AULA - Alimentos predominantemente proteicos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA
Prof. Francisco C. de Sousa Júnior
Natal-RN
Alimentos predominantemente proteicos: 
métodos de análise
Alimentos predominantemente proteicos
 Proteínas: 
 Maiores constituintes das células vivas
 Associadas à funções biológicas vitais
 Função nutricional, organoléptica, textura
 São obtidas de origem animal ou vegetal (fontes convencionais)
 Teor de aminoácidos essenciais 
 ONU recomenda 30 g de proteína animal por dia
Aminoácidos (aa)
 Unidades estruturais básicas das proteínas
Grupamento 
amino
Grupamento 
carboxila
Cadeia lateral
Átomo de hidrogênio
Aminoácidos (aa)
Ligações peptídicas
Análise de proteínas
IMPORTÂNCIA:
 Conhecer o valor nutritivo
 Determinação da composição centesimal
 Estimar rendimento industrial
 Avaliar a qualidade (p. ex. farinha de trigo)
 Avaliar a influência nas propriedades sensoriais
Metodologias de análises
1. Metodologias de análise
 Determinação de nitrogênio orgânico (Kjeldahl) (1ª UNIDADE)
 Presença de ligações peptídicas (Biureto)
 Absorção no UV a 280 nm (devido a Trp ,Tir e Fen)
 Método de Lowry (Reagente Folin - Ciocalteau)
 Capacidade de ligação de corantes (Bradford)
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
2. Método de biureto
 Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor
violeta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas
 Medida feita em um colorímetro ou espectrofotômetro
 Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a absorbância
a 540 nm
2. Método de biureto
Vantagens:
 Simples, rápido e barato
 Envolve uma reação com a ligação peptídica, determinando 
proteínas, ao contrário de Kjeldahl, que determina N total 
Desvantagens:
 Necessidade de uma curva analítica com padrão de proteína
 Baixa sensibilidade
 Possui muitos interferentes  Lipídeos, Lactose e amido
2. Método de biureto
Interferentes
ZAIA, et al. Química Nova, v. 21, n. 6, 1998
3. Absorção no Ultravioleta
 Princípio – A maioria das proteínas possui absorção UV em
280 nm devido à presença de aminoácidos aromáticos
(tirosina, triptofano, e fenilalanina)
 Inicialmente desenvolvido para leite e produtos lácteos, mas 
atualmente é utilizado para produtos cárneos e agrícolas
Leitura direta 
a 280 nm
3. Absorção no Ultravioleta
Vantagens:
 Simples, rápido e barato
 Não-destrutivo
Desvantagens:
 Baixa precisão  resultados dependem da concentração de 
três aminoácidos na proteína
 Amostras complexas  diversas substâncias absorvem no 
ultravioleta - interferentes
3. Absorção no Ultravioleta
Sistema de purificação de proteínas – AKTA Start
4. Método de Lowry (Folin-Ciocalteau)
 Princípio – Utiliza duas reações:
1) Reação do Cu2+ em condições alcalinas (Biureto),
2) Oxidação de aminoácidos aromáticos pelo reagente de Folin
(molibdato, tungstato e ácido fosfórico)
Desenvolvendo uma coloração azul.
