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<p>A microbiota intestinal como fator ambiental que regula o</p><p>armazenamento de gordura</p><p>Fredrik Bäckhed*†‡, Hao Ding‡§¶,Ting Wang-, Lora V. Hooper†**, Gou Jovem Koh††, Andras Nagy§‡‡, Clay</p><p>F. Semenkovich§§e Jeffrey I. Gordon*†¶¶</p><p>* Centro de Ciências do Genoma e Departamentos de†Biologia Molecular e Farmacologia,-Genética e§§Medicina, Biologia Celular e Fisiologia, Escola de Medicina da</p><p>Universidade de Washington, St. Louis, MO 63110;§Instituto de Pesquisa Samuel Luenfeld, Hospital Mount Sinai, Toronto, ON, Canadá M5G 1X5;</p><p>††Centro Biomédico, Departamento de Ciências Biológicas, Instituto Avançado de Ciência e Tecnologia da Coreia, Daejeon, 305-701, República da Coreia; e</p><p>‡‡Departamento de Genética Médica e Microbiologia, Universidade de Toronto, Toronto, ON, Canadá M5S 1A8</p><p>Contribuição de Jeffrey I. Gordon, 24 de setembro de 2004</p><p>Novos alvos terapêuticos para reduções não cognitivas na ingestão,</p><p>absorção ou armazenamento de energia são cruciais, dada a epidemia</p><p>mundial de obesidade. A comunidade microbiana intestinal (microbiota) é</p><p>essencial para o processamento de polissacarídeos dietéticos. Descobrimos</p><p>que a convencionalização de C57BL adulto livre de germes (GF)-6</p><p>camundongos com microbiota normal colhidos do intestino distal (ceco) de</p><p>animais criados convencionalmente produzem um aumento de 60% no</p><p>conteúdo de gordura corporal e na resistência à insulina em 14 dias, apesar</p><p>da redução na ingestão de alimentos. Estudos de GF e camundongos</p><p>convencionalizados revelaram que a microbiota promove a absorção de</p><p>monossacarídeos do lúmen intestinal, com resultante indução dede novo</p><p>lipogênese hepática. O fator adipócito induzido pelo jejum (Fiaf), um</p><p>membro da família de proteínas semelhantes à angiopoietina, é suprimido</p><p>seletivamente no epitélio intestinal de camundongos normais por</p><p>convencionalização. Análise de GF e convencionalizada, normal eFiaf</p><p>camundongos knockout estabeleceram que o Fiaf é um inibidor da</p><p>lipoproteína lipase circulante e que sua supressão é essencial para a</p><p>deposição de triglicerídeos induzida pela microbiota nos adipócitos. Estudos</p><p>deRag1---animais indicam que estas respostas do hospedeiro não requerem</p><p>linfócitos maduros. Nossas descobertas sugerem que a microbiota intestinal</p><p>é um importante fator ambiental que afeta a captação de energia da dieta e</p><p>o armazenamento de energia no hospedeiro.</p><p>promovendo a saúde. No presente estudo, usamos camundongos gnotobióticos</p><p>normais e geneticamente modificados para abordar a hipótese de que a</p><p>microbiota atua através de uma via integrada de sinalização do hospedeiro para</p><p>regular o armazenamento de energia no hospedeiro.</p><p>Materiais e métodos</p><p>Animais.C57BL-6J (B6) WT eRag1---os ratos foram adquiridos</p><p>no Laboratório Jackson. Receptor ativador proliferador de</p><p>peroxissoma B6--(Ppara)---os ratos foram gentilmente cedidos</p><p>por FJ Gonzales (National Institutes of Health, Bethesda) (7).</p><p>Fator de adipócitos induzido por jejum (Fiaf) -heterozigotos</p><p>em um fundo misto B6:129-Sv foram gerados conforme</p><p>descrito abaixo, eFiaf- ,Fiaf obtido de cruzes deFiaf</p><p>Os animais foram genotipados usando protocolos de PCR</p><p>descritos em Materiais e Métodos de Apoio, que é publicado</p><p>como informação de apoio no site da PNAS.</p><p>Camundongos WT e knockout criados convencionalmente (CONV-R) foram</p><p>rederivados como livres de germes (GF), conforme descrito (8). Os animais GF</p><p>foram mantidos em isoladores gnotobióticos (8), sob um ciclo de luz estrito de 12</p><p>horas (luzes acesas às 06:00 horas) e alimentados com uma dieta de ração</p><p>autoclavada (B & K Universal, East Yorkshire, Reino Unido) ad libitum. Todas as</p><p>manipulações de camundongos foram realizadas usando protocolos aprovados</p><p>pelo Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington.</p><p>- -, eFiaf---irmãos de ninhada, ob-</p><p>- - heterozigotos foram comparados.</p><p>simbiose - processamento de nutrientes - armazenamento de energia - adiposidade - fator</p><p>adiposo induzido pelo jejum</p><p>Colonização de ratos GF.O conteúdo cecal de cada camundongo CONV-R com 8</p><p>semanas de idade foi ressuspenso em 10 ml de PBS estéril e alíquotas de 2 ml</p><p>foram espalhadas na pele de receptores de GF com 7 a 10 semanas de idade. Os</p><p>camundongos convencionalizados resultantes (CONV-D) foram alojados em</p><p>isoladores gnotobióticos por 10 a 28 dias sob as mesmas condições e</p><p>alimentados com a mesma dieta que seus equivalentes GF.</p><p>Os animais CONV-R foram mantidos em gaiolas microisoladoras em um</p><p>estado livre de patógenos especificado em uma instalação de barreira na dieta B</p><p>& K autoclavada. Eles foram transferidos para isoladores gnotobióticos 2</p><p>semanas antes de serem mortos, com 8 a 10 semanas de idade, para imitar as</p><p>condições de alojamento dos camundongos GF e CONV-D.