Pratica de identificação de carboidratos modificado

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Cursos Práticos em Bioquímica 62
 
TEORIA DA PRÁTICA 
 
 
PROPRIEDADES QUÍMICAS 
DE GLICÍDEOS 
 
 
Diferentemente dos aminoácidos que apresentam reações específicas baseadas principalmente na natureza química de seu radical R, os glicídeos apresentam estruturas muito parecidas entre si o que torna quase impossível identificá-los de per se. 
Neste caso, o que se faz é caracterizar grupos de glicídeos utilizando suas propriedades químicas 
comuns. 
As reações utilizadas nesta prática estão baseadas principalmente em 2 dessas propriedades: 
 
Ÿ�Desidratação de glicídeos em presença de ácidos minerais fortes 
Ÿ�Poder redutor 
 
 
Desidratação de glicídeos em 
presença de ácidos minerais fortes 
 
Hexoses e pentoses colocadas nestas condições são desidratadas, respectivamente a 
hidroximetilfurfural e furfural; esses compostos são capazes de se condensar com substâncias 
fenólicas, com aminas aromáticas, tiocompostos, uréia, etc. Os complexos formados são, 
algumas vezes, coloridos e utilizados para a caracterização de certos grupos glicídicos. 
Neste caso, situam-se: 
 
Ÿ�Reação de Antrona 
Ÿ�Reação de Seliwanoff 
Ÿ�Reação de Bial 
 
Reação de Antrona 
 
Teste geral para glicídeos 
O reagente de Antrona contém antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor liberado pela 
diluição do H2SO4 é suficiente para que a reação ocorra. No caso de oligo e polissacarídeos, o 
H2SO4 atua como catalisador de hidrólise convertendo-se a monossacarídeos (hexoses e 
pentoses) e também como agente desidratante levando à formação de hidroximetilfurfural e 
furfural que, em presença de antranol, dão produtos de condensação coloridos. 
 
 
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Texto digitado
Reativo de MolishnullMostra teste positivo para: Todos os carboidratos. Os monossacarídeos produzem um teste positivo rápido. Dissacarídeos e polissacarídeos reagir mais lento.nullReação: O reagente desidrata pentoses à furfural e desidrata hexoses para formar 5-hidroximetil furfural. Os furfurais reagemnullcom alfa-naphthol presente no reagente de teste para produzir um produto púrpura .
Glicídeos 63
 
O
C
O
H
OH
H
H
OH
C +
+
C OH
HH
OH
H C
O OH
O
CH
OH
H H
C O H2O
hidroximetil
 furfural
antranol
composto verde azulado 
 
 
O hidroximetilfurfural proveniente da desidratação de hexoses produz uma substância de 
coloração verde azulada relativamente estável enquanto que o furfural proveniente da 
desidratação de pentoses fornece produto de cor análoga, mas que em alguns minutos se torna 
vermelho amarelada ou rubi. 
A exposição do hidroximetilfurfural a essas condições por um longo intervalo de tempo promove 
sua decomposição a ácido levulínico e ácido fórmico, o que redunda na formação de produtos de 
condensação escuros conhecidos como humina. 
Outras substâncias orgânicas produzem descolaração do reagente e aparecimento de uma cor 
marrom, fruto de sua decomposição. 
O teste de Antrona é muito sensível e pode ser usado, quando modificado, para a quantificação 
de glicídeos. 
 
Reação de Seliwanoff 
 
Teste de diferenciação entre aldoses e cetoses 
 
A reação é feita com resorcinol em meio de HCl, à quente. As cetohexoses dão um produto de 
coloração vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses correspondentes reagem 
mais lentamente. Durante o tempo em que as cetohexoses são desidratadas e reagem com o 
resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses fornecem apenas um produto de cor rosa pálido. 
 
 
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Cursos Práticos em Bioquímica 64
 
H2O2
OH
OHCOH
+
cetohexose hidroximetil
 furfural resorcinol
produto de coloração vermelha
 estrutura desconhecida
H
CH2OH
OH
HOH2C
O
H
OHH H H
O
HOH2C
H
 
 
 
O teste de Seliwanoff foi modificado de modo a ser utilizado para a quantificação. 
 
