B03 e 04 Poder Redutor dos Glicídios

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UERJ
 INSTITUTO DE QUÍMICA
 DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
 BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL
Professora: Márcia Monteiro Machado Gonçalves
Prática n° 3 e 4: Dosagem de Glicídios Redutores (GR) – Método de Nelson e Dosagem de Glicídios Redutores Totais (GRT)
OBJETIVO
Elaborar uma curva padrão para determinação da concentração de glicídios redutores presentes numa amostra.
Determinar a concentração de GR e GTRT presentes no caldo de cana de açúcar e a concentração de GRT na solução padrão de sacarose.
MATERIAL UTILIZADO
Vidraria: Balão volumétrico, erlenmeyer, becher, pipetas de 1mL, Tubos de Folin Wu.
Reagentes: Nelson A, Nelson B, Nelson C.
Soluções: Padrão de glicose (1%), padrão de sacarose (20%) e caldo de casa de açúcar.
Espectrofotômetro
PROCEDIMENTOS
Prática n° 3: Dosagem de Glicídios Redutores (GR) – Método de Nelson
3.1. Curva Padrão.
Preparou-se uma solução padrão de glicose de 20mg/100ml. Adicionou-se aos tubos de Folin-Wu 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 mL da solução padrão de glicose de 20 mg/100mL e completou-se para 1,0mL com água destilada. Em seguida, adicionou-se em cada tubo 1,0 mL da mistura dos reagentes Nelson A e Nelson B (24 mL de Nelson A + 1,0 mL de Nelson B) e aqueceu-se em banho-maria em ebulição por 20 minutos. Retirou-se do banho-maria, resfriou-se os tubos em água corrente, adicionou-se 1,0 mL do reagente Nelson C e agitou-se até parar de espumar. Completou-se o volume para 25 mL com água destilada e homogeneizou-se para poder ler-se as absorbâncias em espectrofotômetro a 540 nm, tomando-se como referência a solução padrão de glicose 20 mg/mL de 0 ml.
3.2. Determinação de GR no caldo de cana de açúcar.
Diluiu-se o caldo de cana nas proporções 1:50, 1:100 e 1:250, adicionou-se 1,0 mL de casa caldo diluído aos tubos de Folin Wu e fez-se o mesmo procedimento que foi feito com as soluções de glicose com os reagente Nelson A, B e C.
Prática n° 4: Dosagem de Glicídios Redutores Totais (GRT)
3.3. Hidrólise ácida da solução padrão de sacarose e do caldo de cana de açúcar:
Colocou-se em erlenmeyer de 250mL, 20mL de amostra e 30mL de água destilada e depois levou-se a banho-maria na temperatura de 65ºC. Quando a temperatura de 65ºC foi alcançada, adicionou-se 10 mL de HCl 6,2N e foi feita a homogeneização. O erlenmeyer foi retirado do banho e feito isso, foi necessário esperar 30 minutos para poder transferir o hidrolisado para um balão de 500mL. O volume do mesmo foi completado com água destilada. Pipetou-se 10mL da solução do hidrolisado para um balão de 500mL, e o mesmo foi neutralizado com 2,0mL de NaOH 0,62N e o volume foi completado até alcançar 500mL.
 
3.4. Determinação de GR nos hidrolisados e no caldo de cana de açúcar in natura:
O caldo de cana foi diluído in natura na proporção de 1:100. Foram adicionados aos tubos de Folin Wu 1mL de cada amostra (duplicata) e 1mL de água destilada (branco). Foi adicionado 1 mL da mistura dos reagentes Nelson A e Nelson B (24mL de Nelson A + 1,0mL de Nelson B) em todos os tubos. O sistema foi aquecido em banho-maria em ebulição por 20 minutos. Feito isso, os tubos foram resfriados em água corrente. Então, foi adicionado 1,0mL do reagente Nelson C. Os tubos foram agitados até pararem de espumar e o volume foi completado até chegar 25mL com água destilada e foi feita a homogeneização. Foi realizada a leitura das absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540ηm, zerando o aparelho com o branco.
