual de Estágio
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de 
Análises
Cromatografia em Camada Delgada 
(CCD) II
Análise Cromatográfica de Pigmentos
AULA 6
EQUIPAMENTOS Quantidade a cada 3 bancadas
Cuba 
2 (uma para a análise e uma para revelação 
com iodo)
Chapa de Aquecimento 1 (manter na CAPELA)
Balança Semianalítica 1
MATERIAIS Quantidade por Grupo
Béquer 50 mL 2
Erlenmeyer 125 mL 2
Funil para Filtração 1
Funil de Separação 2
Suporte 1
Garra 2
Pinça metálica 1
Bastão de vidro 1
Capilares 2
Papel de filtro 2
Placa Cromatográfica 1
Hexano Para extração e preparo da cuba
Acetona Para extração e preparo da cuba
Iodo sólido Para revelação
Pimentões (vermelho e amarelo) 30 g de cada para extração
Sulfato de Sódio Anidro ----
Papel para pesagem em balança 2
Espátula 2
Serviço Social
OBJETIVO:
Avaliar a separação de pigmentos pela técnica da CCD. Estudar o emprego de técnicas 
cromatográficas para separação e análise de substâncias em função de sua estrutura 
química e do fenômeno de adsorção cromatográfica. 
PROCEDIMENTO:
PARTE 1: PREPARAÇÃO DO EXTRATO (TÉCNICO DO LABORATÓRIO)
As etapas 1 a 11 serão executadas pelo técnico do laboratório a fim de permitir a 
visualização do resultado da análise no próprio dia da prática pelo aluno. A depender da 
disponibilidade de horário, poderá ser feita uma demonstração pelo professor das etapas 
de extração como forma de elucidar o procedimento.
1. Pesar cerca de 30 g dos pedaços (previamente cortados) de cada pimentão (verde, 
vermelho e amarelo) em béqueres diferentes.
2. Adicionar, com auxílio de proveta, 10 mL de acetona e 50 mL de hexano.
3. Transferir, cada mistura, separadamente, para um almofariz com pistilo e macerar 
até obter uma pasta homogênea.
4. Deixar em repouso por 1 hora.
5. Filtrar e transferir para um funil de separação.
6. Separar a fase aquosa em um béquer.
7. Adicionar 15 mL de água destilada. Agitar suavemente para evitar formação de 
emulsão.
8. Separar e descartar a fase aquosa no béquer.
9. Transferir a fase orgânica para um Erlenmeyer de 125 mL.
10. Adicionar 2 g de sulfato de sódio anidro. Deixar em repouso por 5 minutos.
11. Filtrar em um béquer e concentrar os extratos até o volume de 1 mL através de 
aquecimento em manta a 70 °C.
Manual de Estágio
PARTE 2: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA (GRUPO DE ALUNOS):
O técnico deverá deixar preparada uma cuba contendo a fase móvel (hexano com 5% de 
acetona). Deverá esperar tempo suficiente para que ocorra a completa saturação. Manter a 
cuba coberta até o momento da análise.
O aluno deverá iniciar o seguinte procedimento:
1. Em uma placa de sílica (2,5 x 7,5 cm) efetue duas marcações (cerca de 1 a 2 cm da 
extremidade), indicando o ponto de aplicação da amostra e o ponto em que se indicará 
o final da corrida.
2. Utilizando um capilar, aplique o extrato concentrado de cada pimentão (em posições 
diferentes) sobre a placa de sílica na altura da marcação.
3. Colocar, cuidadosamente, a placa de sílica na cuba, evitando que o ponto de aplica-
ção da amostra mergulhe no solvente.
4. Aguardar até que o solvente atinja a segunda marcação do topo da placa (final da 
corrida).
5. Remover a placa e marcar a frente do solvente (linha de chegada da fase móvel).
6. Deixar secar ao ar por 5 minutos e observar o número de manchas coloridas formadas. 
7. Se necessário, efetuar revelação com vapor de iodo: em uma cuba contendo iodo 
sólido (preparado 30 minutos antes do início da aula), acondicionar a placa de sílica por 
alguns minutos até observação de manchas escuras.
8. Efetuar o cálculo Rf para as manchas observadas:
Serviço Social
Discussão: 
Têm-se três tipos de moléculas presentes no extrato de pimentão: 
- Carotenoides
- Criptoxantinas
- Captoxantinas
Portanto esperam-se, ao menos, três manchas como resultado da análise por CCD.
