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1 Plano de Aula de Parasitologia – Caso 6: ACL Beatriz Macacari – 341820563 Objetivos de aprendizagem: 1) Descrever o ciclo biológico dos parasitas causadores das leishmanioses (Visceral e Tegumentar). 2) Descrever os sintomas, modo de transmissão e tratamento. 3) Interpretar resultados de diagnostico parasitológico e molecular. Resolução: 1) Descrever o ciclo biológico dos parasitas causadores das leishmanioses ( Visceral e Tegumentar). Os hospedeiros vertebrados suscetíveis são infectados quando formas promastigotas metacíclicas são inoculadas pelas fêmeas dos insetos vetores, durante o repasto sanguíneo. Esses insetos possuem o aparelho bucal curto e rígido, adaptado para dilacerar tecidos e vasos sanguíneos do hospedeiro, o que proporciona a obtenção de um misto de sangue, linfa e restos celulares durante a alimentação, importantes tanto para a inoculação das formas infectantes pelo inseto como para a ingestão das amastigotas existentes no hospedeiro vertebrado. A saliva do inseto, inoculada neste ambiente possui componentes biológicos que atuam como anticoagulante, vasodilatador e antiagregador plaquetário, favorecendo o fluxo de sangue e o acúmulo de linfa. Outros fatores presentes na saliva de flebotomíneos têm atividade químiotática para a rápida infiltração de neutrófilos e recrutamento de macrófagos na pele e, imunorreguladora na interação e na proliferação de macrófagos, impedindo a ação efetora dessas células na destruição dos parasitos. A multiplicação dos parasitos nos macrófagos, células onde o processo de relação hospedeiro/parasito se estabelece, parece envolver a participação de neutrófilos e outras células locais da pele, como células de Langerhans e fibroblastos. A saliva de Lutzomyia longipalpis contém o mais potente vasodilatador conhecido, o maxadilan, que além desta ação parece ser responsável pela maioria dos efeitos imunomodulatórios sobre a célula hospedeira, durante a transmissão de Leishmania infantum. Antes de sua internalização pelas células hospedeiras, a promastigota metacíclica necessita sobreviver à lise pelo sistema complemento, evitando a formação do complexo de ataque à membrana (membrane attack complex - MAC). Um dos mecanismos desta resistência é devido, em parte, a modificações estruturais no LPG, o qual se torna mais longo na forma metacíclica. Assim, mesmo após a ativação do complemento, frações como C e C3b não se ligariam diretamente à membrana do parasito por causa da cobertura desta pelo LPG, dificultando o acesso e a inserção do complexo C5b_9 ou a formação de C5 convertase, impedindo a sua lise. Por outro lado, a gp63 também preveniria a ação do complemento mediante clivagem de C,h em C3bj. As promastigotas metacíclicas podem, ainda, interagir com outras proteínas do soro para ativar o complemento, facilitando a sua adesão à membrana do macrófago. Durante o processo de endocitose do parasito, por causas fisiológicas, a célula hospedeira aumenta intensamente a sua atividade respiratória. Os produtos liberados neste processo envolvem a formação de óxido nítrico e Espécies Reativas de Oxigênio - EROs, por exemplo, superóxidos, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila (O,-, H ,0 , e OH-), conhecidos por serem altamente lesivos para membranas celulares. Os parasitos necessitam da utilização de mecanismos de escape a este ataque. Novamente o LPG aparece como uma molécula protetora contra a ação destes radicais. Além disto, a saliva do inseto, presente neste ambiente, exercendo ação inibidora da estimulação dos macrófagos, reduz a capacidade de estas células produzirem óxido nítrico (NO). Entretanto, a internalização é também um dos mecanismos de defesa do parasito, uma vez que o ambiente é imunologicamente hostil às formas metacíclicas e, para a sua sobrevivência no hospedeiro vertebrado, a Leishmania precisa da transformação em amastigota, que é uma forma parasitária intracelular obrigatória. A internalização de Leishmania se faz através da endocitose mediada por receptores na superfície do macrófago. As promastigotas metacíclicas utilizam a opsonização com C3b e C3bj para se ligarem a CRI e CR3 no macrófago. Estes receptores promovem a fagocitose, sem estimular o aumento da atividade respiratória da célula e a consequente geração de radicais livres. Por meio deles, o parasito pode ser prontamente internalizado pelas células de Langerhans da derme, embora não se reproduza aí. A rápida transformação em amastigotas é outra forma de o parasito evadir ao ataque do hospedeiro. Após a internalização, a promastigota metacíclica é encontrada dentro do vacúolo fagocitário, 2 o fagossomo. Ocorre, então, o fenômeno de fusão entre o fagossomo e os lisossomos, o que permite a passagem de enzimas para o seu interior e a formação do fagolisossomo. O LPG do parasito pode retardar a fusão, permitindo sua adaptação às condições do novo ambiente. A diferenciação para a forma amastigota é condição para a sobrevida do parasito no fagolisossomo. Nestas condições, a protease gp63 atua degradando as enzimas lisossomais. Mantendo o controle das condições ambientais internas do fagolisossomo, a amastigota inicia o processo de sucessivas multiplicações. A ausência do controle parasitário pela célula hospedeira determina a morte celular, a sua ruptura e a consequente liberação de formas amastigotas no meio extracelular, as quais serão, por mecanismo semelhante, internalizadas por outros macrófagos. A infecção para o hospedeiro invertebrado ocorre quando uma fêmea de flebotomíneo realiza o repasto sanguíneo em um indivíduo ou animal infectado, e ingere as formas amastigotas em macrófagos que acompanham o sangue e a linfa. O alimento, no intestino médio do inseto, é rapidamente envolvido por uma membrana quitinosa, secretada pelas células epiteliais do intestino, a matriz peritrófica. As alterações no ambiente, como a diminuição da temperatura e o aumento do pH, determinadas pela mudança de hospedeiro vertebrado para o intestino médio do inseto, desencadeiam a transformação morfológica do parasito. Então, no interior desta matriz, após cerca de 18-24 horas, as amastigotas se transformam em flagelados pequenos, ovoides, pouco móveis chamados de promastigotas procíclicas. Após aproximadamente 48-96 horas de multiplicação intensa, ocorre a transformação em formas promastigotas delgadas e longas. As moléculas de superfície de Leishmania, como LPG e gp63, entre outras, exercem papel importante nos eventos que se seguem. O LPG reveste o parasito de forma a protegê-lo da ação enzimática digestiva no interior da matriz peritrófica. Por outro lado, a gp63 com sua ação enzimática, auxilia na ruptura da matriz peritrófica, o que permite a liberação dos parasitos, antes que o bolo alimentar siga seu percurso intestinal. As formas liberadas, também por ação do LPG, ligam-se pelo flagelo às