Apostila - Análise Microbiológica de Água

Prévia do material em texto

1 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO 
INSTITUTO DE QUÍMICA 
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUÍMICOS 
APOSTILA DE BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
Análise Microbiológica de Água 
 
 
 
 
 
EDMAR DAS MERCÊS PENHA 
MÁRCIA MONTEIRO MACHADO GONÇALVES 
 
 
 
 
 
2015 
2 
 
I- Introdução 
Água estéril não é encontrada na Natureza. Ela recebe sua flora microbiana das mais variadas 
fontes: ar, solo, águas residuárias, resíduos orgânicos, plantas, animais mortos, etc. Isto 
significa que a água pode conter micro-organismos de várias espécies, patogênicas ou não. O 
numero de espécies presentes depende da fonte contaminante. 
A análise microbiológica consiste na pesquisa do chamado “grupo coliforme” que, quando 
presente, evidencia uma possível contaminação fecal. As principais características do grupo 
coliforme são: bastonetes Gram-negativos, não esporulados, aeróbios ou anaeróbios 
facultativos, que não são inibidos por sais biliares ou pelo corante verde brilhante e são 
capazes de fermentar lactose com produção de aldeído, ácido e gás dentro de 48h a 35oC. O 
grupo inclui tanto espécies de bactérias originárias do trato gastrintestinal de humanos e 
outros animais de sangue quente, como também espécies não entéricas. Por esse motivo, a 
presença de bactérias do grupo coliforme é menos representativa como indicação da 
contaminação fecal, do que a enumeração de coliformes fecais ou Escherichia coli. Embora a 
presença do grupo coliforme em amostras de água seja considerada uma indicação de 
contaminação. 
O grupo de coliformes fecais representa os membros do grupo coliforme capazes de fermentar 
a lactose com produção de gás, em 24h a 44,5oC. Esta definição teve como objetivo selecionar 
os coliformes do trato gastrintestinal. Atualmente sabe-se que o grupo de coliformes fecais 
inclui pelo menos três gêneros: Escherichia, Enterobacter e Klebsiella. Entretanto, dois 
desses gêneros (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem não fecal. Logo, a 
existência de coliformes fecais em uma determinada amostra de água pode não significar uma 
contaminação fecal. Cabe ressaltar que a presença de coliformes fecais em uma determinada 
amostra de água é muito mais representativa da contaminação por fezes do que a de 
coliformes totais, dada a alta incidência de E. coli dentro do grupo fecal. 
Dentre as bactérias de habitat fecal, pertencente ao grupo de coliformes fecais, a E. coli é a 
mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos não fecais. Todos os demais membros do 
grupo tem uma associação duvidosa com a contaminação fecal. Portanto, a enumeração da E. 
coli é o melhor indicador de contaminação fecal conhecido. A Contagem Padrão de Bactérias 
e realizada visando conhecer a densidade de bactérias na água, tendo em vista que um 
aumento considerável da população bacteriana pode comprometer a detecção de organismos 
coliformes. Embora a maioria dessas bactérias não seja patogênica, pode representar riscos a 
saúde, como também, deteriorar a qualidade da água, provocando odores e sabores 
desagradáveis. 
3 
 
II-Contagem de Coliformes Totais e Coliformes Fecais pelo Método do Número Mais 
Provável (NMP) 
 
II.1- Coleta da amostra → quantidade representativa (± 100 mL) são coletadas em 
ambientes limpos e estéreis. No caso de água clorada o frasco deverá conter um pouco de 
tiossulfato de sódio com o intuito de inibir a ação do cloro presente, evitando seu efeito 
oxidante sobre a matéria orgânica presente no material analisado. Há recomendação para se 
adicionar 0,1 mL de tiossulfato de sódio a 1,8% para cada 100mL de amostra de água a ser 
analisada. 
II.2- Estocagem → deve ser mantida em geladeira por no máximo 24 horas. 
II.3- Técnica → a análise é realizada em duas etapas: teste presuntivo e teste confirmativo, 
quando o NMP de coliformes/mL é determinado utilizando uma tabela de NMP apropriada. A 
contagem padrão de bactérias e realizada empregando a técnica de plaqueamento pour-plate. 
 
 
4 
 
TABELA DE NÚMERO MAIS PROVÁVEL 
 
Numero Mais Provável (NMP) por 100 mL e 95 % de intervalo de confiança para diversas 
combinações de tubos positivos em séries de 3 tubos. Quantidade inoculada da amostra: 10,0; 
1,0 e 0,1 mL. 
 