Moléculas:
 (Criptoxantina)
 (Capsantina)
Manual de Estágio
a-) Analise o resultado da CCD e indique qual a molécula presente em cada mancha 
cromatográfica obtida.
b-) Relacione a molécula ao valor de Rf calculado para cada mancha:
Molécula Rf
Caroteno
Capsantina
Criptoxantina
Serviço Social
Instituto de Ciências da Saúde
Disciplina: Métodos Instrumentais de 
Análises
Análise por Cromatografia em Coluna 
de Troca Iônica 
Hemoglobina Glicada em Amostra de 
Sangue
AULA 7
MATERIAIS POR GRUPO
Coluna de Separação para Hb- Glicada (Kit de Glicohemoglobina) – 1 unidade
Tubos de Ensaio Grandes – 3 unidades
Micropipeta (1000 microlitros) – 1 unidade
Micropipeta (10 – 100 microlitros, ou equivalente) – 1 unidade
Ponteiras de 1000 microlitros.
EQUIPAMENTOS
Espectrofotômetro (λ)= 415 nm)
Cubeta de Quartzo – 1 unidade por equipamento
Reagentes por Grupo
Água Destilada
Amostra de Hemolisado – 100 microlitros (fracionado)
Tampão de Separação (Frasco 1 – Kit Labtest) - 5,0 mL (fracionado)
OBJETIVO:
Avaliar a separação das frações de hemoglobina glicada e normal em coluna de troca 
iônica. Determinar a porcentagem de hemoglobina glicada em amostra de sangue.
Manual de Estágio
PROCEDIMENTO:
Parte 1: PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE HEMOLISADO (Executado pelo Técnico do 
Laboratório)
1. Pipetar em tubo de ensaio 1,0 mL de amostra de sangue total (coletado com EDTA) 
bem homogeneizado.
2. Centrifugar a 2000 RPM por 5 minutos. Retirar o plasma sem ressuspender as hemácias.
3. Adicionar 3,0 mL de NaCl (0,85%), homogeneizando o tubo.
4. Centrifugar e remover o sobrenadante sem ressuspender as hemácias. 
5. Ressuspender as hemácias em 3,0 mL de NaCl (0,85%). Centrifugar e acertar o vol-
ume para a marca de 1,0 mL, retirando o excesso de sobrenadante.
6. Em um tubo de 12x75, adicionar 0,4 mL de soluçãohemolisante (Frasco 2 – kit) e 0,1 
mL de amostra de hemácias.
7. Agitar, vigorosamente, por 20 segundos.
8. Aguardar 5 min para que ocorra a hemólise.
PARTE 2: PREPARAÇÃO DA COLUNA CROMATOGRÁFICA (Executado pelo Técnico 
do Laboratório)
As etapas 1 a 5 deverão ser realizadas pelo Técnico do Laboratório no dia 
da prática, para que seja possível realizar a separação cromatográfica e análise 
espectrofotométrica pelo grupo de alunos. O grupo de alunos iniciará a prática a 
partir da etapa 6. 
Serviço Social
1. Nomear um tubo de ensaio como “Tampão”.
2. Acomodar a coluna de Troca Iônica sobre este tubo de ensaio e retirar a tampa 
superior da coluna.
3. Introduzir o bastão fazendo movimentos giratórios descendentes e ascendentes para 
ressuspender a resina (fase estacionária).
4. Remover a tampa inferior e acomodar novamente a coluna (verticalmente) sobre o 
tubo de ensaio “Tampão”.
Obs.: Não permita que a ponta da coluna encoste no líquido transferido para o tubo.
5. Aguarde que todo o líquido penetre no interior da resina (fase estacionária). Fechar 
a saída de eluente da coluna e aguardar o início da aula prática.
PARTE 3: ANÁLISE CROMATOGRÁFICA (Executado pelo grupo de alunos no dia da 
prática):
6. Adicione 0,05 mL (50 microlitros) de amostra de hemolisado sobre a resina. (Com 
cuidado para evitar formação de bolhas de ar).
7. Aguardar que o hemolisado penetre no interior da resina.
8. Transferir a coluna para um novo tubo de ensaio (enumerado como “1”).
9. Adicionar, lentamente (com a adição pela parede da coluna), 3,5 mL de tampão (Fra-
sco 1 – kit).
10. Aguardar até que todo o tampão penetre no interior da resina.
11. Homogeneizar o líquido coletado no Tubo “1”.
12. Enumerar outro tubo de ensaio (seco e limpo) como “2”. Adicionar a este tubo 7,0 mL 
de água destilada e 0,02 mL (20 microlitros) de amostra de hemolisado. Homogeneizar.
Manual de Estágio
13. Levar os tubos “1” e “2” para o espectrofotômetro, previamente ajustado em  = 415 
nm, zerando com água destilada.
14. Efetuar a leitura das absorbâncias dos dois tubos (A1 e A2).
15. Efetuar o cálculo do teor de Hemoglobina Glicada na amostra de sangue:
Obs.: Considera-se como valor de referência um teor de Hb-G entre 5,3% e 8,0%.