Reação 2Reação 1
Leitura em 750 nm
4. Método de Lowry (Folin-Ciocalteau)
Vantagens:
 Alta sensibilidade -10 a 20x mais sensível que a determinação
por UV e 100x mais sensível que o método de biureto
Desvantagens:
 Muitos interferentes
 Intensidade da cor pode variar com a composição da proteína
 Destrói a amostra
 Lento
 Requer operações múltiplas e necessita de incubação entre a
adição dos reagentes
 Necessita de curva padrão com proteína conhecida
4. Método de Lowry (Folin-Ciocalteau)
Interferentes
ZAIA, et al. Química Nova, v. 21, n. 6, 1998
5. Método de Bradford
 Princípio - Interação entre o corante Azul de Coomassie
Brilhante G-250 e proteínas que contém aminoácidos de
cadeias laterais básicas ou aromáticas
 A interação entre a proteína de alto PM e o corante provoca o
deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica,
que absorve fortemente em 595 nm
5. Método de Bradford
Vantagens:
 Mais rápido, sensível e menor número de interferentes que o
método de Lowry
Desvantagens:
 Variação da absortividade específica para diferentes proteínas
 Limitações na reprodutibilidade devido ao grau de pureza
do corante A.C. G-250 que varia conforme a procedência
(padronização das condições de reação para cada lote)
5. Método de Bradford
Interferentes
ZAIA, et al. Química Nova, v. 21, n. 6, 1998
Curva de calibração
Curva de calibração
y = ax + b
Questão 2 (Apostila)
Em uma fermentação para produção de enzimas, foi utilizado o método
Lowry para a determinação das proteínas no caldo. Para a elaboração da
curva de calibração foi utilizando como padrão a albumina de soro bovino
diluído em diferentes concentrações, lida em espectrofotometro em
comprimento de onda de 750nm, calibrando-se com o branco. Após a
avaliação da curva de calibração, foi obtida a seguinte equação da reta. O caldo
a ser analisado foi diluído 15 vezes e após a diluição apresentou uma
absorbância média de 0,122, qual é a concentração de proteínas nesse caldo
em g/L. y = abs
x = [ ] de ptna (mg/mL)
y = 3,5242x +0,0189
0,122 = 3,5242x +0,0189
0,122 - 0,0189 = 3,5242x
0,1031 = 3,5242x
0,1031/3,5242 = x
x = 0,02925 (x15)
x = 0,438 mg/mL
Prática
Leite
Proteínas totais
Método de Biureto
Método de Bradford
Análise de proteínas pelo método de Biureto
1. DILUIÇÃO DA AMOSTRA (Leite):
 Realizar a diluição da amostra 1:25 (diluição 25x) 
0,4 mL do Leite + qsp H2O para 10 mL
2. REAÇÃO DE BIURETO
1mL da amotra dil. + 4 mL Reagente de Biureto
 Agitar o conteúdo dos tubos e incubar por 15 min em banho-
maria a 37ºC.
 Fazer a leitura em espectrofotômetro a 540 nm.
Tubos Água Amostra Reagente
Branco 1mL - 4mL
Amostra - 1mL 4mL
Análise de proteínas pelo método de Biureto
 Obter a absorbância da amostra e realizar o cálculo para 
quantificar a concentração de proteína na amostra, utilizando a 
equação:
 Obs. Multiplicar pelo fator de diluição da amostra (25) 
Y = 0,043x + 0,0108 
y = abs
x = [Ptn] g/L
Análise de proteínas pelo método de Bradford
1. DILUIÇÃO DA AMOSTRA (Leite):
 Realizar a diluição da amostra 1:40 (diluição 40x)
0,25 mL do Leite + qsp H2O para 10 mL
2. REAÇÃO DE BRADFORD
100 µL da amostra dil. + 3 mL Reag. de Bradford
 Agitar o conteúdo dos tubos e incubar por 15 min a temp.
ambiente.
 Fazer a leitura em espectrofotômetro a 595 nm.
Tubos Água Amostra Reagente
Branco 100 µL - 3 mL
Amostra - 100 µL 3 mL
Análise de proteínas pelo método de Bradford
 Obter a absorbância da amostra e realizar o cálculo para 
quantificar a concentração de proteína na amostra, utilizando a 
equação:
 Obs. Multiplicar pelo fator de diluição da amostra (40) 
y = 0,3225x + 0,0789
R² = 0,988
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 0.5 1 1.5 2
A
b
so
rb
ân
ci
a
[ ] de albumina g/L
CURVA PADRÃO DE ALBUMINA
Curva Bradford
Linear (Curva Bradford)
32 g/L de 
proteína
Bibliografia
 CECCHI, H.M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de
alimentos. 2ª edição rev. Campinas: Editora da UNICAMP,
2003.
 MELO FILHO, A.B.; VASCONCELOS, M.A.S. Química de
alimentos – Recife:UFRPE, 2011.
 NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de 
Lehninger. 6ª edição, Porto Alegre: Artmed, 2014.
 ZAIA, D.A.M.; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, Z. Determinação de
proteínas totais via espectrofometria: vantagens e
desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, v. 21, n.
6, São Paulo, 1998.
 ZENEBON, O.; PASCUET, N.S.;TIGLEA, P. Métodos físico-
químicos para análise de alimentos. Instituto Adolfo Lutz (São
Paulo).