microvilosidades intestinais do inseto, garantindo a sua permanência e o desenvolvimento naquele local. Por volta de 3 a 5 dias o alimento é digerido e excretado. Neste tempo, já são encontradas formas flageladas migrantes na porção torácica do intestino médio. Esta migração é acompanhada pela transformação dos parasitos em: • Promastigotas curtas e largas livres na luz intestinal (haptomonas), • Formas flageladas arredondadas/ovalares (paramastigota), fixadas pelo flagelo à cutícula por meio de hemidesmossomos e • Formas infectantes, finas e curtas, com flagelo longo (promastigotas metacíclicas). Admite-se que o esgotamento de nutrientes, a digestão da hemoglobina e a eliminação de hemina, seguida da acidificação do meio estomacal sejam, provavelmente, fatores importantes na diferenciação das formas metacíclicas de Leishmania. A colonização de Leishmania, para algumas espécies, é restrita à porção média e anterior do intestino. Para outras, ocorre no triângulo posterior do intestino, onde os parasitos são encontrados aderidos à cutículada parede intestinal, através de hemidesmossomos, ou livres no lúmen, em processo de multiplicação. Em todas as espécies, os parasitos migram para as porções anteriores do aparelho digestivo do inseto comprometendo a válvula do estomodeu, onde algumas formas de desenvolvimento permanecem embebidas e imobilizadas por um gel produzido por si próprias, chamado PSG (promastigote secretory gel). Entretanto, as promastigotas metacíclicas estão livres para migrar ao longo do intestino anterior e alcançar a faringe, cibário e probócide, permitindo sua transmissão a outro hospedeiro vertebrado. Os danos causados à válvula do estomodeu pelos parasitos favorecem o refluxo e, consequente, inoculação e regurgitação de formas promastigotas durante o repasto sanguíneo do inseto. Para que a multiplicação dos parasitos tome o inseto capaz de transmitir a infecção, são necessários: • após o repasto sanguíneo, uma alimentação rica em açúcares, obtida geralmente de seiva de plantas e secreções de afídios, sem que ocorra infecção bacteriana patógena no trato intestinal do flebotomíneo concomitante com a presença de Leishmania; e • que o sangue do repasto infectante seja totalmente digerido antes de nova alimentação sanguínea. A suscetibilidade ou resistência dos flebotomíneos à infecção por Leishmania parece ser controlada, entre outros, por fatores genéticos, os quais restringem para algumas espécies de insetos a capacidade específica de transmissão de certas espécies do parasito. 3 2) Descrever os sintomas, modo de transmissão e tratamento. LEISHMANIOSE TEGUMENTAR Sintomas No início da infecção, as formas promastigotas são inoculadas na derme durante o repasto sanguíneo do flebotomíneo. As células destruídas pela probóscida do inseto e a saliva inoculada atraem para a área células fagocitárias mononucleares, os macrófagos e outras células da série branca. Papel importante é desempenhado pelo macrófago, célula especializada em identificar e destruir corpos estranhos, incluindo parasitos. Certos macrófagos são capazes de destruir os parasitos diretamente, enquanto outros necessitam ser estimulados. Somente macrófagos fixos (histiócitos) não estimulados são hábeis para o estabelecimento da infecção. Ao serem fagocitadas, as promastigotas transformam-se em amastigotas e iniciam reprodução por divisões binárias sucessivas; mais macrófagos são atraídos ao sítio, onde se fixam e são infectados. A lesão inicial é manifestada por um infiltrado inflamatório composto principalmente de linfócitos e de macrófagos na derme, estando estes últimos abarrotados de parasitos. Período d e Incubação Este período, que corresponde ao tempo decorrido entre a picada do inseto e o aparecimento de lesão inicial, varia entre 2 semanas e 3 meses, segundo observações feitas no Brasil. Evolução As lesões iniciais são semelhantes, independentemente da espécie do parasito. Esta forma inicial pode regredir espontaneamente após um breve curso abortivo, permanecer estacionária ou evoluir para um nódulo dérmico chamado “histiocitoma”, localizado sempre no sítio da picada do vetor infectado. O “histiocitoma” desenvolve-se em diferentes ritmos, dependendo da espécie de Leishmania envolvida. Nos estágios iniciais da infecção, histologicamente a lesão é caracterizada pela hipertrofia do extrato córneo e da papila, com acúmulo de histiócitos nos quais o parasito se multiplica. Gradualmente, forma-se um infiltrado celular circundando a lesão, consistindo principalmente de pequenos e grandes linfócitos, entre os quais alguns plasmócitos. Como resultado, forma-se no local uma reação inflamatória do tipo tuberculoide. Ocorre necrose resultando na desintegração da epiderme e da membrana basal que culmina com a formação de uma lesão ulcerocrostosa. Após a perda da crosta, observa-se uma pequena úlcera com bordas ligeiramente salientes e fundo granuloso. Esta lesão progride, desenvolvendo-se em uma típica úlcera leishmaniótica que, por seu aspecto morfológico, pode ser reconhecida imediatamente. Trata-se de uma úlcera de configuração circular, bordos altos (em moldura), cujo fundo é granuloso, de cor vermelha intensa, recoberto por exsudato seroso ou seropurulento, dependendo da presença de infecções secundárias. As lesões podem assumir, entretanto, outras formas menos características: seca e hipercerastósica, vegetativa framboesiforme, com exsudato seropurulento, lembrando a framboesia (bouba). Simultaneamente, ou em seguida ao aparecimento da lesão inicial, pode ocorrer disseminação linfática ou hematogênica, produzindo metástases cutânea, subcutânea ou mucosa. Seguido a um tratamento com sucesso, forma-se no local, em substituição à úlcera, uma cicatriz característica. Em geral a área cicatricial está despigmentada, com uma leve depressão na pele, com uma fibrose sob a epiderme, que está fina Um amplo espectro de formas clínicas pode ser visto na LTA, variando de uma lesão autorresolutiva a lesões desfigurantes. Esta variação está intimamente ligada ao estado imunológico do paciente e às espécies de Leishmania. Apesar da ampla variedade de formas clínicas encontrada em pacientes com LTA, podemos agrupá-las em três tipos básicos: leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose cutaneomucosa (LCM ) e leishmaniose cutânea difusa (LCD). • Leishmaniose Cutânea (LC): a leishmaniose cutânea é caracterizada pela formação de úlceras únicas ou múltiplas confinadas na derme, com a epiderme ulcerada. Resultam em úlceras leishmanióticas típicas, ou, então, evoluem para formas vegetantes verrucosas ou framboesiformes. A densidade de parasitos nos bordos da úlcera formada é grande nas fases iniciais da infecção, com tendência à escassez nas úlceras crônicas. A leishmaniose cutâneo-disseminada é uma variação da forma cutânea e geralmente está relacionada com pacientes imunossuprimidos (AIDS). • Leishmaniose