</p><p>Camundongos GF com oito a 10 semanas de idade foram administrados por via oral com 109</p><p>Bacteroides thetaiotaomicroncepa VPI-5482. Denúncia de colonização</p><p>Taqui estão agora -500 milhões de humanos adultos no mundo que estão</p><p>acima do peso [índice de massa corporal (IMC) de 25,0–29,9 kg-m2] e 250</p><p>milhões de obesos (IMC - 30 kg-m2) (1). Esta epidemia crescente ameaça tanto os</p><p>países industrializados como os países em desenvolvimento e tem sido</p><p>acompanhada por aumentos mundiais de doenças relacionadas com a</p><p>obesidade, incluindo diabetes tipo II, hipertensão, patologia cardiovascular e</p><p>doença hepática gordurosa não alcoólica. Nos Estados Unidos, 64% dos adultos</p><p>têm excesso de peso ou obesidade (2), o que levou o Surgeon General a designar</p><p>esta condição como o mais importante desafio de saúde pública do nosso tempo</p><p>(3). A maioria das pessoas é incapaz de fazer mudanças dietéticas intencionais e</p><p>duradouras, necessárias para controlar o peso (4). Portanto, o desenvolvimento</p><p>de alimentos ou a identificação de novos alvos terapêuticos que produzam</p><p>reduções não cognitivas na ingestão, absorção ou armazenamento total de</p><p>energia tem importância considerável para a saúde pública.</p><p>O intestino humano contém um imenso número de microrganismos,</p><p>conhecidos coletivamente como microbiota. Esta comunidade consiste em</p><p>pelo menos 1013cidadãos, é dominado por bactérias anaeróbicas e inclui</p><p>entre 500 e 1.000 espécies cujos genomas coletivos são estimados como</p><p>contendo 100 vezes mais genes do que o nosso próprio genoma humano</p><p>(5, 6). A microbiota pode ser vista como um “órgão” metabólico</p><p>primorosamente sintonizado com a nossa fisiologia que desempenha</p><p>funções que não tivemos que desenvolver por conta própria. Essas funções</p><p>incluem a capacidade de processar componentes de nossa dieta que de</p><p>outra forma seriam indigeríveis, como polissacarídeos vegetais. A definição</p><p>de vias de sinalização do hospedeiro reguladas pela microbiota oferece</p><p>uma oportunidade para identificar novos alvos terapêuticos para</p><p>Disponível gratuitamente online através da opção de acesso aberto do PNAS.</p><p>Abreviaturas: GF, livre de germes; Fiaf, fator adipocitário induzido pelo jejum; B6, C57BL-6J; PPAR,</p><p>receptor ativador-proliferador de peroxissoma; CONV-R, elevado convencionalmente; CONV-D,</p><p>convencionalizado; qRT-PCR, RT-PCR quantitativo; LPL, lipase lipoprotéica; Acc1, acetil-CoA carboxilase;</p><p>Fas, sintase de ácido graxo; SREBP-1, proteína 1 de ligação ao elemento de resposta a esterol; ChREBP,</p><p>proteína de ligação ao elemento de resposta a carboidratos.</p><p>Deposição de dados: As sequências relatadas neste artigo foram depositadas no banco de dados</p><p>GenBank (números de acesso AY667702 – AY668946).</p><p>‡FB e HD contribuíram igualmente para este trabalho.</p><p>¶Endereço atual: Departamento de Bioquímica e Genética Médica, Universidade de Mani-</p><p>toba, Winnipeg, MB, Canadá R3E OW3.</p><p>* * Endereço atual: Centro de Imunologia, Centro Médico Southwestern da Universidade do</p><p>Texas, Dallas, TX 75390.</p><p>¶¶Para quem a correspondência deve ser endereçada. E-mail: jgordon@molecool.wustl.edu .</p><p>© 2004 pela Academia Nacional de Ciências dos EUA</p><p>15718–15723-PNAS -2 de novembro de 2004-vol. 101 - não. 44 www.pnas.org-cgi-doi-10.1073-pnas.0407076101</p><p>Ba</p><p>ix</p><p>ad</p><p>o</p><p>de</p><p>h</p><p>tt</p><p>ps</p><p>://</p><p>w</p><p>w</p><p>w</p><p>.p</p><p>na</p><p>s.</p><p>or</p><p>g</p><p>po</p><p>r 1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>e</p><p>m</p><p>5</p><p>d</p><p>e</p><p>ja</p><p>ne</p><p>iro</p><p>d</p><p>e</p><p>20</p><p>24</p><p>d</p><p>o</p><p>en</p><p>de</p><p>re</p><p>ço</p><p>IP</p><p>1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>.</p><p>Traduzido do Inglês para o Português - www.onlinedoctranslator.com</p><p>http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1073%2Fpnas.0407076101&domain=pdf&date_stamp=2004-10-25</p><p>https://www.onlinedoctranslator.com/pt/?utm_source=onlinedoctranslator&utm_medium=pdf&utm_campaign=attribution</p><p>A densidade no intestino distal, ceco e cólon variou de 108para 1011</p><p>unidades formadoras de colônias-ml de conteúdo luminal, conforme</p><p>definido pela cultura de amostras de conteúdo luminal em ágar sangue BHI</p><p>por 2–3 dias a 37°C sob condições anaeróbicas.</p><p>Medição do conteúdo total de gordura corporal e taxa metabólica (oxigênio</p><p>Consumo).O conteúdo total de gordura corporal foi determinado 5 minutos</p><p>após os ratos serem anestesiados com uma injeção ip de cetamina (10 mg-</p><p>kg de peso corporal) e xilazina (10 mg-kg). O protocolo utilizado para</p><p>absorciometria de raios X de dupla energia (Lunar PIXImus Mouse, GE</p><p>Medical Systems, Waukesha, WI) foi descrito (9).</p><p>O consumo de oxigênio foi determinado em camundongos conscientes,</p><p>enjaulados individualmente, em estado alimentado, usando calorimetria</p><p>indireta de circuito aberto (sistema Oxymax de câmara única para</p><p>pequenos animais, Columbus Instruments, Columbus, OH). Os animais</p><p>foram autorizados a se adaptar à câmara metabólica por 20 min antes do</p><p>VO2foi medido a cada 30 s durante 1 h.</p><p>RT-PCR quantitativo em tempo real baseado em SYBR-Green (qRT-PCR).ARN</p><p>foi isolado conforme descrito emMateriais e Métodos de Apoio e</p><p>transcrito reversamente usando SuperScript II e dT15iniciadores</p><p>(Invitrogen). Os ensaios qRT-PCR foram realizados conforme descrito</p><p>(10), exceto que cada 25--A reação continha cDNA correspondente a 1</p><p>ng de RNA total e 900 nM de iniciadores específicos do gene (Tabela 1,</p><p>publicada como informação de apoio no site do PNAS). Todos os</p><p>ensaios foram realizados em triplicado com um Detector de Sequência</p><p>ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Os dados foram normalizados</p><p>para RNA L32 (CTanálise).