3.5 Composição dos reagentes.
Nelson A:
Na2CO3 anidro 	25 g/L
Tartarato de K 	25 g/L
NaHCO3 	20 g/L
Na2SO4 	200 g/L
Nelson B:
CuSO4 . 5 H2O 	150 g/L (em água destilada acidificada com H2SO4 – 20 gotas)
Nelson C:
Molibdato de Amônio 	50 g/L
H2SO4 concentrado	42 mL/L
NaHAsO4 . 7 H2O 	6 g/L
RESULTADOS 
4.1. Curva Padrão
Cálculos da diluição:
C0 = 20 x 0,0 / 100 = 0,00 mg		Onde Ci = Concentração de cada diluição
C1 = 20 x 0,2 / 100 = 0,04 mg
C2 = 20 x 0,4 / 100 = 0,08 mg
C3 = 20 x 0,6 / 100 = 0,12 mg
C4 = 20 x 0,8 / 100 = 0,16 mg
C5 = 20 x 1,0 / 100 = 0,20 mg
Na tabela 01, encontram-se a leitura das absorbâncias em relação a cada concentração feita após a diluição a 540 nm a partir de uma solução padrão de glicose 20 mg/100mL.
Tabela 01: Leitura das absorbâncias - glicose 
	[glicose] (mg/mL)
	Absorbâncias em 540 nm
	0
	0
	0,04
	0,035
	0,08
	0,060
	0,12
	0,100
	0,16
	0,145
	0,20
	0,165
A partir dos valores da tabela 01, pode-se construir o gráfico 01: absorbância x Concentração, uma curva padrão de comprimento de onda 570 nm.
Gráfico 01: Curva padrão de 570 nm: Absorbância x Concentração
A partir do gráfico 01, obteve-se a equação para a absorbância:
 Abs = 0,8625C - 0,0025			(1)
4.2. Determinação de GR no caldo de cana de açúcar.
Na tabela 02, encontram-se a leitura das absorbâncias em relação a cada concentração feita após a diluição da cana de açúcar a 540 nm.
Tabela 02: Leitura das absorbâncias – caldo de cana 
	Diluições do caldo de cana
	Absorbâncias em 540 nm
	1:50
	0,480
	1:100
	0,140
	1:250
	0,045
A partir dos dados da tabela 01 e da equação 01 determinou-se a concentrações de GR no caldo de cana.
Diluição 1:50
Abs = 0,8625C - 0,0025
0,480 = 0,8625C - 0,0025
C = 0,5594 mg/mL
GR = 0,5594 x 50 = 27,97 mg/mL
27,97 mg ------ 1 mL			
 x mg ------ 100 mL		x = 2797 mg/100 mL
Concentração de GR no caldo de cana = 2,797 g/100 mL
Diluição 1:100
Abs = 0,8625C - 0,0025
0,140 = 0,8625C - 0,0025
C = 0,1652 mg/mL
GR = 0,1652 x 100 = 16,52 mg/mL
16,52 mg ----- 1 mL
 x mg ----- 100 mL		x = 1652 mg/100mL
Concentração de GR no caldo de cana = 1,652 g/100mL
Diluição 1:250
Abs = 0,8625C - 0,0025
0,045 = 0,8625C - 0,0025
C = 0,0551 mg/mL
GR = 0,0551 x 250 = 13,775 mg/mL
13,775 mg ----- 1 mL
 x mg ----- 100 mL		x = 1377,5 mg/mL
Concentração de GR no caldo de cana = 1,3775 g/100mL
 4.3.Valores de absorbância na Prática n° 4 
Na tabela 03, encontram-se a leitura das absorbâncias em relação a cada concentração feita após a diluição a 540 nm para a solução padrão de sacarose, caldo de cana de açúcar hidrolisado e caldo de cana de açúcar.