Cutaneomucosa (LCM): esta forma clínica é conhecida por espúndia e nariz de tapir ou de anta. O agente etiológico é a L. braziliensis. O curso da infecção nas fases iniciais ocorre como já visto anteriormente na forma cutânea provocada por este parasito. Um dos aspectos mais típicos da doença causada pela L. braziliensis é a frequência com que o parasito produz, meses ou anos após a lesão inicial primária, lesões destrutivas secundárias envolvendo mucosas e cartilagens. Trata-se de um processo lento, de curso crônico. Estas lesões secundárias podem ocorrer por extensão direta de uma lesão primária ou então por disseminação hematogênica. Cerca de 70% dos casos com lesão de mucosa aparecem dentro dos primeiros 5 anos após a 4 lesão primária cutânea e 30% após 5 anos. A frequência com que as formas mucosas secundárias ocorrem no Brasil varia bastante. As regiões mais comumente afetadas pela disseminação metastásica são o nariz, a faringe, a boca e a laringe. O primeiro sinal de comprometimento mucoso manifesta-se por eritema e discreto infiltrado inflamatório no septo nasal, resultando em coriza constante e posteriormente em um processo ulcerativo. Atinge depois o vestíbulo, as asas do nariz, o assoalho da fossa nasal, o palato mole e a úvula, daí descendo para a faringe, podendo comprometer a laringe e a traqueia. A destruição do septo provoca mudança anatômica e aumento do órgão, que se constitui no chamado nariz de anta. Em muitos casos ocorre completa destruição de toda a estrutura cartilaginosa do nariz. O processo ulcerativo pode atingir os lábios e se propagar pela face. Estas graves mutilações podem causar no paciente dificuldades de respirar, falar e se alimentar. São frequentes, nesta fase, complicações respiratórias por infecções secundárias, podendo levar o paciente ao óbito. Trabalhos recentes demonstraram a presença do parasito na área cicatricial de antigas lesões tratadas de alguns pacientes. Isto pode explicar, em certos indivíduos, a ocorrência de metástases anos após o tratamento. • LeishmanioseCutânea Difusa (LCD): Caracteriza-se pela formação de lesões difusas não ulceradas por toda a pele, contendo grande número de uriastigotas. Esta forma clínica é provocada por parasitos do complexo mexicana pertencentes ao subgênero Leishmania, cujo agente etiológico é L. pifanoi, na Venezuela, e L. amazonensis, no Brasil. Esta entidade mórbida envolve amplas áreas da pele, particularmente extremidades e outras ? artes expostas, onde numerosas erupções papulares ou nodulares não ulceradas são vistas. O curso da infecção inicial processa-se, como visto anteriormente, com a formação de uma úlcera única. Não se sabe ao certo, mas cerca de 40% dos pacientes parasisados pela L. amazonensis desenvolvem a LCD. Não há dúvidas de que a multiplicidade de lesões não é causada relas repetidas picadas do vetor, mas sim pelo resultado de metástases do parasito de um sítio para outro através de vasos linfáticos ou migração de macrófagos parasitados. A LCD está estreitamente associada a uma deficiência imunológica do paciente deixando-o incapaz de montar -ma resposta inflamatória eficaz contra o parasito, em que a resposta imune celular está deprimida com relação i antígenos de Leishmania, levando-o a um estado de urergia imunológica frente à infecção estabelecida. Esses pacientes não respondem ao antígeno de Montenegro. A doença caracteriza-se por curso crônico e progressivo por : ada a vida do paciente, não respondendo aos tratamentos convencionais. Modo de transmissão A transmissão ocorre pela picada de insetos hematófagos pertencentes ao gênero Lutzomyia conhecidos no Brasil por birigui, mosquito-palha, cangalhinha e tatuquira, entre outros. Ao exercer o hematofagismo, a fêmea do flebotomíneo corta com suas mandíbulas o tecido subcutâneo logo abaixo da epiderme, formando sob esta um afluxo de sangue, onde são depositadas as formas promastigotas metacídicas provenientes da região anterior do trato digestório do inseto. Tratamento Atualmente, utiliza-se um antimonial pentavalente, antimoniato de N-metilglucamina. As drogas de primeira escolha no tratamento das leishmanioses de um modo geral são os antimoniais pentavalentes (Sb+5). Com o objetivo de padronizar o esquema terapêutico, a Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda que a dose deste antimonial seja calculada em g Sb+5/kg de peso do paciente/dia, havendo dois tipos de antimoniais pentavalentes que podem ser utilizados, o antimoniato de N-metilglucamina e o estibogluconato de sódio, sendo este último não comercializado no Brasil. O número de séries necessárias varia de acordo com o processo de cura da lesão. Recomenda-se a continuação do tratamento até a completa cicatrização da úlcera. A via de administração é geralmente intramuscular, também pode ser feita endovenosa ou local. A droga não deve ser utilizada em pacientes cardíacos e nem em mulheres grávidas, pois o antimônio pode provocar alterações eletrocardiográficas e também é abortivo. Este antimonial é indicado para o tratamento de todas as formas de leishmaniose tegumentar, embora as formas mucosas podendo apresentar respostas mais lentas e maior possibilidade de recidivas. As lesões ulceradas podem sofrer contaminação secundária. Alternativa de Tratamento para LTA Foi introduzida por Convit na Venezuela no tratamento de indivíduos com LTA. No Brasil, a imunoterapia vem sendo realizada em pacientes com LTA, em diferentes esquemas de tratamento, utilizando como antígeno uma vacina preparada para imunoprofilaxia obtendo excelentes resultados. Esta vacina representa uma alternativa na terapêutica de casos “resistentes” aos antimoniais ou com contraindicação ao seu uso, 5 como cardiopatas, nefropatas, mulheres grávidas, idosos etc. Também se mostra como uma medida de redução de custos, tanto diretos como indiretos, no tratamento da doença. Em 2002 o Ministério da Saúde aprovou o uso da Leishvacin® para o tratamento de LTA, mas, infelizmente a produção da vacina em escala comercial foi descontinuada, impossibilitando o emprego desta terapêutica em larga escala no país. LEISHMANIOSE VISCERAL Sintomas Leishmania i. chagasi é um parasito de células de SMF, principalmente do baço, do fígado, do linfonodo e da medula óssea. Entretanto, nas fases mais avançadas de doença são raros os órgãos onde não se encontra o parasito. A pele é a porta de entrada para a infecção. A inoculação das formas infectantes é acompanhada da saliva do inseto vetor, que é rica em substâncias com atividade inflamatória. Esta atividade é muito importante para o aumento de células fagocitárias neste local e crucial para a instalação da infecção. Alguns indivíduos podem desenvolver uma lesão no local do repasto sanguíneo do vetor, principalmente nas infecções por L. donovani. Quando ocorre, esta lesão é transitória e representada por reação inflamatória que determina