</p><p>Figura 1.</p><p>camundongos B6 machos adultos [aqueles criados em estado GF, aqueles autorizados a</p><p>adquirir uma microbiota desde o nascimento até a idade adulta (CONV-R), e aqueles criados GF</p><p>até a idade adulta e depois colonizados por 2 semanas com uma microbiota cecal não</p><p>fracionada colhida de CONV-R doadores (CONV-D)] foram analisados quanto ao conteúdo de</p><p>gordura corporal total por absorciometria de raios X de dupla energia (n 21–25 por grupo)</p><p>(A), peso da gordura epididimal (n 10–20 por grupo) (B), consumo de ração</p><p>(valor médio diário durante os 3 dias antes do término do experimento;n 10 por grupo) (</p><p>C) e consumo de oxigênio (definido por calorimetria de circuito aberto imediatamente</p><p>antes dos animais serem mortos;n10 por grupo) (D). Os valores médios SEM são</p><p>plotados.**,P 0,01 em comparação com GF.</p><p>Fenotipagem de camundongos gnotobióticos WT. Três grupos de crianças de 8 a 10 semanas</p><p>Ensaios de Lipoproteína Lipase (LPL).Atividade da LPL na gordura epididimal</p><p>almofadas foi determinada de acordo com a ref. 11. Para obter detalhes,</p><p>consulte Materiais e Métodos de Apoio.</p><p>Estatisticas.Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas</p><p>usando o teste de Studentttestes. As comparações entre mais de dois grupos de</p><p>camundongos foram feitas por uma ANOVA unidirecional seguida pelo teste de</p><p>comparação múltipla post hoc de Tukey.</p><p>produzido por uma convencionalização de 14 dias também ocorreu diante</p><p>da diminuição do consumo de ração (27% menor que GF; Fig. 1C).</p><p>Esses efeitos não foram exclusivos dos homens: as mulheres CONV-D B6</p><p>exibiram aumentos na gordura corporal total (85%) e reduções na massa</p><p>corporal magra (9%) que não foram significativamente diferentes dos homens da</p><p>mesma idade (P-0,05). Além disso, o fenótipo de armazenamento de gordura não</p><p>se limitou à cepa endogâmica B6: uma convencionalização de 14 dias de</p><p>camundongos machos com 8 semanas de idade pertencentes à cepa</p><p>endogâmica NMRI produziu um aumento de 90% no conteúdo total de gordura</p><p>corporal (P 0,01 em comparação com GF) e uma diminuição de 31% em</p><p>consumo de ração (P 0,05).</p><p>Estudos de enumeração de rDNA 16S baseados em sequência da microbiota</p><p>cecal revelaram grandes semelhanças na representação fracionária das espécies</p><p>predominantes em doadores de CONV-R e receptores de CONV-D B6 (Fig. 6 e</p><p>Tabela 2, que são publicadas como informações de apoio no PNAS local na rede</p><p>Internet). Como em muitos humanos, Bacteroides e Clostridium foram os</p><p>gêneros mais prevalentes.B. tetaiotaomicroné um membro proeminente da</p><p>microbiota intestinal distal humana com uma extraordinária capacidade de</p><p>adquirir e degradar polissacarídeos vegetais (12). Por exemplo, seu proteoma</p><p>contém 172 glicosilhidrolases que se prevê clivam a maioria das ligações</p><p>glicosídicas encontradas na dieta humana. Estudos em camundongos GF</p><p>colonizados comB. tetaiotaomicrondemonstraram que a sua atividade de</p><p>processamento de polissacarídeos está associada à indução de transportadores</p><p>de monossacarídeos hospedeiros (13). Portanto, colonizamos camundongos GF</p><p>B6 machos com 8 semanas de idade por 2 semanas com a cepa sequenciada</p><p>(VPI-5482) para determinar se uma única espécie bacteriana sacarolítica poderia,</p><p>por si só, afetar o armazenamento de gordura do hospedeiro. A colonização</p><p>produziu um aumento estatisticamente significativo no conteúdo total de</p><p>gordura corporal, embora a magnitude do aumento tenha sido menor do que a</p><p>obtida com um micro-organismo cecal não fracionado.</p><p>Resultados e discussão</p><p>A introdução de uma microbiota intestinal em ratos GF adultos produz um rápido</p><p>aumento no conteúdo de gordura corporal, apesar do consumo reduzido de ração.</p><p>Comparações de camundongos B6 machos de 8 a 10 semanas de idade criados</p><p>na ausência de quaisquer microrganismos (GF) com camundongos que</p><p>abrigavam uma microbiota desde o nascimento (CONV-R) revelaram que os</p><p>animais CONV-R contêm 42% mais gordura corporal total , conforme definido</p><p>pela absorciometria de raios X de dupla energia (Fig. 1A). Os pesos da gordura</p><p>epididimal também foram significativamente maiores (47%; Fig. 1B). Os níveis</p><p>mais elevados de gordura corporal observados em animais CONV-R são</p><p>intrigantes, uma vez que o consumo diário de uma dieta padrão para roedores</p><p>(57% de carboidratos, 5% de gordura) foi 29% menor do que seus equivalentes</p><p>GF (Fig. 1).C).</p><p>Uma colonização de 14 dias de receptores GF B6 masculinos de 8 a 10</p><p>semanas de idade com uma microbiota não fracionada colhida do intestino</p><p>distal (ceco) de doadores adultos de CONV-R, um processo conhecido como</p><p>convencionalização, produziu um aumento dramático de 57% em seu</p><p>conteúdo total de gordura corporal (Fig. 1A) e um aumento de 61% no peso</p><p>da gordura epididimal (Fig. 1B). O aumento da gordura corporal foi</p><p>associado a uma diminuição de 7% na massa corporal magra, resultando</p><p>em nenhuma diferença significativa no peso corporal total entre os dois</p><p>grupos [23,5 · 2,6 g (GF) versus 23,4 · 2,6 g (CONV-D);n</p><p>21;P-0,05]. Valores séricos de triglicerídeos em jejum</p><p>eram semelhantes (P-0,05) em camundongos GF e CONV-D (dados não</p><p>mostrados).