 
 
5 
 
1ª Prática 
I-Teste Presuntivo de Coliformes Totais: 
1-Objetivo: verificar a fermentação da lactose com produção de gás nos tubos inoculados. 
2-Meio de cultura: Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) 
3-Procedimento: Inoculação de três séries de tubos 
1º - Inocular 10 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em 
concentração dupla e tubos de Durhan. 
2º - Inocular 1 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em 
concentração simples e tubos de Durhan. 
3º - Inocular 0,1 mL de amostra em tubos (3 ou 5) contendo 10 mL do caldo LST em 
concentração simples e tubos de Durhan. 
4º - Incubação: 35oC/48 horas. 
5º - Contagem: verificar a produção de gás nos tubos de Durhan e anotar os tubos 
positivos de cada série. 
II-Contagem Padrão de Bactérias 
1-Objetivo: determinar o numero de bactérias heterotróficas totais (Norma CETESB L5.201 - 
Bactérias Heterotróficas - Contagem em Placas). 
O controle de qualidade microbiológica da água é usualmente realizado através da pesquisa de 
bactérias do grupo coliforme, cuja presença evidencia o risco da existência de organismos 
patogênicos. Além disto, é de fundamental importância que se mantenha sob controle a 
população bacteriana geral da água. 
Densidades muito elevadas de microrganismos podem determinar a deterioração da qualidade 
da água, com o desenvolvimento de odores e sabores desagradáveis e a produção de limo ou 
películas. 
Este controle é bastante eficiente para avaliar as condições higiênicas da rede de distribuição e 
dos reservatórios d’água. 
Densidades bacterianas elevadas podem representar um risco à saúde dos consumidores, pois 
embora a maioria das bactérias da flora normal da água não seja considerada patogênica, 
algumas delas podem agir como patógenos oportunistas. 
Altas densidades bacterianas em águas potáveis podem incluir gêneros como Pseudomonas e 
Flavobacterium, que podem constituir risco à saúde de pacientes debilitados em hospitais, 
creches, berçários, casas de repouso, etc. 
 
6 
 
2-Meio de cultura: Plate Count Agar (PCA). 
3-Procedimento: Transferir, com pipeta estéril, 1 ml da amostra (diluída se necessário em 
solução fisiológica) para uma placa de Petri previamente esterilizada; adicionar o meio de 
cultura previamente fundido e homogeneizar o conteúdo da placa em movimentos circulares 
moderados em forma de (∞). 
4-Incubacao: incubar a placa em posição invertida a 35 + 0,5oC durante 48 + 3 horas. 
5-Contagem: Fazer a contagem das colônias com o auxilio de um contador de colônias. 
Selecionar a placa contendo entre 30 e 300 colônias. Contar o numero de colônias e, de 
acordo com a diluição utilizada no material de origem, expressar o numero de unidades 
formadoras de colônia (UFC) presentes na amostra, nas condições de teste. 
Exemplo de calculo: 
n
o
 de colônias = 54 
diluição = 10-1 
Total: 54 ÷ 10-1 = 54 x 101 = 5,4 x 102 UFC/g de amostra 
7 
 
2ª Prática 
 
I-Teste Confirmativo de Coliformes Totais 
1-Objetivo: evidenciar o crescimento dos coliformes no caldo verde-brilhante. O verde-
brilhante inibe o crescimento dos outros micro-organismos que fermentam a lactose e não são 
do grupo coliforme. 
2-Meio de cultura: Caldo Verde-Brilhante 
3-Procedimento: Transferir uma alçada bem carregada de cada tubo de LST onde houve 
produção de gás para tubos de caldo verde-brilhante contendo tubos de Durhan. 
4-Incubação: 35oC/48 horas. 
5-Contagem de coliformes totais: verificar a produção de gás nos tubosde Durhan e anotar os 
tubos positivos, confirmativos da presença de coliformes totais. Determinar o NMP/ml 
utilizando uma tabela de NMP apropriada. 
 
II-Teste Confirmativo de Coliformes Termotolerantes (Fecais) 
1-Objetivo: evidencia o crescimento da E. coli, uma bactéria de habitat reconhecidamente 
fecal dentro do grupo coliforme. 
2-Meio de cultura: Caldo E. coli (EC Medium) 
3-Procedimento: Transferir uma alçada bem carregada de cada tubo de LST onde houve 
produção de gás para tubos de caldo E. coli contendo tubos de Durhan. 
4-Incubação: Banho-maria 44,5oC/48 horas. 
5-Contagem de coliformes fecais: verificar a produção de gás nos tubos de Durhan e anotar 
os tubos positivos, confirmativos da presença E. coli. Determinar o NMP/ml utilizando uma 
tabela de NMP apropriada. 
 
 
 
8 
 
 
Conclusão: 
 
Padrão de potabilidade, segundo a PORTARIA Nº 2.914, DE 12 DE DEZEMBRO DE 2011 do Ministèrio da Saúde (Anexo 1).