Reação de Bial 
 
Teste para a identificação de pentoses e certos ácidos urônicos* (galacturônico, glicurônico 
e outros) que se decompõem durante o aquecimento, em presença de H+, formando 
pentoses 
 
O reagente consiste de orcinol em meio de HCl concentrado e em presença de íons Fe3+. 
O furfural proveniente da desidratação de pentoses, quando aquecido em presença do reagente de 
Bial, fornece um produto de cor verde. O hidroximetilfurfural (hexoses) reage formando um 
produto de cor diferente que oscila do amarelo ao marrom. 
 
produto de coloração verde
 estrutura desconhecida
 orcinol
(5-hidroxi-1,3-
dihidroxibenzeno)
 furfuralpentose
+
OH
2 H2O
H
HO OH
H
OH
H
HO
CH3
C C
C C
HO
H COHH
O
HH
COH
H
 
 
 
O teste de Bial foi modificado de modo a permitir quantificar pentoses, trioses e o ácido 5-ceto-
aldônico**. As cetoheptoses fornecem produto de coloração púrpura, as cetohexoses e metilpentoses 
formam inicialmente um produto de cor laranja, que posteriormente, em repouso, precipita 
apresentando uma cor verde escura. 
 
* Ácidos urônicos - produtos de oxidação do grupo álcool primário dos glicídeos 
**Ácidos aldônicos - produtos de oxidação da carbonila aldeídica dos glicídeos. 
 
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Glicídeos 65
 
Poder Redutor 
 
Os açúcares contêm grupos aldeídos e cetonas capazes de reduzir sais de metais pesados; desses 
são mais usados os sais de Cu2+. 
O princípio fundamental de todos os procedimentos analíticos que utilizam Cu2+ é sua dissolução 
em meio alcalino, em presença de ácidos orgânicos - como o ácido cítrico e o ácido tartárico -
capazes de formar complexos. 
Também podem ser empregados outros ácidos orgânicos como EDTA, ácido lático, ácido 
trihidroxiglutárico ou um ácido sacárico. Ácidos sacáricos são o produto da oxidação da 
carbonila aldeídica e do grupamento álcool primário dos glicídeos, sendo portanto ácidos 
dicarboxílicos. 
A reação de formação do complexo ocorre, em geral, em meio fortemente alcalino e isto 
promove profundas modificações na estrutura do açúcar. 
Os açúcares de per se apresentam poder redutor diferente sobre o íon Cu2+; isto significa que dois 
tipos de hexoses, em uma mesma concentração, fornecem quantidades diferentes de óxido 
cuproso (produto final da redução). De qualquer forma, os métodos podem ser adaptados de 
modo a se tornarem reprodutíveis e a haver proporcionalidade entre a quantidade de Cu2O 
produzido e a concentração de glicídeo presente dentro de um certo limite (ou certa faixa de 
concentrações). 
A quantidade de íons cobre reduzida pelos diferentes glicídeos é função do pH, da temperatura, 
da concentração e dos tipos de glicídeos e íons orgânicos complexantes. 
Há diversos métodos para a determinação do teor de Cu2O como, por exemplo, gravimetria e 
colorimetria. No último caso, o Cu2O formado é dissolvido em excesso de reagente como 
fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsênio-molibdato, formando-se um complexo de cor azul. 
Este procedimento é muito adequado para a verificação de glicídeos em materiais biológicos. 
Dentre os testes baseados no poder redutor dos glicídeos, pode-se destacar os testes de Benedict 
e de Barfoed modificado. 
 
Teste de Benedict 
 
Teste geral para glicídeos redutores 
 
O reagente consiste de uma única solução onde estão presentes íons Cu2+, citrato e carbonato de 
sódio. 
A reação é complexa e influenciada por uma série de fatores podendo ser esquematizada por: 
 
Cu
2+
+ glicídio 
composto
 oxidado
Cu2O+
precipitado
 vermelho 
 
As transformações intermediárias sofridas pelo glicídeo não são completamente conhecidas, mas 
foram identificados produtos com ácidos metassacarínios e osonas, resultantes de reações de 
oxiredução intramoleculares e rearranjos. 
 