a formação de um nódulo, o leishmanioma. No entanto, na infecção por L. i. chagasi, o local da inoculação dos parasitos normalmente é marcado por uma pequena reação inflamatória, atribuída principalmente aos componentes da saliva do inseto transmissor. O processo pode evoluir para a cura espontânea ou, a partir da pele ocorrer a migração dos parasitos, principalmente para linfonodos mais próximos, e em seguida para as vísceras. Nas vísceras, os parasitos induzem uma infiltração foca ou difusa de macrófagos não parasitados, além de infiltração de linfócitos e células plasmáticas, com focos de plasmocitogênese. As alterações mais particulares ocorrem no tecidos esplénico, hepático, sanguíneo, pulmonar e renal. A disseminação de Leishmania ocorre pelas vias hematogênica e linfática. Leishmania i. chagasi raramente tem sido encontrada no sangue periférico de humanos considerados imunocompetentes, no entanto, o encontro de parasitos no sangue é mais comum em reservatórios, como cães ou raposas. A patogenia da doença é determinada por múltiplos fatores que envolvem os hospedeiros e o parasito, entre outros são conhecidos os genéticos, determinantes e a suscetibilidade para a infecção e para a cura, e o estado imunológico e nutricional do indivíduo. Alterações Esplênicas Esplenomegalia é o achado mais importante e frequente no calazar. Na fase inicial da doença, a esplenomegalia pode não ocorrer ou ser pouco acentuada, mas na doença estabelecida e crônica torna-se uma característica invariável. Ao corte, o órgão apresenta superfície vermelha amarronzada e o tecido friável e congesto. Podem ser certificadas áreas de infarto. A cápsula é espessa e mostra áreas de inflamação. Ocorre hiperplasia e hipertrofia das células do SMF, os macrófagos e as células plasmáticas podem ser observados densamente parasitados, nas polpas branca e vermelha. Na polpa branca, no entanto, o parasito é menos intenso e há diminuição da população de células em áreas T dependentes. Alterações Hepáticas Hepatomegalia é outra característica marcante no calazar. O órgão mantém consistência firme e ocasionalmente mostra congestão passiva. Ocorre hiperplasia e hipertrofia das células de Kupffer, em geral densamente parasitadas, concomitantemente com a presença de infiltrado difuso, intraparenquimal, de células plasmáticas e linfócitos. Podem ser observadas fibroses septal e portal, leves ou moderadas, ao longo do infiltrado inflamatório. A deposição de material hialino, PAS positivo, no espaço de é um achado comum e associado ao espessamento reticular e áreas de fibrose intralobular (fibrose de Rogers), hiperplasia regenerativa nodular difusa tem sido relatada em casos de associação HIV/Leishmania. Estas alterações em possivelmente para a grave disproteinemia que ocorre em pacientes com calazar. Os baixos níveis de albumina associados a fatores vasculares locais podem levar à formação de edema dos membros inferiores. Alterações no Tecido Hemocitopoético A medula óssea é em geral encontrada com hiperplasia e densamente parasitada.A eritropoiese e a granulopoiese são normais no início do processo infeccioso. Durante as fases mais adiantadas da infecção, ocorre desregulação da 6 hematopoiese, caracterizada pela diminuição da produção celular com reflexo no quadro hematológico em períodos sucessivos: • hiperplasia no setor histiocitário; • hipoplasia setor formador de sangue e, por fim, • aplasia. A anemia, normalmente normocítica e normocrômica, apresenta uma alteração grave e importante nos indivíduos doentes. As contagens de eritrócitos nesses casos são muito baixas, geralmente entre 2 e 3 milhões/mm3 de sangue. Entre os mecanismos envolvidos na anemia estão a eritrofagocitose esplénica e a eritrólise, que podem ser imunologicamente mediadas. Na contagem diferencial de leucócitos é comum a ausência de eosinófilos e basófilos e, marcadamente reduzida, a presença de neutrófilos, caracterizando a leucopenia. A contagem absoluta de linfócitos e monócitos é usualmente baixa, porém, em termos percentuais, a contagem total é alta. As plaquetas também estão diminuídas nos quadros graves e letais, o que facilita a gênese de hemorragias. Verifica-se plasmocitose, embora no sangue periférico a ocorrência de níveis baixos de linfócitos B seja comum, provavelmente pelo sequestro destas células produtoras de imunoglobulinas nos órgãos linfoides. Alterações renais As formas amastigotas de Leishmania são raramente visualizadas nos rins, mesmo com a utilização de colorações mais específicas. A principal alteração renal está relacionada com a presença de imunocomplexos circulantes. Em muitos casos ocorre glomerulonefrite proliferativa e nefrite intersticial. A deposição de imunocomplexos, além do complemento e do fibrinogênio, na matriz mesangial determina um quadro de glomerulonefrite mesangioproliferativa. As lesões renais dão origem a distúrbios na função do órgão, tais como a perda de albumina na urina (albuminúria) que ocorre em cerca de 50% dos pacientes no Brasil, e elevados níveis de creatinina, ureia e hematúria registrados nos casos terminais. Após tratamento eficaz, estas alterações em geral são revertidas e o órgão retoma à sua função normal. Alterações dos Linfonodos Os linfonodos encontram-se geralmente aumentados. Ocorre reatividade nos centros germinativos dos folículos linfoides, reflexo do aumento na celularidade perifolicular. Na zona paracortical há depleção de células T e presença de plasmócitos e macrófagos parasitados. A presença destes plasmócitos explica, em parte, a hipergamaglobulinemia durante a infecção. Alterações Pulmonares Nos pulmões pode ser observada pneumonite intersticial com o espessamento dos septos pulmonares, em razão de tumefação endotelial e proliferação das células septais, às vezes com fibrose septal, e de linfócitos e células plasmáticas. As amastigotas são raras ou ausentes no pulmão. Estudos mostraram a associação entre a pneumonite intersticial e a presença de material antigênico de Leishmania nos septos alveolares. Como resultado do envolvimento pulmonar, os pacientes apresentam como principal sintoma a tosse seca. Em consequência desse quadro de pneumonia intersticial associada a infecções secundárias, o paciente pode desenvolver broncopneumonia, que é uma importante causa de óbito na doença. Alterações no Aparelho Digestivo Há, com frequência, excessiva proliferação de células do SMF, especialmente no jejuno e íleo, com presença de amastigotas. Ocorrem edema e alongamento das vilosidades, sem ocorrência de alterações na arquitetura da mucosa e dos vasos linfáticos. Alterações Cutâneas 7 As alterações cutâneas mais frequentes são descamação e queda de cabelos. Os parasitos podem, por vezes, ser encontrados na pele normal de pacientes infectados com L. i. chagasi. Nos locais onde o calazar é uma antroponose causada por L. donovani, como a índia e algumas regiões da