Tabela 03: Leitura das absorbâncias – padrão sacarose e caldo de cana natural e hidrolisado
	
Amostra
	
Absorbâncias a 540 nm
	Solução padrão de sacarose
	0,260
	Solução padrão de sacarose
	0,290
	Caldo de cana de açúcar
	0,270
	Caldo de cana de açúcar
	0,275
	Caldo de cana de açúcar hidrolisado
	0,295
	Caldo de cana de açúcar hidrolisado
	0,285
4.4. Determinação da concentração de GRT na solução de sacarose e da eficiência da hidrólise:
4.4.1. Determinação da concentração de GRT
Abs = 0,260 + 0,290 / 2 = 0,275
Abs = 0,8625C – 0,0025
0,275 = 0,8625C – 0,0025
C = 0,3217 mg/mL
[GRT] = 0,3217 x 1250 = 402,17 mg/mL
402,17 mg ----- 1 mL
 x mg ----- 100 mL		x = 40217 mg/100mL = 40,22 g/100 mL
[GRT] na solução padrão de sacarose = 40,22 g / 100mL
4.4.2. Determinação da eficiência da hidrólise
[sacarose] = GRT x MM(glicose + frutose)
		 MM(sacarose)
[sacarose] = GRT x (342/360) = GRT x (0,95)
[sacarose] = 40,22 x 0,95 = 37 g/100mL
20 g ----- 100%
37 g ----- x		x = 185 %
4.5. Determinação da concentração de GR no caldo de cana de açúcar
Abs = 0,270 + 0,275 / 2 = 0,2725 
Abs = 0,8625C – 0,0025
0,2725 = 0,8625C – 0,0025
C = 0,3188 mg/mL
[GRT] = 0,3188 x 100 = 31,88 mg/mL
31,88 mg ----- 1 mL
 x mg ----- 100 mL		x = 3188 mg/100mL = 3,19 g/100mL
[GR] no caldo de cana = 3,19 g/100mL
4.6. Determinação da concentração de GRT no caldo de cana de açúcar
Abs = 0,295 + 0,285 / 2 = 0,290
Abs = 0,8625C – 0,0025
0,290 = 0,8625C – 0,0025
C = 0,3391mg/mL
[GRT] = 0,3391 x 1250 = 423,91 mg/mL
423,91 mg ----- 1 mL
 x mg ----- 100 mL		x = 42391 mg/100mL = 42,39 g/100mL
[GRT] no caldo de cana hidrolisado = 42,39 g/100mL
4.7. Determinação da concentração de sacarose no caldo de cana de açúcar
[sacarose] = ( [GRT] - [GR] ) x (342 /360)
[sacarose] = (42,39 – 3,19) x (0,95)
[sacarose] = 37,24 g/100mL
CONCLUSÕES
Através do método de Nelson obtivemos a concentração de glicídios redutores no caldo de cana. O valor de GR no caldo de cana obtido através das três diluições era para ser o mesmo, mas devido a erros experimentais no preparo das diluições, erros de pipetagem, entre outros, houve variação nos resultados obtidos.
A porcentagem da eficiência da hidrólise ácida da solução padrão de sacarose encontrada, de acordo com os cálculos, foi de 1855%, um valor estranho, porque não seria possível hidrolisar além de 100%. No entanto, não havia sacarose disponível na aula para efetuar tal reação, logo, acredito que tal erro tenha ocorrido de acordo com algum problema na solução que já se encontrava pronta na aula que foi a utilizada para a leitura no espectrofotômetro (ao invés de ser uma solução de 20% de sacarose, poderia ser uma de 40% aparentemente). A concentração de GRT na solução padrão de sacarose encontrada foi de 40,22 g/100mL. O uso dos reagentes Nelson A, B e C diferentes do que foram utilizados para a curva padrão também pode ser uma explicação para o valor de 185%. A concentração de GRT obtida no caldo de cana foi de 42,39 g/100mL. A concentração de GR no mesmo foi de 3,19 g/100mL. Logo, a concentração de sacarose no caldo de cana foi de 37,24 g/100mL.