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osonaácido metassacarínioC
CH2OH
H O
O
CH2OH
H
H
OH
COOH
 
 
 
Teste de Barfoed modificado 
 
Teste de diferenciação entre monossacarídeos e dissacarídeos redutores. 
 
A reação é feita usando-se acetato de cobre em meio de ácido lático (reagente de Barfoed), a 
quente e por 30 segundos; o produto formado nesta primeira etapa é posteriormente revelado 
com solução de fosfomolibdato. 
Só os monossacarídeos formam produto de cor azul. 
Esta diferenciação pode ser explicada pelo fato de que, em meio ácido, a mutarrotação ocorre em 
velocidade cerca de 4000 vezes menor do que em meio alcalino. 
Dentro de um curto intervalo de tempo os monossacarídeos, devido a sua estrutura, têm maior 
reatividade e talvez formem o enediol (um dos possíveis responsáveis pelo poder redutor dos 
glicídeos) mais fácil e rapidamente que um dissacarídeo. 
A adição posterior do ácido fosfomolíbdico leva à formação de um complexo corado de cor azul 
intensa. 
+Cu2O composto oxidadoglicídio +Cu
2+
H3PO 4. MoO 312
complexo de cor azul de
 estrutura desconhecida 
 
Teste com Iodo 
 
Teste de identificação do amido 
 
O amido é composto de dois tipos de cadeia: a amilose e a amilopectina. 
Foi verificado que a amilose é capaz de formar com o I2 um complexo de inclusão de coloração 
azul. O grau de adsorção do I2, a partir de uma solução diluída de KI-I2, pela amilose nativa é de 
19-20%, enquanto que a amilopectina adsorve 0,5%. Para que a cor azul apareça é necessário 
que a amilose tenha no mínimo 40 resíduos (unidades) de glicose. 
Cadeias pequenas de amilose ou amilopectina também adsorvem o I2, só que é necessário usar 
soluções mais concentradas de KI-I2. 
 
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Glicídeos 67
O mecanismo da reação envolve a inclusão de um arranjo linear de poli KI-I2 na hélice da 
amilose. O I2 parece interagir através de valências secundárias; sabe-se que os íons I
- são 
necessários mas se desconhece a exata natureza do arranjo do poli KI-I2. 
A estimativa do teor de amilose presente no amido pode ser feita através da determinação do I2 
livre por titulação ou pela medida da intensidade de absorção do complexo azul num 
comprimento de onda, relacionando-se então com uma curva padrão. Infelizmente a cor azul 
depende não só do peso molecular da amilose, como também de sua forma de extração 
(impurezas presentes) e portanto este método tem aplicação restrita. 
A amilopectina dá uma cor violeta ou avermelhada com I2. As dextrinas (formadas a partir da 
ação da E-amilase sobre a amilopectina) são muito ramificadas e produzem uma cor vermelha 
assim como o glicogênio (composto apenas de amilopectina, ainda mais ramificada do que a 
existente no amido). As dextrinas de pequeno peso molecular não dão cor com o I2. A cor 
produzida pela reação do I2 com amilopectina é usada para indicar o grau de ramificação. 
 
REAÇÃO PROPRIEDADE REAGENTES APLICAÇÃO 
Antrona antrona + H2SO4 
concentrado 
identificação de 
glicídeos 
Seliwanoff 
resorcinol + HCl 
concentrado 
diferenciação entre 
cetoses e aldoses 
Bial 
desidratação 
com ácido forte 
seguido de 
condensação com 
derivado fenólico 
orcinol + HCl + FeCl3 
identificação de 
pentoses e certos 
ácidos urônicos 
Benedict 
CuSO4+ citrato e 
carbonato de sódio 
identificação de 
glicídeos redutores 
Barfoed 
modificado 
oxidação do 
glicídeo com íons 
Cu2+ em meio 
alcalino ou ácido 1)CuAc2 + ác. lático 
2)ácido fosfomolíbdico
diferenciação entre 
mono e 
dissacarídeos 
redutores 
Iodo 
formação de 
complexo de 
inclusão com a 
amilose 
I2 + KI (Lugol) 
identificação do 
amido 
 
