Enzimas: Conceitos e Aplicações

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Amilase e Invertase: conceitos e aplicações Industriais
Ismael Alves
Mariana Martins 
Marina Loures
Micaele de Oliveira
Novembro-2016
Introdução
Enzimas são proteínas produzidas por todos os organismos vivos. 
Elas aceleram as reações químicas de forma seletiva como parte do processo essencial da vida, tais como digestão, respiração, metabolismo e manutenção de tecidos.
 
Em outras palavras, são catalisadores biológicos altamente específicos. 
Introdução
Enzimas estão presentes no nosso dia a dia 
Introdução
Aplicações de enzimas na produção de alimentos
AMILASE
Amilase
O amido é um polímero constituído por moléculas de glicose. Dois polissacarídeos compõem a estrutura do amido: amilose e amilopectina.
Para que a hidrólise do amido seja completa faz-se necessária a atuação de várias enzimas pertencentes ao grupo das amilases.
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Amilase
As amilases são enzimas capazes de hidrolisar as moléculas de amido, resultando em oligossacarídeos de diferentes tamanhos, como as dextrinas e maltoses.
Por catalisar reações de hidrólise, as amilases são classificadas como hidrolases. 
Conforme o seu modo de ação, as enzimas amilolíticas podem ser divididas em duas grandes categorias: 
Amilase
Endoamilases
Exoamilases
Hidrolisam ligações do tipo α -1,4 de uma maneira aleatória, no interior da molécula de amido. Formam oligossacarídeos ramificados e lineares de vários comprimentos de cadeias
Hidrolisam, sucessivamente, ligações glicosídicas a partir da extremidade não redutora das mesmas, resultando em produtos finais pequenos
As principais amilases são:
α- Amilases 
Também chamadas de enzimas dextrinizantes;
Correspondem a endoamilases;
Formam maltose, glicose e dextrina;
Mais importante e utilizada na indústria;
É induzida na presença de amido ou maltose.
Amilase
β-Amilases:
São exoamilases;
Formam maltose;
Esse tipo de amilase está distribuído nos tecidos das plantas onde hidrolisa amido em β-maltose, sendo particularmente abundante em soja, trigo e cevada, principalmente durante a germinação. 
Amilase
Glicoamilases:
Também chamadas de enzimas de sacarificação, elas são capazes de hidrolisar completamente o amido em incubações por longos períodos;
São exoamilases que rompem as ligações α-1,4 e α-1,6 (em menor velocidade);
Formam glicose. 
Amilase
Obtidas de plantas, animais e microrganismos. 
Existem amilases que além de serem termoestáveis, são estáveis a pH alcalinos e outras que são estáveis a pH ácidos, ambas possuem aplicabilidade industrial.
As amilases acidófilas são utilizadas principalmente na indústria de amido, onde o pH natural da suspensão de amido é em torno de 4,5.
Amilase
Amilase
Enzimas provenientes de plantas utilizadas na fabricação de alimentos
Enzimas derivadas de microorganismos e utilizadas na fabricação de alimentos
As enzimas obtidas por microrganismos termofílicos apresentam características mais termoestáveis permitindo que os processos biotecnológicos sejam conduzidos em elevadas temperaturas.
As bactérias termofílicas do gênero Bacillus se destacam pela capacidade de produzir amilase.
Amilase
Gênero Bacillus (família Bacillaceae):
São bacilos gram-positivos aeróbicos;
Grande variedade nas condições fisiológicas (temperatura, pH e salinidade), sendo capazes de crescer sob condições extremas de temperatura e pH;
São saprófitos inofensivos, que não produzem toxinas e são considerados GRAS.
Amilase
Amilase
Introdução
Enzimas obtidas do gênero Alicyclobacillus  diversas aplicações industriais  características termoestáveis.
As amilases hidrolisam as ligações glicosídicas α-1,4  ¼ do mercado das enzimas industriais.
Necessidade de um meio de obtenção economicamente viável.
Técnicas de imobilização celular têm sido utilizadas em processos biotecnológicos:
gel de aprisionamento;
adsorção; e
ligação covalente.
Introdução
Vantagens da imobilização:
uso repetido e prolongado das células;
reduzido risco de contaminação;
fermentação contínua; e
facilidade de separação.
Obejtivo
Este trabalho teve como objetivo a produção de amilase e colagenase, obtidas de Alicyclobacillus acidocaldarius e Alicyclobacillus sendaiensis, respectivamente, assim como a imobilização desses microrganismos, visando otimizar sua capacidade de produção enzimática.
Materiais e Métodos
O microrganismo A. acidocaldarius CBMAI 0298 foi reativado e cultivado em meio BAT, pH 4,0 a 60 ºC  microrganismos liofilizados.
Para o preparo do pré-inóculo
30 mg de células liofilizadas +100 mL de meio de cultivo  incubadas por 24 h a 150 rpm.
As células foram centrifugadas a 9000 rpm por 10 min a 4 °C, lavadas em solução salina 0,9% e transferidas para o meio BAT contendo 1% de substrato farelo de trigo a 60 °C.
