Teste das enzimas fosfatase alcalina e peroxidase no leite

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
CAL 360 – CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS
TESTE DAS ENZIMAS FOSFATASE ALCALINA E PEROXIDASE NO LEITE
FINALIDADE: Verificar a eficiência da pasteurização do leite (funcionamento correto do binômio tempo/temperatura).
1 - FOSFATASE ALCALINA (pH ótimo = 9,6): catalisa a hidrólise de fosfatos orgânicos (ésteres) liberando ácido fosfórico e álcool. É encontrada adsorvida à membrana lipoprotéica do glóbulo de gordura em forma de partículas. Dessa forma, está presente em maiores concentrações no creme e manteiga. 
A ausência desta enzima no leite indica tratamento térmico correspondente, pelo menos, ao da pasteurização (lenta ou rápida) e apesar disso, não assegura a ausência de microrganismos patogênicos no leite, devido a uma possível recontaminação.
Os binômios (tempo/temperatura) responsáveis pela inativação da fosfatase alcalina encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1 - Inativação da fosfatase alcalina pelo calor
	Temperatura (ºC)
	Tempo
	62
	15 - 20 minutos
	70
	3 minutos
	71,5
	15 - 20 segundos
	75
	instantâneo
Reação envolvendo a fosfatase alcalina como catalisadora:
			 								 
ON2 O P O Na 	 HO		 NO2 + HO P ONa 
 p-nitrofenil fosfato dissódico		 nitrofenol		 ortofosfato
							 (colorido)		 dissódico
METODOLOGIA:
1) Solução A:
- Colocar uma pastilha de PHOS-PHAX (fenil fosfato dissódico) em um béquer de 50 mL;
- Triturar a pastilha com ajuda de um bastão de vidro e dissolvê-la completamente em água destilada;
- Transferir para um balão volumétrico de 50 mL e completar o volume.
2) Solução B:
- Colocar uma pastilha de INDO-PHAX (2,6 dicloroquimona clorimida, conhecido como CQC) em um béquer de 50 mL;
- Triturar a pastilha com ajuda de um bastão de vidro e dissolvê-la completamente em 5 mL de álcool metílico;
- Transferir para um frasco conta-gotas;
Técnica:
- Colocar 5 mL da solução A no tubo de ensaio;
- Adicionar 0,5 mL da amostra a ser analisada e misturar, invertendo o tubo várias vezes;
- Incubar por 30 minutos em banho-maria a 37ºC;
- Remover do banho-maria, adicionar 6 gotas da solução B e agitar bem;
- Deixar descansar por cerca de 2 minutos, para desenvolvimento da cor.
Resultados:
- Positivo (leite cru): cor azul intensa;
- Negativo (leite pasteurizado): cor acinzentada.
2 - PEROXIDASE OU LACTOPEROXIDASE (pH ótimo = 7,0): Catalisa a transferência de hidrogênio de substâncias doadoras, a exemplo das aminas aromáticas, guaiacol, ácido ascórbico, iodeto e nitrito, oxidando-as a receptores (peróxido) do tipo H2O2.
Esta enzima é usada como indicadora da intensidade do tratamento térmico dado ao leite, não sendo destruída pela pasteurização lenta ou rápida, mas sim a temperaturas mais elevadas, conforme disposto na Tabela 2. 
Tabela 2 - Inativação da peroxidase pelo calor
	Temperatura (ºC)
	Tempo
	70
	55 minutos
	75
	15 – 19 minutos
	80
	25 segundos
	82
	15 – 20 segundos
Este aquecimento elevado é prejudicial ao leite, podendo modificar as suas propriedades nutritivas, ou seja, diminui excessivamente o teor de vitaminas e altera as propriedades de proteínas.
Reação envolvendo a peroxidase como catalisadora:
			 								 
 4 H2O2 + 4							O O	 
											+ 8 H2O
 
								O	O
peróxido de guaiacol		 tetra guaiacol água
 hidrogênio (incolor)	 (cor rósea salmão)
METODOLOGIA:
- Colocar em um tubo de ensaio 10 mL da amostra de leite a 40ºC aproximadamente;
- Adicionar 10 a 15 gotas de uma solução de guaiacol alcoólico a 2%;
- Adicionar de 3 a 4 gotas de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) a 10 volumes e misturar.
OBS.: a acidez do leite acima de 50ºD destrói a peroxidase, enquanto que a adição de bicarbonato provoca reação sempre positiva.
Resultados:
- Positivo (coloração rósea salmão): leite cru ou pasteurizado (enzima ativa);
- Negativo (coloração branca): leite aquecido acima de 80ºC (enzima inativa).
		Associando os resultados dos dois testes, podemos chegar às seguintes conclusões, de acordo com o Quadro 1.
Quadro 1 – Conclusões dos testes de fosfatase alcalina e peroxidase no leite
	 Conclusões
	
	Leite cru ou mal pasteurizado
	Leite pasteurizado corretamente
	Leite superaquecido
	Fosfatase alcalina
	+
	-
	-
	Peroxidase
	+
	+
	-
O
O
Na
ONa
E
OCH3
OH
E
OCH3
OCH3
OCH3
OCH3
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