PRÁTICA 6 - DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE PEROXIDASE DE FONTE VEGETAL

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PRÁTICA 6 - DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE PEROXIDASE DE FONTE VEGETAL
04.10.2023
1 Fundamento da técnica
Ter um entendimento prévio do comportamento cinético de uma enzima é fundamental quando se pretende desativá-la ou utilizá-la em contextos industriais, por exemplo. A maioria das enzimas segue o padrão cinético de Michaelis-Menten. Na análise desse cenário, os três principais parâmetros cinéticos a serem considerados são: a velocidade máxima (VM), a constante de Michaelis-Menten (KM) e a constante catalítica (Kcat). A VM representa a taxa máxima de uma reação enzimática, enquanto a KM indica a concentração de substrato necessária para alcançar metade da VM da reação, revelando o grau de afinidade da enzima pelo substrato. Por sua vez, o Kcat estabelece a taxa limitante da reação catalisada por uma única molécula de enzima em condições de saturação. Ter conhecimento desses parâmetros cinéticos possibilita a comparação da eficiência catalítica, usando a constante de eficiência (Ke), entre diferentes enzimas, substratos variados e condições de processo, otimizando assim o uso dessas enzimas na indústria.
2 Objetivo do experimento
Construir perfis de Lineweaver-Burk para determinação dos parâmetros cinéticos (velocidade máxima (VM) e constante de Michaelis-Mentem (KM)) de peroxidase de extrato bruto (EB) de fonte vegetal.
3 Material/equipamento utilizados na prática
Extrato bruto de fonte vegetal (EB), Béquer (50 mL) (9 unidades), Pisseta com água destilada, Pipetas automáticas (P1000 (01), P100 (01) ou P200 (01)), Cronômetro, Espectrofotômetro, Cubetas.
4 Roteiro dos procedimentos
5 Dados obtidos no experimento
Tabela 1: Dados de absorvância para oxidação do guaiacol em diferentes concentrações catalisada por peroxidase de rabanete. 
	Tempo (seg)
	Guaiacol (mM)
	 
	10 mM
	20mM
	40 mM
	80 mM
	100 mM
	20
	0,01200
	0,01500
	0,02000
	0,01900
	0,01300
	40
	0,01500
	0,02500
	0,02700
	0,02800
	0,01900
	60
	0,01700
	0,03000
	0,03700
	0,04000
	0,03400
	90
	0,02300
	0,03300
	0,05000
	0,05800
	0,05900
	120
	0,02700
	0,04000
	0,06200
	0,07700
	0,07500
	150
	0,03200
	0,04600
	0,07300
	0,09200
	0,09100
	180
	0,03600
	0,05300
	0,08400
	0,10700
	0,11000
	240
	0,04500
	0,06500
	0,10500
	0,13500
	0,14000
	Coef. x
	0,00020
	0,00020
	0,00050
	0,00050
	0,00060
Tabela 2: Parâmetros cinéticos (VM e KM) de peroxidase de extrato bruto de rabanete
	#
	Guaiacol (S) (mM)
	Coef. angular
	1/S
	Vi (µmol/min)
	1/Vi
	Equação
	VM
	KM
	
	
	
	(mM-1)
	
	(µmol/min) -1
	reta
	(µmol/min)
	(mM)
	1
	10
	0,0002
	0,100
	0,001353
	738,8889
	y = 5778,3x + 242,07 
	0,00413
	23,0334201
	2
	20
	0,0002
	0,050
	0,001353
	738,8889
	
	
	
	3
	40
	0,0005
	0,017
	0,003383
	295,5556
	
	
	
	4
	80
	0,0005
	0,013
	0,003383
	295,5556
	
	
	
	5
	100
	0,0006
	0,010
	0,004060
	246,2963
	
	
	
6 Resultados da aula
Figura 1: Curvas de progresso para oxidação do guaiacol em diferentes concentrações catalisada por peroxidase de rabanete. 
Figura 2. Perfil de Lineweaver Burk para determinação de VM e KM de peroxidase de extrato bruto de rabanete em reação de oxidação de guaiacol.
7 Conclusão/comentários finais sobre a resolução
Na presente prática, foi construído os perfis de Lineweaver-Burk para determinação dos parâmetros cinéticos (velocidade máxima (VM) e constante de Michaelis-Mentem (KM)) de peroxidase de extrato bruto (EB) de fonte vegetal do Guaiacol em diferentes concentrações; ademais, foi determinado os dados de absorvância para oxidação do guaiacol em diferentes concentrações catalisada por peroxidase de rabanete. O Km encontrado foi de 23,0334201nM, enquanto de Vmáx de 0,00413µmol/min.
A determinação dos parâmetros cinéticos da peroxidase de fonte vegetal é de grande importância para a indústria por diversas razões. Primeiramente, essa análise permite otimizar os processos industriais nos quais essa enzima é utilizada. Ela é amplamente empregada na indústria de alimentos, desempenhando um papel crucial em produtos como sucos, vinhos, laticínios e produtos de panificação. Ao compreender os parâmetros cinéticos, as empresas podem ajustar as concentrações e as condições de reação da enzima (vide temperatura e pH), melhorando a eficiência desses processos.
Além disso, a atividade da peroxidase em produtos alimentícios é um indicador fundamental da qualidade e da integridade desses produtos. A análise dos parâmetros cinéticos permite monitorar a atividade da enzima ao longo do tempo, contribuindo para garantir a qualidade e a segurança dos alimentos.
O conhecimento dos parâmetros cinéticos também é essencial no desenvolvimento de novos produtos alimentícios. Isso possibilita ajustar as formulações e os processos de produção de acordo com as especificações desejadas, como sabor, textura e vida útil. Outrossim, a determinação dos parâmetros cinéticos pode resultar em economia de recursos, pois as empresas podem ajustar suas operações de forma mais precisa, evitando desperdícios e maximizando a eficiência em seus processos industriais. 
Portanto, conforme o exposto, o conhecimento do perfil cinético das enzimas é fulcral para a indústria de alimentos. Assim, a aula prática presente forneceu conhecimentos sobre o grande potencial destas biomoléculas.