</p><p>Um aumento semelhante no teor de gordura corporal total foi observado após uma</p><p>convencionalização mais curta de 10 dias (66%;P-0,05 em comparação com 14 d). Uma</p><p>convencionalização mais prolongada (28 dias) não produziu aumentos adicionais no</p><p>conteúdo total de gordura corporal ou no peso da gordura epididimal (dados não</p><p>mostrados). O aumento do armazenamento de gordura</p><p>Backhede outros. PNAS -2 de novembro de 2004-vol. 101 - não. 44 -15719</p><p>Ba</p><p>ix</p><p>ad</p><p>o</p><p>de</p><p>h</p><p>tt</p><p>ps</p><p>://</p><p>w</p><p>w</p><p>w</p><p>.p</p><p>na</p><p>s.</p><p>or</p><p>g</p><p>po</p><p>r 1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>e</p><p>m</p><p>5</p><p>d</p><p>e</p><p>ja</p><p>ne</p><p>iro</p><p>d</p><p>e</p><p>20</p><p>24</p><p>d</p><p>o</p><p>en</p><p>de</p><p>re</p><p>ço</p><p>IP</p><p>1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>.</p><p>CI</p><p>ÊN</p><p>CI</p><p>AS</p><p>M</p><p>ÉD</p><p>IC</p><p>AS</p><p>Figura 2.</p><p>níveis de leptina e diminui a sensibilidade à insulina. (A) Os soros foram obtidos após</p><p>jejum de 4 horas e analisados para leptina, insulina e glicose (n 8 animais por</p><p>grupo). Os</p><p>números representam valores médios SEM. Tolerância a glicose (B) e</p><p>tolerância à insulina (C) os testes foram realizados após jejum de 4 horas (n8 ratos por</p><p>grupo). Os valores médios SEM são plotados.***,P0,001;**,P0,01; e*,P 0,05 em</p><p>comparação com GF.</p><p>Uma convencionalização de 14 dias de camundongos WT GF B6 aumenta a circulação</p><p>biota (23% versus 57%, respectivamente;n P</p><p>0,01).</p><p>10 ratos por grupo;</p><p>A taxa metabólica é maior em camundongos CONV-D do que em seus contra-GF</p><p>peças.Como o aumento do teor de gordura corporal mediado pela</p><p>microbiota não foi causado pelo aumento do consumo de ração, foi</p><p>realizada calorimetria indireta de circuito aberto para determinar se refletia</p><p>diminuição do gasto energético. Esta explicação foi excluída quando</p><p>descobrimos que os camundongos GF mais magros tinham uma taxa</p><p>metabólica (VO2) que foi 27% menor do que camundongos B6 da mesma</p><p>idade e sexo (machos) convencionalizados por 14 dias (P 0,01; Figura 1D).</p><p>Camundongos CONV-D tinham VO2valores que não foram</p><p>significativamente diferentes dos animais CONV-R da mesma idade e</p><p>sexo (Fig. 1D).</p><p>O aumento do VO2observado com a convencionalização poderia</p><p>refletir o aumento da taxa metabólica no hospedeiro e/ou a atividade</p><p>metabólica de sua comunidade microbiana recentemente adquirida.</p><p>Não existem métodos disponíveis para medir a atividade metabólica</p><p>da microbiotana Vivo. No entanto, ensaios bioquímicos microanalíticos</p><p>do músculo gastrocnêmio e do fígado congelados revelaram</p><p>aumentos significativos nos níveis de estado estacionário dos</p><p>intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico em animais CONV-D</p><p>versus GF. Apesar desta evidência de aumento da atividade do ciclo,</p><p>não houve alterações significativas nas reservas teciduais de fosfato</p><p>de alta energia.n5 animais por grupo; Tabela 3, publicada como informação</p><p>de apoio no site da PNAS). O aumento do consumo de oxigênio</p><p>sem aumentar as reservas de fosfato de alta energia implica a</p><p>presença de ciclos fúteis, um correlato bioquímico do</p><p>metabolismo ineficiente no hospedeiro (veja abaixo).</p><p>A leptina é um hormônio derivado de adipócitos cuja expressão se</p><p>correlaciona com o conteúdo lipídico dos adipócitos (14). Além disso, sabe-</p><p>se que a leptina reduz a ingestão de alimentos e aumenta o gasto</p><p>energético em ratos (15). Os níveis de leptina aumentam com a colonização</p><p>(Fig. 2A). O aumento é proporcional ao aumento da gordura corporal (R2</p><p>0,977).</p><p>O aumento no teor de gordura foi acompanhado por elevações</p><p>estatisticamente significativas nos níveis de glicose e insulina em jejum (Fig.</p><p>Figura 3.</p><p>do fator de transcrição hélice-alça-hélice básico ChREBP. (A) Manchas óleo-vermelho O de seções de</p><p>fígado fixadas em paraformaldeído preparadas a partir de camundongos WT machos GF e CONV-D B6</p><p>com 8 semanas de idade. (B) Níveis de triglicerídeos hepáticos (TG) (n 5 por grupo;</p><p>valores médios SEM;***,P0,001 em comparação com GF). (C) ensaios qRT-PCR de RNAs de</p><p>fígado de camundongos GF e CONV-D [n 15 por grupo; valores médios SEM são</p><p>expresso em relação aos níveis em animais GF (GF definido em 100%);*,P0,05;***,P 0,001 em</p><p>comparação com GF]. (D) Estudo imuno-histoquímico de seções de fígado fixadas em</p><p>paraformaldeído de camundongos GF ou CONV-D. As seções foram coradas com anticorpos</p><p>policlonais de coelho para ChREBP de camundongo (verde). Os núcleos são rotulados em azul</p><p>escuro com 4,6-diamidino-2-fenilindol. (Barras: 25-m.)</p><p>A convencionalização induz lipogênese hepática e importação nuclear</p><p>2A) e um estado de resistência à insulina, conforme definido pelos testes de</p><p>glicose e tolerância à insulina (Fig. 2BeC).