África, os parasitos estão presentes em maior proporção na pele dos indivíduos infectados/doentes. Nesses países são relatados, ainda, casos de intenso parasitismo cutâneo, associado a lesões nodulares, a leishmaniose dérmica pós-calazar (LDPC). Quadro Clínico A doença pode ter desenvolvimento abrupto ou gradual. Os sinais clínicos sistêmicos típicos estão associados à febre intermitente, palidez de mucosas, esplenomegalia, presença ou não de hepatomegalia e progressivo emagrecimento com enfraquecimento geral do paciente. Na Tabela 10.2 são apresentados os principais sinais e sintomas, e a frequência com que eles ocorrem em crianças. A tosse não produtiva, a diarreia e a dor abdominal são queixas registradas na fase aguda da infecção. Com a evolução da doença, o paciente, pode apresentar progressivamente, anemia, epistaxe, hemorragia gengival. edema, icterícia e ascite, sendo que a anorexia e a desnutrição aumentam sua debilidade física. Nesses pacientes, o óbito pode ser decorrente do parasitismo, porém geralmente é determinado pelas hemorragias e infecções oportunistas intercorrentes. As hemorragias digestivas e a icterícia são sempre indicadoras de gravidade. A evolução clínica desfavorável de pacientes com leishmaniose visceral e o risco de morte estão associados a determinadas características do quadro clínico, como a idade, a ocorrência de hemorragias, a presença de comorbidades e as complicações decorrentes de infecções secundárias. Mediante a avaliação de fatores de risco, é possível identificar entre os pacientes com diagnóstico suspeito ou confirmado, os casos considerados graves ou que tenham maior probabilidade de evoluir para condição de gravidade. O Ministério da Saúde recomenda que em pacientes com idade entre 0,5-1 ano ou 50-65 anos os casos com: suspeita de infecção bacteriana, recidivas ou ações, quadros clínicos com presença de febre há JBES de 60 dias, diarreia, vômitos ou edema localizado, devem ser entendidos como motivo de alerta para a gravidade da doença. Os pacientes com menos de 6 meses ou mais de 65 anos de idade, com evidências de icterícia, fenômenos hemorrágicos, edema generalizado, sinais de anemia ou desnutrição grave, bem como o registro de qualquer comorbidade, inclusive infecção bacteriana, devem ser considerados como de alto risco para a evolução ao óbito. A doença abrupta tem se mostrado preocupante, principalmente em pacientes portadores de HIV, diabéticos e patologias crônicas que contribuem para que o óbito ocorra antes que os principais sinais clínicos e sintomas sejam desenvolvidos. A interação parasito/hospedeiro no calazar assume caráter espectral, de maneira que é possível resultar em diversas formas clinicas, que podem variar desde uma forma silenciosa assintomática, (também considerada subclínica ou oligossintomática), para uma forma aguda ou até a forma clínica de evolução clássica. Forma assintomática Os indivíduos podem desenvolver sintomatologias pouco específicas, que se manifestam por febre baixa recorrente, tosse seca, diarreia, sudorese, prostração e apresentar cura espontânea ou manter o parasito, sem nenhuma evolução clínica por toda a vida. O diagnóstico pode ser acidental ou epidemiológico. Acredita-se que esta represente a maior parcela da população infectada em área endêmica. O equilíbrio apresentado por estes indivíduos pode, entretanto, ser rompido pela desnutrição ou por um estado imunossupressivo, como na AIDS, ou pela infecção por HIV, por diabetes, tuberculose ou decorrente do uso de fármacos imunossupressores pós-transplante. Aparentemente esta ruptura no equilíbrio parasito/hospedeiro é induzida pela quebra da barreira funcional dos linfonodos acompanhada de aumento da prostaglandina E com elevação dos níveis de IL-10. Forma Aguda Corresponde ao período inicial da doença. Observam-se febre alta, palidez de mucosas e hepatoesplenomegalia discretas. A evolução em geral não ultrapassa 2 meses. Muitas vezes o paciente apresenta tosse e diarreia. Clinicamente, é confundidacom febre tifóide, malária, esquistossomose, doença de Chagas aguda, toxoplasmose aguda, histoplasmose, entre outras doenças febris agudas que apresentam hepatoesplenomegalia. Os pacientes apresentam altos títulos de IgG anti-Leishmania. O parasitismo é mais frequente no baço, no fígado e, menos intenso, na medula óssea. Forma Sintomática Crônica ou Calazar Clássico 8 Forma de evolução prolongada, também chamada período de estado, caracterizada por febre irregular e associada ao contínuo agravamento dos sintomas. O emagrecimento é progressivo e conduz o paciente para a desnutrição proteico- calórica, caquexia acentuada, mesmo com apetite preservado. A hepatoesplenomegalia associada à ascite determina o aumento do abdome. E comum edema generalizado, dispneia, cefaleia, dores musculares, perturbações digestivas, epistaxe e retardo da puberdade. Uma vez que o calazar é uma doença de caráter debilitante e imunossupressivo, as infecções bacterianas secundárias ou oportunistas são especialmente importantes na determinação do óbito. São infecções comuns: • Pneumonia e broncopneumonia, favorecidas provavelmente pelas alterações intersticiais pulmonares; • Tuberculose, de forma particularmente fulminante; • Diarreia e disenteria, principalmente como última complicação fatal. Embora amastigotas sejam encontradas nas lesões intestinais, a disenteria é geralmente atribuída à amebíase e/ou shigelose; • Otite média, gengivite, estomatite e cancrumoris; • Infecções concomitantes por plasmodium ou schistosoma, nas áreas onde há concomitância de distribuição destas endemias; A leishmaniose visceral é considerada infecção oportunista para indivíduos portadores de HIV ou com AIDS. Leishmaniose Dérmica Pós-calazar A leishmaniose dérmica pós-calazar (LDPC) é uma manifestação cutânea da leishmaniose atribuída à L. donovani, que ocorre após o tratamento da forma visceral. A LDPC se manifesta normalmente de 6 meses a 5 anos após a cura clínica do calazar acometendo crianças e adultos igualmente. No Sudão é comum ocorrer concomitantemente com a doença visceral. Provoca lesões da pele, que têm aparência variada e são caracterizadas pelo aparecimento de áreas com hipopigmentação, pápulas ou máculas e, às vezes, nódulos, localizados principalmente na face, no tronco e nos membros. Embora o parasitismo cutâneo seja intenso, a medula óssea e as vísceras geralmente estão negativas e não há febre ou outro sinal de envolvimento visceral. As lesões podem levar meses ou anos para desaparecerem e o tratamento pode ser prolongado. Do ponto de vista epidemiológico, os pacientes com LDPC participam do ciclo de transmissão, desempenhando papel importante, especialmente, durante os intervalos epidêmicos, quando contribuem para a manutenção do ciclo do parasito. A etiologia da LDPC é ainda incompreendida, mas há cada vez mais evidências que se trate, em grande parte, de um