Após o cultivo, o meio foi centrifugado e o sobrenadante, livre de células, utilizado para os ensaios de atividade enzimática.
A atividade enzimática foi avaliada pela determinação de açúcares redutores. A reação consistiu na incubação de 250 μL de substrato (amido de batata solúvel 1% em tampão McIlvaine pH 3,0), e 250 μL de extrato enzimático, a 75 ºC por 30 min.
U = a quantidade de enzima que produziu 1 μmol de açúcar redutor (glicose) por minuto.
Materiais e Métodos
Para aprimorar a produção das enzimas, os microrganismos foram imobilizados em diferentes matrizes:
Para a imobilização em esponja vegetal, três discos de esponja vegetal foram adicionados ao meio contendo o microrganismo reativado e submetidos à incubação por 72 h e 150 rpm.
Para imobilização em alginato-esponja, as células foram retiradas do meio por centrifugação após cultivo de 4 dias, ressuspensas em 5 mL de solução de NaCl 0,9% e adicionadas a 50 mL de solução de alginato 3% (p/v), formando a mistura alginato-célula. Três discos de esponjas estéreis foram imersos, transferidos para uma solução de CaCl2 1,47% (p/v), e mantidos em leve agitação por 15 min.
Para a imobilização em alginato sem a esponja, após obtenção da mistura alginato-célula, foi realizado o gotejamento em 100 mL de solução de CaCl2, ocorrendo a formação de esferas de gel.
Materiais e Métodos
Após estes procedimentos, as matrizes foram lavadas em solução de NaCl 0,9% (p/v), transferidas para o meio de produção das enzimas e incubados por 48 h. A produção também foi avaliada pela biomassa livre submetida aos mesmos tratamentos.
Após cultivo em meio de produção, os extratos enzimáticos foram obtidos por centrifugação e submetido ao sistema de ultrafiltração em membrana de 30 kDa.
O extrato foi concentrado 2 vezes (v:v) e a atividade enzimática foi avaliada. Os resultados foram comparados com os ensaios sem o uso da ultrafiltração.
Resultados e Discussão
Conclusões
Foi possível a produção de amilase por A. acidocaldarius, utilizando subproduto industrial, contribuindo como meio economicamente viável para a indústria.
O uso da imobilização propiciou aumento na atividade enzimática para amilase, quando do emprego da esponja vegetal.
O emprego do sistema de ultrafiltração foi favorável, sendo possível candidato para uso em preparações enzimáticas industriais na hidrólise do amido.
Invertase
Invertase 
 
β-frutofuranosidase mais conhecida como invertase;
É uma hidrolase muito utilizada na indústria de alimentos;
 Sua natureza química consiste em uma glicoproteina;
A invertase está classificada na família GH32;
 Possui uma elevada atividade no intervalo de pH 3.5-5.5 com um pH ótimo em 4.5 e um máximo de atividade a aproximadamente 60ºC (termoestável).
Figura 1: estrutura da Invertase. 
Fonte: DIAS et al, 2010.
Invertase
As invertases catalisam a hidrólise da ligação glicosídica da molécula de sacarose produzindo uma solução equimolar de frutose e glicose;
Produto formado resulta em uma mistura conhecida como açúcar invertido;
Alto poder edulcorante, cerca de 40% superior ao da sacarose (presença de frutose);
Lenta cristalização: melhora na textura dos alimentos.Invertase
Devido a este poder edulcorante, o açúcar invertido é bastante utilizado no ramo alimentício, especialmente na preparação de geléias, balas, doces e xaropes.
Figura 2: Xarope de açúcar Invertido
Figura 3: Geléia
Figura 4: Balas
Fonte: Umcomo, 2016. Disponível em: http://comida.umcomo.com.br/receita/como-fazer-acucar-invertido-12236.html. Acesso em 27 nov 2016.
Fonte: Cybercook, 2016. Disponível em: http://www.cybercook.com.br/receita-de-geleia-de-morango-facil-r-7-8086.html. Acesso: 27 nov 2016.
Fonte: Eleko, 2016. Disponível em: http://elekomulheresguerreiras.blogspot.com.br/2012/09/sao-cosme-mandou-fazer-duas-camisinhas.html. Acesso: 27 nov 2016.
Invertase
Produzida por microrganismos: Saccharomyces cerevisiae;
Fator limitante: o elevado custo da enzima. Porém um alto grau de hidrólise pode ser obtido originando um produto de alta qualidade, com baixos teores de cinzas, e incolor.
Figura 5: Saccharomyces cerevisiae
Fonte: Microbewiki,2016. Diponpivel em: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Saccharomyces_cerevisiae_NEU2011. Acesso: 27 nov 2016.
Invertase 
A atividade da invertase pode ser medida por polarimetria, dosagem de açúcares redutores; ou por espectrofotometria, dosando glicose com a ajuda do reagente usando DNS.