</p><p>A microbiota orienta o hospedeiro a aumentar a produção hepática de</p><p>Triglicerídeos.Sabe-se que a glicose e a insulina induzem a expressão de</p><p>enzimas lipogênicas no fígado (16). Uma convencionalização de 14 dias de</p><p>camundongos GF produziu um aumento de 2,3 vezes no conteúdo de</p><p>triglicerídeos hepáticos (Fig. 3).AeB), mas sem alterações apreciáveis no</p><p>total de ácidos graxos livres do fígado ou colesterol (P-0,05; dados não</p><p>mostrados). Os ensaios qRT-PCR confirmaram que a convencionalização foi</p><p>acompanhada por elevações estatisticamente significativas nos mRNAs do</p><p>fígado que codificam duas enzimas principais node novovia biossintética de</p><p>ácidos graxos, acetil-CoA carboxilase (Acc1) e sintase de ácidos graxos (Fas)</p><p>(Fig. 3C).</p><p>A proteína 1 de ligação ao elemento de resposta ao esterol (SREBP-1) e a</p><p>proteína de ligação ao elemento de resposta a carboidratos (ChREBP), dois</p><p>fatores básicos de transcrição de zíper hélice-alça-hélice-leucina, medeiam</p><p>as respostas lipogênicas dos hepatócitos à insulina e à glicose e parecem</p><p>agir sinergicamente (17) . AmbosConta1eFassão alvos conhecidos de</p><p>ChREBP e SREBP-1 (16). Ensaios qRT-PCR de RNAs hepáticos revelaram que</p><p>a convencionalização aumenta o fígado</p><p>15720-www.pnas.org-cgi-doi-10.1073-pnas.0407076101 Backhede outros.</p><p>Ba</p><p>ix</p><p>ad</p><p>o</p><p>de</p><p>h</p><p>tt</p><p>ps</p><p>://</p><p>w</p><p>w</p><p>w</p><p>.p</p><p>na</p><p>s.</p><p>or</p><p>g</p><p>po</p><p>r 1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>e</p><p>m</p><p>5</p><p>d</p><p>e</p><p>ja</p><p>ne</p><p>iro</p><p>d</p><p>e</p><p>20</p><p>24</p><p>d</p><p>o</p><p>en</p><p>de</p><p>re</p><p>ço</p><p>IP</p><p>1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>.</p><p>Figura 4.A convencionalização promove a hipertrofia dos adipócitos, suprimindoFiafexpressão no intestino. (Um superior) Almofadas de gordura epididimal de camundongos WT</p><p>machos GF, CONV-D e CONV-R B6 com 8 semanas de idade. (Um menor) As seções correspondentes coradas com hematoxilina e eosina são mostradas. (B) ensaios qRT-PCR de RNAs</p><p>de gordura epididimal colhidos de camundongos WT revelam que a convencionalização não produz mudanças significativas na expressão de mediadores ou biomarcadores de</p><p>lipogênese e adipogênese (valores médios SEM são plotados;P-0,05;n almofadas de gordura epididimal e coração de camundongos WT (**,P</p><p>0,001 em relação ao GF (fixado em 100%);n e o</p><p>locus mutado com os exons 1–3 substituídos por um</p><p>RNA estabelece a ausência de mRNA Fiaf detectável emFiaf---animais. (F) A ausência de Fiaf atenua marcadamente o aumento no teor de gordura corporal total após uma</p><p>convencionalização de 14 dias (**,P 0,01 comparado com WT;n 7–8 por grupo).</p><p>15 por grupo). (C) A atividade da LPL é aumentada com a convencionalização em ambos</p><p>0,01 e***,P0,001 em relação ao GF;n5 por grupo). (D) ensaios qRT-PCR deFiafexpressão em animais WT</p><p>13]. (E) Geração deFiafratos nocauteadores. Estruturas são mostradas para o WTFiaflocus, o vetor de segmentação,</p><p>cassete geopA. A ruptura desejada foi verificada por análise Southern blot. Northern blots de adipócitos</p><p>[***,P</p><p>mRNA de ChREBP e, em menor extensão, níveis de mRNA de SREBP-1</p><p>(Fig. 3C).</p><p>ChREBP é translocado do citoplasma para o núcleo após ser</p><p>desfosforilado pela serina-treonina fosfatase PP2A (18, 19). O</p><p>PP2A, por sua vez, é ativado pela xilulose-5-fosfato (Xu5P) (20), um</p><p>intermediário no shunt da hexose monofosfato. Os ratos</p><p>colonizados com uma microbiota apresentaram níveis elevados</p><p>de Xu5P no fígado em comparação com os seus homólogos GF</p><p>(1,6 0,4 versus 2,6 0,3-mol-g de peso úmido do fígado;P 0,01; ver</p><p>Esquema 1, que é publicado como informação de apoio no site do</p><p>PNAS para ensaio) e mais ChREBP localizado nuclearmente (Fig. 3</p><p>D).</p><p>Obtivemos evidências bioquímicas diretas de que a presença da</p><p>microbiota promove aumento da captação de monossacarídeos no</p><p>intestino. Camundongos GF e suas contrapartes CONV-D (n 4</p><p>por grupo) receberam uma única gavagem de 100-l de uma mistura</p><p>de 5 mM de glicose e 0,2 mM de 2-desoxiglicose e mortos 15 minutos</p><p>depois, e os níveis de 2-desoxiglicose 6-fosfato foram medidos em</p><p>seus intestinos distais. Os níveis foram 2 vezes maiores em</p><p>camundongos CONV-D (1,15 0,013 versus 0,55 0,04 pmol--g de</p><p>proteína;P 0,001). Uma vez absorvidos pelo intestino, a transferência</p><p>de monossacarídeos para a circulação portal é facilitada através de</p><p>um efeito adicional da microbiota. Mostramos anteriormente que a</p><p>convencionalização resulta na duplicação da densidade de</p><p>capilares subjacentes ao epitélio das vilosidades do intestino delgado</p><p>a níveis equivalentes aos de animais CONV-R da mesma idade (21).</p><p>Juntos, esses achados</p><p>são consistentes com um aumento no</p><p>processamento de polissacarídeos dietéticos por glicosilhidrolases</p><p>microbianas em camundongos CONV-D, aumento da entrega de</p><p>monossacarídeos aos seus fígados e aumento da transativação de</p><p>enzimas lipogênicas por ChREBP e talvez SREBP-1. O fígado tem pelo</p><p>menos duas maneiras de responder a esse fornecimento aumentado</p><p>de calorias: aumentando o metabolismo ineficiente (ciclos fúteis) e</p><p>exportando essas calorias na forma de gordura para deposição nos</p><p>tecidos periféricos.