evento mediado pela resposta imune. A presença concomitante de lesões nodulares na pele de pacientes com leishmaniose visceral causada por L. infantum é rara, porém já foi descrita, em especial, nos pacientes coinfectados com HIV. incluindo alguns relatos de caso no Brasil. Modo de transmissão O principal mecanismo de transmissão de L. i. chagasi em condições naturais e de importância epidemiológica universal, ocorre por meio da picada da fêmea infectada de L. longipalpis. As formas promastigotas metacíclicas, movimentando-se livremente na probócide do vetor, são inoculadas no hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo. Em decorrência do intenso parasitismo, da secreção de proteofosfoglicanos pelas promastigotas (PSG - Promastigote Secretory Gel), e de enzimas produzidas pelos parasitos no intestino anterior do inseto, podem ocorrer bloqueio e lesão da válvula do estomodeu, provocando a regurgitação das promastigotas para a derme do hospedeiro vertebrado no momento da alimentação do flebotomíneo. Outros mecanismos devem ser considerados em condições especiais: • Uso de drogas injetáveis: o compartilhamento de seringas e agulhas contaminadas, durante o uso de drogas injetáveis, foi demonstrado como mecanismo hábil para a transmissão da leishmaniose visceral. • Transfusão sanguínea: embora seja pouco conhecida a real situação deste tipo de transmissão em todo o mundo, cerca de dez casos foram descritos na literatura. Entretanto, acredita-se que o número de casos de leishmaniose visceral por transfusão sanguínea possa ser maior. • Outros Mecanismos: o registro da doença em áreas consideradas livres do vetor chama a atenção para a existência de outros mecanismos de transmissão. As transmissões congênitas e venéreas de Leishmania já foram documentadas, tanto em cães como em humanos. Acredita-se que a transmissão congênita possa ocorrer por meio de células do SMF parasitadas que atravessariam a placenta ou durante o contato do sangue 9 materno com o neonato no momento do parto. A manipulação de formas do parasito em laboratório requer cuidados especiais de biossegurança para prevenir, principalmente, a autoinoculação acidental. Tratamento Quimioterapia - Tratamento Específico O arsenal terapêutico contra a leishmaniose visceral é limitado. Os antimoniais pentavalentes (Sb5+), antimoniato de N-metil glucamina (Glucantime®) e estibogluconato sódico (Pentostam®), são a primeira opção terapêutica na maioria dos países. No Brasil, o fármaco de escolha é o Glucantime®, que é de distribuição gratuita e controlada pela rede de saúde pública. O Ministério da Saúde recomenda a dose de 20 mg de Sb5+kg/dia, por via endovenosa ou intramuscular, obedecendo ao limite máximo diário de 2 a 3 ampolas do produto, durante 20 dias, ou no máximo por 40 dias. No Brasil, segundo o Ministério da Saúde, não existe documentação da presença de cepas de L. i. chagasi resistentes aos antimoniais, em testes in vitro. Em caso de recidiva é recomendado um segundo tratamento com a mesma dose. porém com duração mais prolongada (40 dias no máximo), antes de considerar o caso como refratário e utilizar esquemas terapêuticos alternativos. Neste caso, as formulações lipossomais de anfotericina B são os produtos indicados, com a recomendação de uso sob regime hospitalar. Vale ressaltar que, com exceção das situações descritas acima, o Ministério da Saúde continua indicando o uso de antimoniato de N-metil glucamina como primeira escolha para o tratamento da doença. Imunoquimioterapia Em algumas situações têm sido usadas, em pacientes : :m leishmaniose visceral aguda ou refratários aos antimoniais pentavalentes, substâncias imunorreguladoras, como rHINF-y (interferon gama humano recombinante) em associação aos antimoniais. Este tipo de abordagem terapêutica é ainda de alto custo, portanto seu uso tem sido restrito. Futuras perspectivas no tratamento da leishmaniose visceral envolvem o uso de citocinas recombinantes humanas, como o HGM-CSF (fator estimulador de colônias) e rHIL-12 (IL-12 humana recombinante), como adjuvantes na quimioterapia. 3) Interpretar resultados de diagnostico parasitológico e molecular. DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE LTA O diagnóstico clínico da LTA pode ser feito com base na característica da lesão que o paciente apresenta, associado à anamnese, na qual os dados epidemiológicos são de grande importância. Deve ser feito o diagnóstico diferencial de outras dermatoses granulomatosas que apresentam lesões semelhantes à LTA e que podem ser confundidas, como tuberculose cutânea, hanseníase, infecções por fungos (blastomicose e esporotricose), úlcera tropical e neoplasmas. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE LTA Pesquisa de Parasito A demonstração do parasito pode ser feita do material obtido da lesão existente por meio de: • Exame direto de esfregaços corados. Após anestesia local, podem-se fazer biópsia ou escarificação nos bordos da lesão. Retira-se um fragmento com o qual é feito esfregaço em lâmina poraposição. A avaliação exaustiva feita por um técnico microscopista bem treinado contribui para a melhora da sensibilidade do método. • Exame histopatológico. O fragmento de pele obtido pela biópsia é submetido a técnicas histológicas de rotina e exame por um experiente patologista. O encontro de amastigotas ou de um infiltrado inflamatório compatível pode definir ou sugerir o diagnóstico, respectivamente. • Cultura. Pode ser feita a cultura de fragmentos do tecido ou de aspirados dos bordos da lesão e de linfonodos infartados de áreas próximas a esta. Existem diversos meios apropriados para cultivos de Leishmania, e o meio NNN associado ao LIT (Liver Infusion Triptose) suplementado com soro fetal bovino e antibióticos é o mais utilizado, pois aumenta a probabilidade de isolamento do parasito. A cultura deve ser mantida por três repiques sucessivos com intervalo de 10 dias entre um e outro. O isolamento do parasito por meio de culturas de fragmentos das bordas das lesões pode aumentar a sensibilidade, mas são facilmente contaminadas pois 10 podem carrear um a grande quantidade de microrganismos que coabitam o local; desta forma, o inóculo em animais sensíveis como o hamster é mais indicado. • Inóculo em animais. O hamster é o animal mais utilizado para o isolamento de Leishmania. Inocula-se via intradérmica, no focinho ou patas, um triturado do fragmento com solução fisiológica. Este método fica limitado às instituições de pesquisa pelo alto custo da manutenção desses animais. Pesquisa do DNA do Parasito A PCR (reação em cadeia da polimerase) tem se mostrado como uma nova opção de diagnóstico de LTA, principalmente em função de sua grande sensibilidade. Assim sendo, busca-se suprir eventuais deficiências dos métodos que pesquisam a forma amastigota do parasito no material obtido da lesão. Recentes validações desta metodologia mostram