100 ROTEIRO CONTAGEM PADRÃO

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FACULDADE MAURÍCIO DE NASSSAU
CURSO DE NUTRIÇÃO
Microbiologia dos Alimentos
Profª. Helena Taina Diniz Silva
Monitores: Rayanny e Wagner
ROTEIRO DE AULA PRÁTICA
AULA 3: CONTAGEM PADRÃO DE MICRORGANISMOS
 1 Descrição geral 
A contagem total de microrganismos é o método mais utilizado como indicador geral de populações bacterianas em alimentos, sendo utilizada para se obter informações gerais sobre a qualidade do produto, qualidade das matérias-primas, condições de processamento, manipulação e vida de prateleira. Sua presença em grande número indica: matérias-primas excessivamente contaminadas; limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas; higiene inadequada na produção; condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção ou a conservação dos alimentos, ou uma combinação destas circunstâncias. A contagem pode ser feita utilizando-se as técnicas de plaqueamento em profundidade (pour plate), com exceção da contagem de bolores e leveduras, superfície (spread plate) e esgotamento.
 2 Materiais necessários (por grupo)
Acessórios 
Pêra (1)
Espátula (1)
Pinça (1)
Suporte para os tubos (1)
Bico de Bunsen (1)
Alça bacteriológica (1)
Caneta para CD (1)
Vidraria 
Pipetas graduadas (1 mL) estéreis (3)
Erlenmeyer com 90 mL de diluente (água peptonada) (1)
Tubos com 9 ml de diluente (água peptonada) (3)
Placas de Petri (3 de cada meio)
Meios de cultura 
Água peptonada 
Agar Mueller Hinton (bactérias aeróbias mesófilas) 
Agar Potato Dextrose (bolores e leveduras) 
Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) (enterobactérias) 
Equipamentos 
Autoclave 
Estufa de esterilização e secagem (180 ºC) 
Balança Semi-analítica 
Estufa bacteriológica 
3 Procedimento 
1º passo: Deve-se higienizar a bancada e dispor o material; 
2º passo: Codificar as placas e os frascos de diluição; 
3.1 Obtenção das diluições seriadas (ou decimais) 
1º passo: Pesar a amostra (10 g) no erlenmeyer contendo o diluente esterilizado e homogeneizar por 2-3 minutos, no caso de amostras sólidas. Essa suspensão corresponde à diluição 10-1;
2º passo: Com auxílio de uma pipeta e uma pera, transferir 1 mL para um frasco contendo 9 mL de diluente, obtendo-se a diluição 10-2; 
3º passo: Repetir o mesmo procedimento para obter a diluição 10-3.
Amostra sólida 
 10-1 1 ml 10-2 1 ml 10-3 1 ml 10-4 ... 
10 g de amostra + 
90 mL diluente 9 ml 9 ml 9 ml
Amostra líquida 
 100 1 ml 10-1 1 ml 10-2 1 ml 10-3 ... 
≈ 100 mL de amostra 
 9 ml 9 ml 9 ml
3.2 Plaqueamento 
1º passo: De cada diluição preparada e homogeneizada, transferir 1 mL ou 0,1 mL (pipeta) ou 0,01 mL (alça bacteriológica) para as placas de Petri; 
2º passo: No caso da técnica por profundidade, verter em cada placa 15-20 mL do meio de cultura esterilizado e esfriado a aproximadamente 50 ºC e homogeneizar com movimentos em forma de oito ou circular; 
3º passo: Deixar as placas em repouso sobre a bancada até a completa absorção do inóculo ou solidificação do meio; 
4º passo: Juntar as placas em sentido invertido e incubar as placas de bactérias mesófilas e enterobactérias a 35±2°C por 24-48 horas e de bolores e leveduras a 25±2°C por 3-5 dias (as placas de bolores não podem ser invertidas). 
5º passo: Após o período de incubação, realizar a contagem das colônias.
4 Leitura 
Selecionar uma placa com 15 a 150 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma caneta de CD em um contador de colônias. Caso tenham sido utilizadas duas placas por diluição (duplicata) considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata.
5 Resultado 
Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula na apresentação dos resultados. Para calcular o número de UFC/g ou ml, multiplicar o número de colônias pelo fator e pelo inverso da diluição. Para a interpretação dos resultados deve-se pesquisar nas normas existentes para o alimento avaliado quanto aos valores de referência.
Resultado (UFC/g ou mL) = nº de colônias x F x diluição (inverso)
F = 10 (se for inoculado 0,1 mL)
F = 100 (se for inoculado 0,01 mL)
Referências
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. E. A. Manual de métodos de análises microbiológicas de alimentos. São Paulo: Varela, 2007. 552p.