Atividade da Polifenoloxidase em Vegetais

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Laboratório de Química e Bioquímica Vegetal - LQBV 
 
Método adaptado em 20/08/2017 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS 
Departamento de Química e Bioquímica 
Análises Químicas e Bioquímicas em vegetais 
Eng. Agrônomo Me. Gean Charles Monteiro 
Profᵃ. Drᵃ. Giuseppina Pace Pereira Lima 
Atividade da Polifenoloxidase (PPO) 
 
1. INTRODUÇÃO 
As polifenoloxidases (PPO ou PFO – EC 1.10.3.1) são enzimas que promovem a 
oxidação enzimática de compostos fenólicos, produzindo, inicialmente, quinona que 
rapidamente se condensa, formando pigmentos insolúveis e escuros, denominada 
melanina, ou reagem não-enzimaticamente com aminoácidos, proteínas ou outros 
compostos. A polifenoloxidase, geralmente é elevada em tecidos infectados ou com 
danos, apresentando grande importância para as plantas, com envolvimento nos 
mecanismos de defesa e/ou senescência. A determinação da atividade dessa enzima 
também tem importância para a tecnologia de alimentos, uma vez que a continuidade da 
atividade enzimática pode ocasionar mudança na qualidade do produto, geralmente essa 
enzima é conhecida, juntamente com a Peroxidase (POD), como enzima do 
escurecimento enzimático. 
 
2. MÉTODO 
2.1. Reagentes e soluções 
A) Solução extratora: Tampão fosfato de potássio pH 6,7 a 0,2M 
 
1° - KH2PO4 monobásico (solução ácida); 
 
Peso molecular: 136,09 g pH 5 
1 molar → 136,09 g 
0,2 M → X 
X = 27,218 g para 1.000 mL de água deionizada 
 
Para preparar 100 mL: 
27,218 g → 1.000 mL 
X → 100 mL 
X = 2,72 g para 100 mL de água deionizada 
 
2° - K2HPO4 dibásico (solução básica): 
 
Peso molecular: 174,18 g pH 9 
1 molar → 174,18 g 
0,2 M → X 
X = 34,836 g para 1.000 mL de água deionizada 
 
Para preparar 100 mL: 
34,836 g → 1.000 mL 
X → 100 mL 
X = 3,4836 g para 100 mL de água deionizada 
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Método adaptado em 20/08/2017 
 
✓ Para ajustar a solução a um pH mais ácido, coloca-se solução básica sobre a solução 
ácida, ajustando assim, o pH ácido; 
✓ Para ajustar a solução a um pH mais básico, coloca-se solução ácida sobre a solução 
básica, ajustando assim, o pH para básico; 
✓ Para ajustar o pH a 6,7 coloca a solução ácida (monobásico) em béquer e acerta o pH 
com a solução básica (dibásico) até chegar ao valor 6,7; 
✓ Guardar em ambiente refrigerado. 
 
B) Catecol a 0,1M 
 
- Catecol (Pirocatecol); 
- Solução tampão de potássio pH 6,7 a 0,2M. 
Obs: O Pirocatecol se guarda refrigerado (durabilidade de 48 horas). 
 
1 molar → 110 g 
0,1 M → X 
X = 11 g para 1.000 mL de solução tampão de potássio pH 6,7 a 0,2M 
 
Para preparar 50 mL: 
11 g → 1.000 mL 
X → 50 mL 
X = 0,55 g para 50 mL de solução tampão de potássio pH 6,7 a 0,2M 
 
C) Ácido perclórico 
 
- Ácido perclórico (HClO4) 2N. 
Coloque primeiramente boa parte da água deionizada e após lentamente o ácido 
perclórico, após complete com água deionizada. Não é necessária a refrigeração. 
Obs: Ácido perclórico (HClO4) pode causar queimações na pele, se recomenda o uso de 
luvas e jaleco (Fazer o procedimento em capela). 
 
C1 . V1 = C2 . V2 
2N . 100mL = 11,7N . X 
X = 170,94 mL para 1 L de água deionizada 
 
170,94 mL → 1000 mL 
 X → 100 mL 
X = 17,094 mL para 100 mL de água deionizada 
 
2.2. Ensaio 
 
Extração: 
Para a extração recomenda-se a utilização de material fresco e congelado com 
nitrogênio líquido. 
- Macerar a amostra em nitrogênio líquido; 
- Pesar 500 mg da amostra e anotar o peso; 
- Colocar em tubo de plástico para centrifugar e adicionar 5 mL da solução tampão de 
fosfato de potássio pH 6,7 a 0,2M; 
- Centrifugar a 6.000 a 10.000 rpm por 5-10 minutos em centrífuga refrigerada a 5 °C; 
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- Retirar o sobrenadante e adicionar em vidros pequenos e manter a amostra gelada. 
- Recomenda-se fazer todo processo da metodologia no escuro ou com luzes especiais, 
para que não aja perda de atividade enzimática. 
Obs: O mesmo extrato pode ser usado para analisar a atividade enzimática da Peroxidase 
(POD) e proteína solúvel, para isso aumente de 5 para 8 mL do extrator (tampão de fosfato 
de potássio pH 6,7 a 0,2M) no momento da extração. 
 
Reação: 
 Em tubos de ensaio pipetar da seguinte maneira: 
 
 
 
 
 
 
 
- Levar os tubos de ensaio para o banho-maria a 30 °C por 30 minutos; 
- Ao final desse tempo, adicionar 0,8 mL de ácido perclórico para parar a reação e 
agitar; 
- Leitura a 395 nm (Espectrofotômetro). 
- Se a leitura for negativa no Branco da Amostra não é necessário fazer o mesmo. 
Obs: Leitura em cubetas de vidro (G). 
 
2.3. Cálculo 
 
PPO =_____(Leitura/30)*1000____ 
 Peso do volume da amostra 
 
Onde: 
 - Leitura: (Leitura amostra – Leitura do branco da amostra) – Leitura do branco da 
solução; 
 - 30: tempo de atividade. 
 
Transformação do peso da amostra: 
 500 mg → 5 mL 
 X → 0,3 mL 
 X = 30 mg em 0,3 mL de amostra 
 
Unidade: μmol catecol transformado.min-1.g-1 massa fresca 
 
Bibliografia 
KAR, Manoranjan; MISHRA, Dinabandhu. Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase 
activities during rice leaf senescence. Plant physiology, v. 57, n. 2, p. 315-319, 1976. 
Branco da solução 
- 0,3 mL solução tampão 
- 1,85 mL catecol 0,1M 
Branco da Amostra 
- 0,3 mL da amostra 
- 1,85 mL de água 
deionizada 
Amostra 
- 0,3 da amostra 
- 1,85 mL catecol 0,1M