 
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ROTEIRO DA PRÁTICA 
 
 
REAÇÕES QUÍMICAS DE GLICÍDEOS 
 
 
 
MATERIAL 
 
Ÿ�soluções de glicídeos na concentração 0,1 M 
Ÿ�suspensões de dextrina 0,5% 
Ÿ�carboximetilcelulose (CMC) 0,5% 
Ÿ�agar 0,5% 
Ÿ�amido 0,5% 
Ÿ�ácido poligalacturônico 0,5% 
Ÿ�solução de furfural 2,3 Pg/mL 
Ÿ�reagente de Antrona: Antrona em H2SO4 concentrado 
Ÿ�reagente de Bial: Orcinol em HCl concentrado + Fe Cl3 
Ÿ�reagente de Seliwanoff: resorcinol em HCl concentrado 
Ÿ�reagente de Benedict:CuSO4 em meio alcalino 
Ÿ�reagente de Barfoed modificado: CuSO4 em meio levemente ácido 
Ÿ�Solução de Lugol: KI-I2- 
Ÿ�banho-maria a 100oC 
 
 
OBJETIVO 
 
Caracterizar grupos de glicídeos a partir de suas propriedades químicas 
 
 
PROCEDIMENTO 
 
Teste de Antrona 
Ÿ�Em tubos de ensaio colocar 0,2 mL das soluções a serem testadas. 
Ÿ�Adicionar CUIDADOSAMENTE 1 mL do reagente de Antrona. 
Ÿ�Fazer o teste com soluções de glicose 0,1 M, sacarose 0,1 M, ácido glutâmico 
0,1 M, amido 0,5% e CMC 0,5%. 
Ÿ�Fazer um branco de reação com 0,2 mL de água destilada. 
 
A reação é praticamente imediata e o teste é considerado positivo se apresentar cor verde intensa. 
 
OBSERVAR: 
Ÿ�Com que glicídeo aparece mais rapidamente a cor verde. 
Ÿ�Em que tubo a coloração verde é mais intensa. 
Ÿ�O aquecimento provocado pela diluição do H2SO4 na água tocando 
cuidadosamente a base do tubo. 
Anotar os resultados em tabela anexa. 
 
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Marise
Texto digitado
(Glicose, frutose, sacarose, lactose e amido)
Marise
Riscado
Marise
Riscado
Marise
Riscado
Marise
Riscado
Marise
Riscado
Marise
Riscado
Marise
Riscado
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Texto digitado
Reagente de Molish
Marise
Riscado
Marise
Riscado
Marise
Riscado
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Texto digitado
Dois ml de uma solução de amostra é colocada num tubo de ensaio. Duas gotas de reagente de Molisch (uma solução de -napthol em etanol a 95%) é adicionado. A solução é então vertida lentamente para um tubo contendo dois ml de ácido sulfúrico concentrado, de modo que formam duas camadas. Um teste positivo é indicado pela formação de um produto roxo na interface das duas camadas (verter a solução vagarosamente). Fazer um branco com água
Marise
Texto digitado
Procedimento do Molish
Glicídeos 69
 
Teste de Seliwanoff 
Ÿ�Em tubos de ensaio colocar 0,2 mL das soluções a serem testadas. 
Ÿ�Adicionar 1 mL do reagente de Seliwanoff. 
Ÿ�Aquecer em banho-maria a 100 oC por 3 minutos. 
Ÿ�Fazer o teste com soluções de glicose 0,1 M, frutose 0,1 M, sacarose 0,1 M, 
lactose 0,1 M e CMC 0,5%. 
Ÿ�Fazer um branco de reação com 0,2 mL de água destilada. 
No teste é considerado positivo se apresentar cor vermelha. 
 
OBSERVAR: 
Ÿ�Em que tubos a cor aparece e o tempo necessário para que isto ocorra. 
Ÿ�A coloração obtida nos outros tubos. 
Anotar os resultados em tabela anexa. 
 