</p><p>A microbiota promove o armazenamento de triglicerídeos nos adipócitos</p><p>por meio da supressão da expressão intestinal de uma LPL circulante</p><p>Inibidor.O conteúdo de DNA das camadas de gordura epididimal</p><p>recuperadas de camundongos GF e CONV-D não foi significativamente</p><p>diferente. Esta observação, juntamente com estudos histoquímicos,</p><p>permitiu-nos concluir que o aumento do peso da camada de gordura</p><p>epididimal induzido pela microbiota refletiu a hipertrofia dos adipócitos</p><p>(Fig. 4).A). Além disso, análises qRT-PCR do RNA do tecido adiposo</p><p>revelaram que nenhum dos biomarcadores de adipogênese (aP2 e PPAR-)</p><p>ou lipogênese (Acc1 e Fas) foram significativamente alterados após a</p><p>convencionalização (Fig. 4).B).</p><p>A LPL é um regulador chave da liberação de ácidos graxos das lipoproteínas</p><p>ricas em triglicerídeos nos músculos, coração e gordura (22). Maior adi-</p><p>Backhede outros. PNAS -2 de novembro de 2004-vol. 101 - não. 44 -15721</p><p>Ba</p><p>ix</p><p>ad</p><p>o</p><p>de</p><p>h</p><p>tt</p><p>ps</p><p>://</p><p>w</p><p>w</p><p>w</p><p>.p</p><p>na</p><p>s.</p><p>or</p><p>g</p><p>po</p><p>r 1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>e</p><p>m</p><p>5</p><p>d</p><p>e</p><p>ja</p><p>ne</p><p>iro</p><p>d</p><p>e</p><p>20</p><p>24</p><p>d</p><p>o</p><p>en</p><p>de</p><p>re</p><p>ço</p><p>IP</p><p>1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>.</p><p>CI</p><p>ÊN</p><p>CI</p><p>AS</p><p>M</p><p>ÉD</p><p>IC</p><p>AS</p><p>a atividade da LPL nos células leva ao aumento da captação celular de ácidos</p><p>graxos e ao acúmulo de triglicerídeos nos adipócitos. Na gordura branca, a LPL é</p><p>regulada pós-transcricionalmente pelo estado nutricional: o jejum reduz e a</p><p>realimentação aumenta a atividade enzimática (23). Curiosamente, descobrimos</p><p>que uma convencionalização de 14 dias aumentou a atividade da LPL em 122%</p><p>nas camadas de gordura epididimal (Fig. 4).C). Além disso, o efeito não se limitou</p><p>à gordura: os ensaios enzimáticos do coração revelaram um aumento de 99%</p><p>com a convencionalização (Fig. 4).C). Níveis aumentados de insulina produzem</p><p>reduções na atividade muscular da LPL (24). Portanto, nossos achados indicaram</p><p>que a microbiota induz o aumento geral observado na LPL através de outro</p><p>mecanismo.</p><p>O Fiaf, também conhecido como proteína 4 semelhante à angiopoietina,</p><p>é produzido pela gordura marrom e branca, fígado e intestino (13, 25, 26).</p><p>Esta proteína secretada é um inibidor da LPLem vitro[CI50 200 nM</p><p>(27)]. Análise qRT-PCR do intestinoFiafa expressão durante o período pós-</p><p>natal revelou que o gene é induzido em camundongos GF durante a</p><p>transição amamentação-desmame. A indução não ocorre em animais</p><p>CONV-R, resultando em níveis significativamente mais baixos de mRNA Fiaf</p><p>no intestino adulto CONV-R versus GF (Fig. 7, que é publicado como</p><p>informação de apoio no site do PNAS). Durante a transição entre</p><p>amamentação e desmame, a dieta muda do leite materno rico em lipídios e</p><p>lactose para ração rica em polissacarídeos com baixo teor de gordura, com</p><p>expansão coincidente da microbiota e uma mudança de anaeróbios</p><p>facultativos para anaeróbios obrigatórios (por exemplo, Bacteroides). Essas</p><p>observações sugeriram queFiafpoderia fornecer um sinal que liga a</p><p>convencionalização a uma mudança na partição de energia do hospedeiro.</p><p>Ensaios qRT-PCR revelaram que a convencionalização de camundongos</p><p>GF adultos suprimiuFiafexpressão no intestino delgado (íleo), mas não no</p><p>fígado ou na gordura branca (Fig. 4D). Estudos qRT-PCR de</p><p>acompanhamento da cripta intestinal microdissecada por captura a laser e</p><p>do epitélio das vilosidades, e do mesênquima das vilosidades,</p><p>estabeleceram que a supressão microbiana deFiafocorre em células</p><p>epiteliais de vilosidades diferenciadas (dados não mostrados).</p><p>Juntas, essas descobertas sugerem que a microbiota atua para</p><p>estimular a produção hepática de triglicerídeos através de efeitos</p><p>mediados por fatores de transcrição, como ChREBP, e para</p><p>promover a incorporação desses triglicerídeos dirigida pela LPL</p><p>nos adipócitos através da supressão transcricional de um gene</p><p>epitelial intestinal que codifica um inibidor circulante da LPL.</p><p>Testamos essa hipótese gerando ratos com valor nuloFiafalelo</p><p>(Fig. 4E) e rederivá-los como GF.</p><p>GF macho de oito semanas de idadeFiaf---camundongos têm atividade LPL da</p><p>camada de gordura epididimal 67% maior do que irmãos de ninhada GF</p><p>contendo o WTFiafalelo (P 0,01), confirmando que a Fiaf é uma</p><p>importante inibidor desta lipasena Vivo. A convencionalização de camundongos</p><p>knockout para GF não produziu alterações significativas na atividade da LPL nas</p><p>camadas de gordura (ou coração) (P-0,05;n 10 animais).