Invertase:libera glicose (açúcar redutor)
DNS em presença de glicose sofre redução e fica laranja
Espectrofotometria: concentração de glicose através da absorbância
Invertase
Um dos métodos mais utilizados para produção de invertase é através de fermentação em estado sólido;
Simplicidade de operação;
Aproximação do crescimento natural de muitos microrganismos, principalmente fungos;
Possibilidade de utilização de substratos oriundos da agricultura ou subprodutos da agroindústria;
Redução dos custos da enzima.
Invertase – Aplicações na Indústria
Atualmente o açúcar invertido possui diversas aplicações na indústria de alimentos e bebidas podendo também, em alguns casos, ser utilizado diretamente como adoçante de mesa
Invertase – Aplicações na Indústria
Principais aplicações do Açúcar Invertido (produto da ação da Invertase):
Indústria Alimentícia
Fabricação de Confeitos
Panificação
Criação de Cremes para Recheio
Geléias
Refrigerantes
Invertase – Aplicações na Indústria
	O produto de maior interesse comercial é aquele com nível de inversão próximo a 55%, pois nessa faixa a solubilidade é máxima possibilitando trabalhar com concentrações em torno de 76,5% de sólidos solúveis, diminuindo assim a susceptibilidade à contaminação microbiana, sem riscos de cristalização.
Invertase – Aplicações na Indústria
	Além da fabricação do açúcar invertido, a invertase possui outras aplicações na indústria alimentícia, tais como:
Invertase
Produção de Mel de Sacarose;
Fabricação de Licores;
Obstrução da cristalização do açúcar na fabricação de sorvetes;
Fabricação de Produtos de Higiene Bucal;
Produção de Frutose Cristalina;
Invertase – Artigo 
Introdução
Dificuldades: 
Alto custo de produção;
Instabilidade (ph e temperatura);
Mudanças conformacionais resultantes de choques mecânicos e pressão osmótica;
Dificuldade de recuperação do biocatalisador  processo enzimático torna-se mais caro.
Introdução
Principais Vantagens:
Aumento da sustentabilidade;
Aumento da rentabilidade;
Automação de processos;
Resíduos Industriais: baixo custo de aquisição e alta disponibilidade
Introdução
Imobilização de enzimas surge como uma estratégia promissora que objetiva melhorar as propriedades físicocinética da enzima concomitante à redução de custos.
Objetivo
	Obter açúcar invertido usando o derivado pó de sabugo de milho glutaraldeído-invertase em reator de leito fixo.
Material e Métodos
Saccharomices cerevisiae: fonte de invertase;
Enzima foi imobilizada em pó de sabugo de milho e comparada com a enzima solúvel;
Enzimas passaram por diversos testes;
Ao final dos experimentos foi realizado o teste de reuso, somente com derivado enzimático (enzimas imobilizadas).
Resultados e Conclusão
	A invertase foi imobilizada com sucesso em pó de sabugo de milho, sendo que para sua aplicação mais sustentável em escala industrial o acidulante mais adequado seria o ácido cítrico1M porque é menos oneroso economicamente e apresentou as melhores atividades, excetuando àquelas obtidas com o acetato de sódio 0,05 M. Podemos afirmar, com base neste estudo, que o reuso de enzimas imobilizadas seria uma ótima maneira de redução de custos, já que houve manutenção de 80% de atividade mesmo após 10 ciclos de reuso.
Referências
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 DIAS, Angelo et al. Caracterização Cinética da Enzima Invertase. Instituto Superior Técnico, Lisboa, 2009.
Enzimas: natureza e ação nos alimentos. Disponível em:<http://www.revista-fi.com/materias/166.pdf> Acessado em: 14/11/2016
Portal educação. Disponível em:<https://www.portaleducacao.com.br/medicina/artigos/10953/amilases > Acessado em: 14/11/2016
RUIZ, S. P et al. Biossíntese de enzimas industriais por Alicyclobacillus livres e imobilizados em diferentes matrizes e o emprego da ultrafiltração na concentração das enzimas. XII Seminário Brasileiro de Tecnologia Enzimática, 2016.
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TORALLES, Ricardo Peraça et al. EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE INVERTASE DE LEVEDURA DE PURÊ E RESÍDUO DE PÊSSEGO. Revista Brasileira de Tecnologia Agroindustrial, [s.l.], v. 8, n. 2, p.1399-1415, 22 jun. 2014. Universidade Tecnologica Federal do Parana (UTFPR).
TANIGUCHI, Elen et al. AN 02. Avaliação da imobilização de invertase em resíduo agroindustrial para aplicação em reatores enzimáticos de alta taxa. Journal of Basic and Applied Pharmaceutical Sciencies, v. 36, n. 1, 2015.
DA SILVA ALMEIDA, Édipo et al. UMA BREVE REVISÃO SISTEMÁTICA DA LITERATURA SOBRE A PRODUÇÃO DE INVERTASE POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO. Revista Saúde & Ciência Online, v. 3, n. 3, p. 94-106, 2014.
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