Teste de Bial 
Ÿ�Em tubos de ensaio colocar 0,5 mL das soluções a serem testadas 
Ÿ�Adicionar 1 mL do reagente de Bial. 
Ÿ�Aquecer em banho-maria à 100 ºC por 2 minutos. 
Ÿ�Fazer o teste com soluções de glicose 0,1 M, arabinose 0,1 M, ácido 
poligalacturônico 0,5% e furfural 2,3 Pg/mL. 
Ÿ�Fazer um branco de reação com 0,5 mL de água destilada. 
No teste é considerado positivo se apresentar cor verde ou verde azulada 
 
OBSERVAR: 
Ÿ�Em que tubo há o aparecimento imediato da cor verde. 
Ÿ�A coloração obtida nos outros tubos. 
Anotar os resultados em tabela anexa. 
 
Teste de Benedict 
Ÿ�Em tubos de ensaio colocar 0,4 mL das soluções a serem testadas 
Ÿ�Adicionar 1 mL do reagente de Benedict. 
Ÿ�Aquecer em banho-maria a 100 ºC por 5 minutos. 
Ÿ�Fazer o teste com soluções de glicose 0,1 M, frutose 0,1 M, sacarose 0,1 M, 
lactose 0,1 M e amido 0,5%. 
Ÿ�Fazer um branco de reação com 0,4 mL de água destilada 
No teste é considerado positivo se houver formação de precipitado vermelho. 
 
OBSERVAR: 
Ÿ�Em que tubo(s) verifica-se a formação do precipitado. 
Ÿ�Em que tubo(s) não há formação do precipitado. 
Anotar os resultados em tabela anexa. 
 
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Riscado
Marise
RiscadoMarise
Riscado
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Teste de Barfoed modificado 
Ÿ�Em tubos de ensaio colocar 0,2 mL das soluções a serem testadas. 
Ÿ�Adicionar 1 mL do reagente de Barfoed. 
Ÿ�Aquecer em banho-maria à 100 º 
Ÿ�C por 30 segundos. 
Ÿ�Resfriar. 
Ÿ�Adicionar 0,5 mL do reagente fosfomolíbdico. 
Ÿ�Fazer o teste com soluções de glicose 0,1 M, lactose 0,1 M e sacarose 0,1 M. 
Ÿ�Fazer um branco de reação com 0,5 mL de água destilada. 
No teste é considerado positivo quando apresenta cor azul intensa. 
 
OBSERVAR: 
Ÿ�Em que tubo(s) ocorre o desenvolvimento da cor azul intensa. 
Ÿ�Em que tubo(s) ocorre a coloração azul pálida. 
Anotar os resultados em tabela anexa. 
 
Teste do Iodo 
Ÿ�Em tubos de ensaio colocar 2 mL das soluções a serem testadas. 
Ÿ�Adicionar 0,1 mL do reagente de Lugol (I2+ I�). 
Ÿ�Aquecer em banho-maria à 100 ºC por 2 minutos. 
Ÿ�Fazer o teste com suspensões de amido 0,5%, dextrina 0,5%, CMC 0,5% e agar 
0,5%. 
Ÿ�Fazer um branco de reação com 2 mL de água destilada. 
No teste é considerado positivo se apresentar cor verde ou verde azulada 
 
OBSERVAR: 
Ÿ�Em que tubo aparece o complexo de cor azul. 
Ÿ�Qual(is) a(s) cor(es) que aparece(m) nos outros tubos. 
 
Anotar os resultados em tabela anexa. 
 