</p><p>GFFiaf---os animais têm a mesma quantidade de gordura corporal total</p><p>que seus CONV-D da mesma idade e sexo (Fiaf-suprimido) irmãos de</p><p>ninhada WT (12,8 1,1% do peso corporal versus 14,2 1,9, P-0,05). Além</p><p>disso, uma convencionalização de 14 dias de já FiafAnimais knockout com</p><p>deficiência de GF produziram apenas pequenos aumentos na gordura</p><p>corporal total (aumento de 10,8% versus aumento de 55,16% em irmãos de</p><p>ninhada WT; Fig. 4F).Fiaf--os heterozigotos tiveram um aumento</p><p>intermediário (33,12%). Estes resultados estabelecem a importância do Fiaf</p><p>como um mediador proeminente da regulação microbiana do</p><p>armazenamento periférico de gordura.</p><p>tificado: um se sobrepõe ao sítio de ligação do PPAR; o outro é semelhante</p><p>ao sítio de ligação Heb, que contém uma caixa E (Fig. 8A, que é publicado</p><p>como informação de apoio no site da PNAS). Em segundo lugar,</p><p>pesquisamos oTRANSFACbanco de dados (30) de 466 matrizes de pontuação</p><p>de fatores de transcrição específicos de vertebrados com</p><p>PATROCINADOR(G. Hertz e G. Stormo, comunicação pessoal, http:--</p><p>ural.wustl.edu) para sites de ligação com pontuação alta que</p><p>aparecem em todos os cincoFiafortólogos e em blocos de sequências</p><p>conservadas entre os genes humanos e de camundongo. Mais de 40</p><p>matrizes satisfizeram esses dois critérios de seleção (Tabela 4, que é</p><p>publicada como informação de apoio no site do PNAS), incluindo sites</p><p>reconhecidos por vários fatores contendo domínios de cabeça de</p><p>forquilha (por exemplo, HNF3, HNF4-e FKH8) e um elemento de</p><p>resposta estimulado por IFN (Fig. 8).</p><p>Fiaf foi identificado durante uma triagem para PPAR--alvos no fígado</p><p>(25). PPAR--é um importante regulador do metabolismo energético em uma</p><p>variedade de tecidos, incluindo intestino, fígado, coração e rim (31).</p><p>Descobrimos que o PPAR--Os níveis de mRNA diminuem modestamente</p><p>(1,7 0,2 vezes) no intestino delgado de animais CONV-D em comparação</p><p>com animais GF, mas permanecem inalterados em seus fígados e bolsas de</p><p>gordura (P 0,05; veja a Fig. 9, que é publicada como suporte</p><p>informações no site da PNAS). Para testar diretamente o papel do PPAR--na</p><p>regulação da mudança dirigida pela microbiota no conteúdo de gordura</p><p>corporal e na supressão deFiaf, B6Pparacamundongos knockout foram re-</p><p>derivados como GF. GF masculino de oito a 10 semanas de idadePpara---os</p><p>camundongos tinham a mesma quantidade de gordura corporal total que</p><p>seus irmãos de ninhada GF WT da mesma idade e sexo (Fig. 9). Além disso,</p><p>Ppara---os animais não tiveram prejuízo no aumento do conteúdo de</p><p>gordura corporal induzido pela microbiota (Fig. 9). Finalmente ensaios qRT-</p><p>PCR de RNAs intestinais isolados de GF e CONV-D WT ePpara---</p><p>camundongos indicaram que a ausência de PPAR--não evitou a supressão</p><p>transcricional deFiafapós a convencionalização (Fig. 9). Concluímos que a</p><p>resposta de armazenamento de gordura do hospedeiro à microbiota não</p><p>requer PPAR--. Uma análise comparável do papel do PPAR- não pôde ser</p><p>realizada porqueParg---os ratos morrem no dia embrionário 10 (29).</p><p>Encontrando um elemento de resposta conservado estimulado por</p><p>IFN no ortólogoFiafgenes foi intrigante à luz do nosso anterior</p><p>GENECHIPanálises de RNAs</p><p>intestinais que revelaram que a</p><p>convencionalização de camundongos B6 GF regula a expressão de</p><p>vários genes envolvidos nas respostas das células B e T (28). Portanto,</p><p>derivamos novamente B6Rag1----camundongos deficientes como GF</p><p>para determinar se a presença ou ausência de células T e B maduras</p><p>teve um efeito na capacidade da microbiota de aumentar o conteúdo</p><p>de gordura corporal ou modularFiaf.Rag1-eRag1---irmãos de ninhada</p><p>tiveram aumentos equivalentes no teor de gordura corporal após uma</p><p>convencionalização de 14 dias (59,16% versus 67</p><p>graus semelhantes deFiafsupressão (2,8</p><p>respectivamente;P 0,05 em comparação com GF). Assim, parece que</p><p>16%;P-0,05) e 0,3 e</p><p>3,8 0,3 vezes,</p><p>O efeito da microbiota sobreFiafExpressão e armazenamento de gordura</p><p>não dependem de linfócitos maduros ou PPAR--.Descobrimos que o</p><p>homólogo de peixe-zebra de ratoFiafé suprimida pela microbiota</p><p>quando os peixes GF são convencionalizados, indicando que esta</p><p>resposta foi altamente conservada ao longo da evolução dos</p><p>vertebrados (28). Aplicamos dois métodos para identificar elementos</p><p>regulatórios conservados nos 10 kb da sequência de DNA 5 no local de</p><p>início da transcrição de humanos, camundongos, ratos, peixes-zebra e</p><p>fuguFiafortólogos. Primeiro, procuramos novos motivos usando</p><p>FILOCON(29). Dois motivos estatisticamente significativos foram identificados</p><p>Figura 5.</p><p>A microbiota atua através do Fiaf para coordenar o aumento da lipogênese hepática com o</p><p>aumento da atividade da LPL nos adipócitos, promovendo assim o armazenamento de calorias</p><p>colhidas da dieta em gordura. Veja o texto para mais detalhes.</p><p>Visão esquemática de como os efeitos da microbiota intestinal hospedam o armazenamento de gordura.</p><p>15722-www.pnas.org-cgi-doi-10.1073-pnas.0407076101 Backhede outros.</p><p>Ba</p><p>ix</p><p>ad</p><p>o</p><p>de</p><p>h</p><p>tt</p><p>ps</p><p>://</p><p>w</p><p>w</p><p>w</p><p>.p</p><p>na</p><p>s.</p><p>or</p><p>g</p><p>po</p><p>r 1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>e</p><p>m</p><p>5</p><p>d</p><p>e</p><p>ja</p><p>ne</p><p>iro</p><p>d</p><p>e</p><p>20</p><p>24</p><p>d</p><p>o</p><p>en</p><p>de</p><p>re</p><p>ço</p><p>IP</p><p>1</p><p>68</p><p>.2</p><p>28</p><p>.3</p><p>8.