que é possível detectar o agente etiológico e dependendo do protocolo utilizado é possível identificar a espécie do parasito. Teste de Montenegro O teste imunológico mais utilizado no Brasil tem sido o teste intradérmico de Montenegro (IDRM). Este teste avalia a reação de hipersensibilidade retardada do paciente e é utilizado para o diagnóstico ou para monitoramento de vacinação contra LTA em projetos de pesquisa. Sua sensibilidade varia entre 82,4 e 100% de acordo com os vários trabalhos realizados e esta variação pode ser atribuída a diferenças na preparação do antígeno utilizado. Vários antígenos podem ser empregados para o teste de Montenegro. Um antígeno que usa formas promastigotas mortas foi padronizado e oferece melhores resultados na concentração de 40 pg de nitrogênio por mililitro. O teste consiste no inóculo de 0,1 mL de antígeno pela via intradérmica na face interna do braço. No caso de testes positivos, verifica-se o estabelecimento de uma reação inflamatória local formando um nódulo ou pápula que atinge o auge em 48-72 horas, regredindo em seguida. Utiliza-se como padrão de positividade a presença de nódulo > 5 mm no local da inoculação do antígeno. Em áreas endêmicas a interpretação de IDRM positiva deve ser feita com cautela podendo indicar infecção sem a presença de sinais clínicos, leishmaniose anterior ou aplicação anterior do antígeno. A intensidade da reação varia bastante e na interpretação dos resultados devem ser observados os seguintes aspectos: • na forma cutânea simples da LTA, a reação inflamatória pode variar de acordo com a evolução da doença, sendo maior nas úlceras crônicas; • na forma mucosa da LTA, a reação inflamatória pode ser tão intensa a ponto de provocar flictemas e necrose, devido ao estado hiper-reativo do paciente; • na forma difusa da LTA, a resposta é usualmente negativa devido ao estado anérgico em que se encontra o paciente; • em pacientes tratados, instala-se uma imunidade celular duradoura, permanecendo o teste positivo durante muitos anos e, em alguns casos, indefinidamente. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) Entre os métodos sorológicos utilizados para o diagnóstico da LTA, a RIFI é o mais utilizado. Sua sensibilidade é relativamente alta, variando nos estudos realizados. Os títulos de anticorpos são normalmente baixos em casos com lesão cutânea recente, mas podem estar aumentados nas formas crônicas da doença, especialmente em casos de envolvimento mucoso. Como o teste não é espécie-específico, ocorrem reações cruzadas com outros tripanosomatídeos, dificultando o seu uso em áreas endêmicas onde ocorrem a doença de Chagas e a leishmaniose visceral. Os testes de hem aglutinação indireta e contra imunoeletroforese não se têm mostrado superiores à RIFI e nem tampouco acrescentado maiores informações para o diagnóstico da LTA. O teste de ELISA não está padronizado para a utilização comercial e tem sido usado apenas em laboratórios de pesquisa. Em algumas áreas onde há dificuldade na realização da pesquisa do parasito, o diagnóstico pode ser feito com base na avaliação clínico-epidemiológica associada ao teste de Montenegro. Chamamos a atenção de alguns casos em que não se consegue demonstrar o parasito e, na ausência de diagnóstico imunológico. deve ser feito o tratamento de prova. DIAGNÓSTICO DE LVA 11 A rotina do diagnóstico da leishmaniose visceral baseia-se nos sinais clínicos e sintomas, em parâmetros epidemiológicos, achados hematológicos e bioquímicos, e na detecção de anticorpos anti-Leishmania. A confirmação do diagnóstico é realizada pelo encontro do parasito em amostras biológicas do paciente. A associação de métodos moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR). que amplificam sequências específicas do DNA do parasito, tem permitido melhor sensibilidade, qualidade e rapidez ao diagnóstico. DIAGNÓSTICO CLÍNICO LVA Baseia-se nos sinais clínicos e sintomas apresentados pelos pacientes associados à história de residência em área endêmica. Entretanto, é preciso atenção especial para outras doenças que apresentam sintomatologia semelhante, como malária, toxoplasmose, brucelose, tuberculose e esquistossomose, principalmente em áreas onde ocorre superposição na distribuição das doenças. Nos pacientes com AIDS, portadores do vírus HIV, de doenças malignas como linfomas e lúpus eritematoso sistêmico, de doenças crônicas como diabetes, e naqueles submetidos a transplantes de órgãos em uso de fármacos contra a rejeição, os sinais e sintomas do calazar podem ser alterados, de forma que as manifestações clínicas não mantenham as suas características. Em particular, nos pacientes com AIDS, os sintomas mais relatados são as lesões de pele, manifestações hemorrágicas gastrointestinais e respiratórias, por vezes, na completa ausência de febre e esplenomegalia. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL LVA Pesquisa do Parasito O diagnóstico parasitológico baseia-se na observação direta do parasito em preparações de material obtido de aspirado de medula óssea, baço, fígado e linfonodo. mediante a confecção de esfregaços em lâmina de vidro, corados pelo Giemsa ou Panótico Rápido®, isolamento em meio de cultura NNN (Novy, Nicolle e McNeal) LIT (Liver Infusion Tryptose), NNN/LIT, Schneider (Schneider’s Insect Medium), dentre outros, ou inoculação em animais de laboratório (hamster e camundongos como BALB/c). Quando obtidos por biópsia, podem ser elaborados cortes histológicos de fragmentos dos órgãos para a pesquisa do parasito por meio de análise imuno-histoquímica ou histo-patológica convencional. A punção de medula óssea é considerada uma técnica simples que representa pouco risco para o paciente. No adulto, é realizada no osso do esterno, no nível do segundo espaço intercostal, e como segunda escolha na crista ilíaca. Em crianças menores de 2 anos, recomenda-se a superfície medial da diáfise proximal da tíbia. A sensibilidade da técnica encontra-se em tomo de 60-70%. O cultivo do conteúdo do aspirado pode melhorar esta sensibilidadee dar maior segurança para o diagnóstico, entretanto raramente é usado na rotina da prática clínica, pois a multiplicação dos parasitos pode levar dias ou semanas. A biópsia hepática oferece resultados questionáveis, em virtude da menor densidade de parasitos no órgão. Embora a punção aspirativa esplénica seja o método que oferece maior sensibilidade (90-98%), a natureza da técnica proporciona riscos ao paciente, podendo levar à ruptura do órgão e a hemorragias fatais. Por serem métodos de risco e invasivos, tendem a ser substituídos. A pesquisa de sequências específicas do DNA de leishmania em amostras biológicas pela PCR está disponibilizada na prática da patologia clínica para o diagnóstico de leishmaniose visceral, em diferentes centros. Com base em alta sensibilidade e especificidade da técnica, seu uso é possível em grande variedade e pequena