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Marise
Riscado
Marise
Riscado
Glicídeos 71
 
TABELA DE RESULTADOS 
 
TESTE 
SUBSTÂNCIAS 
TESTADAS 
OBSERVAÇÕES 
glicose 
sacarose 
amido 
CMC 
ANTRONA 
ácido glutâmico 
glicose 
frutose 
sacarose 
lactose 
SELIWANOFF 
CMC 
arabinose 
ácido poligalacturônico 
glicose 
BIAL 
furfural 
sacarose 
lactose 
amido 
glicose 
BENEDICT 
frutose 
lactose 
sacarose BARFOED modificado 
glicose 
CMC 
agar 
amido 
IODO 
dextrina 
 
 
 
 
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ROTEIRO DE PRÁTICA 
 
 
APLICAÇÃO DAS REAÇÕES QUÍMICAS DE GLICÍDEOS 
 
 
MATERIAL 
 
Ÿ�Soluções padrão e reagentes, como descrito na prática de Reações Químicas de 
Glicídeos 
Ÿ�banho maria a 100oC 
Ÿ�liquidificador 
Ÿ�espremedor de frutas 
Ÿ�legumes 
Ÿ�frutas 
Ÿ�substâncias dietéticas ( bebidas, balas, por exemplo.) 
Ÿ�adoçantes 
 
 
OBJETIVO 
 
Determinar a presença de glicídeos em diferentes tipos de alimentos. 
Caracterizar, quando possível, os glicídeos no material analisado. 
 
 
PROCEDIMENTO 
 
Dependendo do tipo de alimento a ser testado será necessária uma etapa de preparo: 
frutas - trituração ou extração do suco. 
materiais sólidos - trituração. 
Dispondo-se do material sólido (triturado), do extrato, do suco e da solução (adoçantes, bebidas) 
procede-se conforme o roteiro de prática de Reações Químicas de Glicídeos. 
As alíquotas a serem usadas, bem como o volume dos reagentes empregados podem ser 
diferentes dos descritos no roteiro da prática de Reações Químicas de Glicídeos 
Os resultados obtidos devem ser colocados na tabela a seguir. 
 
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Marise
Texto digitado
trazer as amostras prontas no dia do ensaio!!!
Glicídeos 73
 
Tipo de 
Alimento 
Nome do 
Alimento 
Teste da 
Antrona 
Teste de 
Seliwanoff 
Teste de 
Bial 
Teste de 
Benedict 
Teste de 
Barfoed 
Teste do 
Iodo 
 
 
Frutas 
 
 
 
 
Legumes 
 
 
 
 
Bebidas 
 
 
 
 
Dietéticos 
 
 
 
Compare os resultados encontrados para os diferentes grupos de alimentos quanto ao teor e tipo 
de glicídeo presente 
 
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Marise
Riscado
Marise
Riscado
Marise
Retângulo
Marise
Linha poligonal
Marise
Texto digitado
sua amostra
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ESTUDO DIRIGIDO 
 
 
1) Qual o teste a ser feito para demonstrar a presença de glicídeos em materiais 
biológicos? Justifique. 
2) Por que não é conveniente realizar o teste de iodo com uma solução de amido 
aquecida? 
3) Após extração de lipídeos com metanol e posterior precipitação de proteínas 
(caseína) com TCA 10%, que teste deveria ser feito no filtrado com o objetivo de 
evidenciar a presença de glicídeo em uma amostra de leite de vaca? Com os testes 
realizados na prática, seria possível provar que este glicídeo é lactose? Por que? 
4) Que testes você faria com um dissacarídeo para definir as seguintes características: 
a) poder redutor 
b) se pelo menos um dos monômeros constituintes é uma cetose 
c) se pelo menos um dos monômeros constituintes é uma pentose 
5) Identifique dentre os dissacarídeos abaixo os que dão testes positivo com o reagente 
de Benedict: 
maltose: glicose (D-1,4) glicose 
lactose: galactose (E-1,4) glicose 
sacarose: glicose (E-1,2) frutose 
trealose: glicose (D-1,1) trealose 
6) Duas aldohexoses diferem apenas na configuração do carbono 5, de modo que em 
uma a hidroxila pode ser representada à direita e na outra à esquerda. Podemos 
dizer que estas oses são epímeros? 
7) Dos glicídeos abaixo, assinale aquele que satisfaz a todas as seguintes 
condições: 
1- Teste de Benedict positivo A ( ) sacarose 
2- Teste de Barfoed positivo B ( ) glicose 
3- Teste de Seliwanoff negativo C ( ) arabinose 
4- Teste de Bial positivo D ( ) maltose 
 
 
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