</p><p>30</p><p>.</p><p>estes componentes celulares do sistema imunitário adaptativo não são</p><p>necessários para processar sinais ou produtos metabólicos provenientes da</p><p>microbiota intestinal que promovem o armazenamento de gordura.</p><p>dietas com grandes porções e alto teor calórico, esse “benefício” torna-se um</p><p>prejuízo.</p><p>Nossa descoberta de que a supressão microbiana do intestinoFiaf</p><p>promove a adiposidade, através do mecanismo resumido na Fig. 5, sugere</p><p>que o aumento da expressão e/ou atividade do Fiaf pode promover a</p><p>magreza. Também especulamos que as mudanças na ecologia microbiana</p><p>provocadas pelas dietas ocidentais, e/ou diferenças na ecologia microbiana</p><p>entre os indivíduos que vivem nestas sociedades, podem funcionar como</p><p>um factor “ambiental” que afecta a predisposição para o armazenamento</p><p>de energia e a obesidade.</p><p>Prospecto: A Microbiota como Fator Ambiental que Afeta a Predisposição à</p><p>Adiposidade.Os seres humanos adultos são compostos por</p><p>estima-se que haja 10 vezes mais micróbios residentes do que células</p><p>humanas (5). Nossos parceiros microbianos coevoluíram conosco para</p><p>estabelecer relações mutuamente benéficas (simbióticas). Estas relações</p><p>baseiam-se normalmente na partilha de nutrientes. Os estudos descritos</p><p>neste artigo indicam que uma manifestação dessa relação simbiótica é o</p><p>processamento microbiano de componentes da dieta e a deposição da</p><p>energia extraída nos depósitos de gordura do hospedeiro. A capacidade de</p><p>armazenar energia seria um atributo benéfico para os humanos antigos</p><p>que tinham acesso variável aos alimentos. Contudo, nas sociedades</p><p>modernas e desenvolvidas, onde existe acesso imediato a</p><p>Agradecemos a David O'Donnell, Maria Karlsson, Jill Manchester,</p><p>Sabrina Wagoner, Trey Coleman e Xiaoli Wu pela assistência técnica e</p><p>a John Rawls, Peter Kang, Peter Crawford e Justin Sonnenburg pelos</p><p>conselhos úteis. Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos</p><p>Nacionais de Subsídios de Saúde DK30292, DK56341 e HL58427 e pelo</p><p>Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde. FB recebeu bolsa de pós-</p><p>doutorado da Fundação Wenner-Gren.</p><p>1.Bouchard, C. (2000)N. Engl. J. Med.343,1888–1889.</p><p>2. Mokdad, AH, Marks, JS, Stroup, DF e Gerberding, JL (2004)Geléia. Med. Assoc.</p><p>291,1238–1245.</p><p>3. Departamento de Saúde e Serviços Humanos (2001)O apelo à ação do cirurgião</p><p>geral para prevenir e diminuir o sobrepeso e a obesidade(Serviço de Saúde Pública,</p><p>Washington, DC).</p><p>4. Friedman, JM (2004)Nat. Med.10,563–569.</p><p>5. Selvagem, DC (1977)Anu. Rev. Microbiol.31,107–133.</p><p>6. Xu, J. e Gordon, JI (2003)Processo. Nacional. Acad. Ciência. EUA100,10452–</p><p>10459.</p><p>7. Lee, SS, Pineau, T., Drago, J., Lee, EJ, Owens, JW, Kroetz, DL, Fernandez-</p><p>Salguero, PM, Westphal, H. & Gonzalez, FJ (1995)Mol. Célula. Biol.15,3012–</p><p>3022.</p><p>8. Hooper, LV, Mills, JC, Roth, KA, Stappenbeck, TS, Wong, MH & Gordon, JI (2002)</p><p>emMicrobiologia Celular Molecular, ed. Sansonetti, P. & Zychlinsky, A.</p><p>(Acadêmico, San Diego), Vol. 31, pp.</p><p>9. Bernal-Mizrachi, C., Weng, S., Li, B., Nolte, LA, Feng, C., Coleman, T., Holloszy,</p><p>JO & Semenkovich, CF (2002)Arterioscler. Trombo. Vasco. Biol.</p><p>22,961–968.</p><p>10. Stappenbeck, TS, Hooper, LV, Manchester, JK, Wong, MH & Gordon,</p><p>JI (2002)Métodos Enzimol.356,167–196.</p><p>11. Iverius, PH e Ostlund-Lindqvist, AM (1986)Métodos Enzimol.129, 691–704.</p><p>12. Xu, J., Bjursell, MK, Himrod, J., Deng, S., Carmichael, LK, Chiang, HC, Hooper,</p><p>LV e Gordon, JI (2003)Ciência299,2074–2076.</p><p>13. Hooper, LV, Wong, MH, Thelin, A., Hansson, L., Falk, PG & Gordon,</p><p>JI (2001)Ciência291,881–884.</p><p>14. Maffei, M., Fei, H., Lee, GH, Dani, C., Leroy, P., Zhang, Y., Proença, R., Negrel,</p><p>R., Ailhaud, G. & Friedman, JM ( 1995)Processo. Nacional. Acad. Ciência. EUA</p><p>92,6957–6960.</p><p>15. Pelleymounter, MA, Cullen, MJ, Baker, MB, Hecht, R., Winters, D., Boone, T. &</p><p>Collins, F. (1995)Ciência269,540–543.</p><p>16. Towle, HC (2001)Processo. Nacional. Acad. Ciência. EUA98,13476–13478.</p><p>17. Dentin, R., Pegorier, JP, Benhamed, F., Foufelle, F., Ferre, P., Fauveau, V.,</p><p>Magnuson, MA, Girard, J., Postic, C., Kabashima, T.,e outros.(2004)J. Biol.</p><p>Química.279,20314–20326.</p><p>18. Yamashita, H., Takenoshita, M., Sakurai, M., Bruick, RK, Henzel, WJ,</p><p>Shillinglaw, W., Arnot, D. & Uyeda, K. (2001)Processo. Nacional. Acad. Ciência.</p><p>EUA98, 9116–9121.</p><p>19. Kawaguchi, T., Takenoshita, M., Kabashima, T., Uyeda, K., Yamashita, H.,</p><p>Sakurai, M., Bruick, RK, Henzel, WJ, Shillinglaw, W. & Arnot, D. ( 2001)</p><p>Processo. Nacional. Acad. Ciência. EUA98,13710–13715.</p><p>20. Kabashima, T., Kawaguchi, T., Wadzinski, BE, Uyeda, K., Takenoshita, M., Yamashita,</p><p>H., Sakurai, M., Bruick, RK, Henzel, WJ, Shillinglaw, W.,e outros. (2003)Processo.</p><p>Nacional. Acad. Ciência. EUA100,5107–5112.</p><p>21. Stappenbeck, TS, Hooper, LV e Gordon, JI (2002)Processo. Nacional. Acad. Ciência.</p><p>EUA99,15451–15455.</p><p>22. 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