quantidade de material biológico incluindo sangue periférico, o que torna o diagnóstico menos dependente de intervenções invasivas. Métodos Imunológicos Uma característica marcante do calazar é a presença de hipergamaglobulinemia, decorrente da expansão policlonal de linfócitos B, que caracteriza a resposta imune adaptativa, com grande produção de anticorpos inespecíficos, principalmente IgG e IgM. Os altos níveis de anticorpos produzidos pelos pacientes permitem a aplicação de uma variedade de técnicas sorológicas para o diagnóstico. Os testes apresentam sensibilidade e especificidade variáveis, entretanto devem ser a 12 escolha imediata diante de suspeita clínica da doença, principalmente, por serem menos invasivos e apresentarem menor risco para o paciente. Sua aplicação no diagnóstico em pacientes imunossuprimidos requer cuidado na interpretação de resultados. Devido à ausência de clones de linfócitos T, capazes de determinar a estimulação de linfócitos B e dependendo do momento da infecção, o paciente imunossuprimido pode não apresentar títulos de anticorpos e, consequentemente, os resultados podem ser conflitantes ou duvidosos. O diagnóstico sorológico pode, em algumas circunstâncias, ser aplicado no controle da resposta terapêutica. Entretanto, como controle de cura, os resultados devem ser cuidadosamente analisados e interpretados. As técnicas sorológicas aplicadas podem ser inespecíficas. só avaliando a presença da hipergamaglobulinemia, como a reação de formol-gel, que mostra como resultado a precipitação e a gelificação das proteínas do soro de pacientes, quando em contato com o formaldeído. Porém, os testes que identificam IgG, suas frações e IgM, dirigidos contra o parasito, são os mais utilizados. No Brasil, as técnicas disponibilizadas nos Lacens (Laboratório Central de Saúde Pública do Estado) para pesquisa de anticorpos anti-Leishmania são a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o teste rápido imunocromatográfico. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) Utiliza como antígeno formas promastigotas fixadas em lâmina. Trata-se de método de simples execução e que apresenta uma sensibilidade alta na detecção de casos de leishmaniose visceral, porém apresenta reações cruzadas com outros tripanosomatídeos causadores de infecção humana, como leishmaniose tegumentar e doença de Chagas, além de malária, esquistossomose e tuberculose pulmonar. A reação cruzada representa uma das principais limitações da técnica. Entretanto, no calazar, os títulos de anticorpos são muito mais altos durante a doença. E o teste mais usado, inclusive na avaliação da resposta à terapêutica. Para o diagnóstico humano, reações positivas, em diluição igual ou superior a 1:80, são considerados resultados confirmatórios para leishmaniose visceral, desde que excluídos outros diagnósticos. Teste Rápido Imunocromatográfico Trata-se de métodos sensíveis, específicos, de rápida execução (5-10 min) e interpretação visual das reações, o que possibilita seu emprego em condições de campo. Baseiam-se na avaliação de pequeno volume da amostra sanguínea, de plasma ou de soro de paciente suspeito por meio de plataformas imunocromatográfícas. Os testes rápidos recomendados pelo Ministério da Saúde para o diagnóstico da leishmaniose visceral no Brasil (TRALd®, IT-LEISH®, Kala- Azar Detect®) utilizam antígeno recombinante como o rK39, o qual reconhece anticorpos específicos anti-Leishmania do complexo donovani. O acréscimo de outro antígeno recombinante (rK26) ao teste TRALd proporcionou aumento da sensibilidade, permitindo o diagnóstico de indivíduos assintomáticos, não reagentes ao rK39. A adoção de teste rápido imunocromatográfico rK39 pelo Ministério da Saúde tem contribuído para a redução da letalidade mediante o diagnóstico e o tratamento precoce dos casos. Como o resultado positivo em testes imunocromatográficos que utilizam antígenos recombinantes é considerado confirmatório, permite para os casos clinicamente suspeitos o início imediato do tratamento. Entretanto, a recomendação para os serviços de saúde é, quando possível, de usá-lo em conjunto com outras técnicas diagnosticas. Ensaio Imunoenzimático (ELISA) Trata-se de metodologia que permite o processamento de grande número de amostras em curto espaço de tempo. Os antígenos utilizados são solúveis e o teste apresenta alta sensibilidade na detecção de casos de calazar. Contudo, podem mostrar reações cruzadas com outros tripanosomatídeos. Este problema é solucionado com o emprego de antígenos purificados e recombinantes. Dentre os antígenos purificados, as proteínas de superfície presentes na membrana do parasito apresentam grande perspectiva de uso, como recombinantes ou peptídeos sintéticos. Algumas variações do teste são utilizadas na pesquisa de anticorpos e/ou antígenos do parasito, dentre elas, o DOT-ELISA, o FAST-ELISA e ELISA-FML. Métodos Moleculares Diversas técnicas permitem o diagnóstico molecular a partir da amplificação de sequências específicas do DNA do parasito extraído das mais distintas amostras biológicas provenientes do paciente: como aspirados de medula óssea, 13 baço ou linfonodos, fragmentos de pele ou mucosa, sangue periférico total, sangue coletado em papel-filtro, tecido incluído em parafina e outras. Apresentando alta sensibilidade e especificidade, a PCR, que amplifica sequências do DNA presente no cinetoplasto do parasito, é a metodologia mais empregada no diagnóstico, sendo possível seu uso no monitoramento terapêutico e em estudos epidemiológicos. A PCR quantitativa em tempo real (qPCR) é uma técnica recente que permite o contínuo monitoramento da amplificação de sequências de DNA do parasito, enquanto a reação ocorre. Com isto, obtém-se com precisão e reprodutibilidade o número de cópias da sequência-alvo, e consequentemente a carga parasitária presente em determinada amostra. Há ainda, a disponibilidade de outras técnicas como métodos de hibridização de DNA e a reação em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (RT-PCR) para detecção de RNA. Outros Testes Considerando o aumento das globulinas, associado à perda de albumina que ocorre no calazar, a relação albumina/globulina pode ser acompanhada por meio da eletroforese de proteínas séricas. A curva do teste tende a se reverter para a normalidade diante da boa resposta à terapêutica específica. Entretanto, por ser inespecífica, a análise da relação albumina/globulina sérica deve ser feita em conjunto com outras técnicas diagnosticas, como a sorologia. A intradermorreação de Montenegro, também conhecida por leishmanina ou teste de Montenegro, mede a imunidade mediada por células (Capítulo 8). O fato de ser sempre negativa durante o período de estado da doença impede seu uso no diagnóstico. Após a cura terapêutica, cerca de 6 meses a 3 anos, o teste toma-se positivo.
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