Bioquimica aplicada Apostila aulas praticas bioqaplicada

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PROGRAMAÇÃO AULAS PRÁTICAS BIOQUÍMICA APLICADA – 2º Semestre 2015
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Prof. Lívia Bracht
	Dia
	Aula
	26/08/2015
	Escurecimento não enzimático – Maillard 
	02/09/2015
	Determinação da atividade da polifenoloxidase
	16/09/2015
	Determinação da atividade das enzimas catalase/peroxidase
	23/09/2015
	Hidrólise enzimática do amido 
	30/09/2015
	Aplicação das enzimas proteolíticas em alimentos 
	14/10/2015
	Determinação do teor de amido em bananas 
	28/10/2015
	Ponto isoelétrico da caseína 
	18/11/2015
	Extração da caseína 
	25/11/2015
	Influência de nitritos e nitratos na coloração da carne
AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA APLICADA - 1
ESCURECIMENTO PELA REAÇÃO DE MAILLARD
Materiais e reagentes
Balança analítica;
Tubos de ensaio;
Pipetas de 1ml;
Glicose, frutose, lactose e sacarose
Glutamato monossódico; (solução 50%)
Banho-maria 
Procedimento
Influência do tipo do carboidrato na reação:
Pesar 0,5 de glicose, frutose, lactose e sacarose em papel alumínio; transferir para tubos de ensaio diferentes.
Juntar 1ml de sol aquosa de Glutamato monossódico à 50%.
Aquecer os tubos de ensaio em banho Maria a 100º C por 15min.
Diluir se necessário. Avaliar visualmente o resultado.
	Tubos
	Ajinomoto (50%)
	Glicose (g)
	Frutose (g)
	Lactose (g)
	Sacarose (g)
	Água destilada 
	1
	1 mL
	0,5 g
	-
	-
	-
	1 mL
	2
	1 mL
	-
	0,5 g
	-
	-
	1 mL
	3
	1 mL
	-
	-
	0,5 g
	-
	1 mL
	4
	1 mL
	-
	-
	-
	0,5 g
	1 mL
AULA PRATICA DE BIOQUÍMICA APLICADA - 2
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS POLIFENOLOXIDASES
Parte 1 
Homogeneizar 1 maçã (sem casca e sem a parte central) em liquidificador com 250 ml de água destilada gelada. Filtrar e manter o filtrado em béquer com gelo. Os procedimentos subseqüentes devem ser realizados rapidamente.
	Transferir, para três tubos de ensaio e adicionar:
-Tubo 1: 1,0 ml da solução tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0) + 10 gotas da solução de catecol 0,2 % (em tampão fosfato 0,1 M)+ 5,0 ml do filtrado de maçã. Coloque o tubo em água fervente 10 minutos. 
-Tubo 2: 1,0 ml da solução tampão (pH 6,0) + 10 gotas da solução de catecol + 5,0 ml do filtrado de maçã. Coloque o tubo em gelo. 
-Tubo 3: 1,0 ml da solução tampão (pH 6,0) + 10 gotas da solução de catecol + 5,0 ml do filtrado de maçã. Deixe o tubo em temperatura ambiente. 
Observar e explicar o que ocorreu. Discuta o efeito do catecol.
Parte 2 
Transferir, para cinco tubos de ensaio e adicionar, agitar e repouso por 1hora:
Tubo 1: 5,0 ml de água + 5,0 ml do filtrado.
Tubo 2: 5,0 ml da solução tampão (pH 4,0) + 5,0 ml do filtrado.
Tubo 3: 5,0 ml da solução tampão (pH 8,0) + 5,0 ml do filtrado. 
Tubo 4: 5,0 mg de NaHSO3 + 5,0 ml do filtrado.
Tubo 5: 5,0 mg de ácido ascórbico + 5,0 ml do filtrado.
Observar e explicar as mudanças de coloração. Discuta os efeitos do pH, do inibidor e dos agentes redutores sobre a atividade da PPO.
Parte 3
	Descascar e extrair a parte central da maçã ou uma batata e dividir em seis partes. Tomar seis béqueres e identificá-los conforme os dados abaixo:
1 = pedaço do vegetal sem nenhuma solução;
2 = pedaço do vegetal imerso em solução de ácido ascórbico a 0,1%;
3 = pedaço do vegetal imerso em solução de ácido cítrico a 0,1%;
4 = pedaço do vegetal imerso em solução de ácido acético a 0,1%;
5 = pedaço do vegetal imerso em solução de ácido acético a 1%;
6 = pedaço do vegetal imerso em água destilada.
Explique a ação do ácido ascórbico e do cítrico.
Qual a solução foi a mais eficiente?
Compare a coloração do vegetal que imerso em água com aquele que ficou exposto ar ambiente.
AULA PRATICA DE BIOQUÍMICA APLICADA - 3
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS CATALASE E PEROXIDASE
Parte 1 – Teste para Catalase
Homogeneizar 1 maçã em liquidificador com água destilada fria.
Transferir, para dois tubos de ensaio, 5,0 ml do filtrado de maçã. Aqueça um dos tubos em água fervente por 5 minutos. Adicione 5 gotas de água oxigenada (0,3%) em cada tubo, inverter os tubos sem agitá-lo. Deixar em repouso por alguns minutos, observar e explicar as reações.
Parte 2 – Teste para Peroxidase
A) Transferir 2,0 ml do filtrado de maçã, para um tubo de ensaio contendo 20,0 ml de água destilada. Adicione 1,0 ml da solução de guaiacol 0,5% (doador de hidrogênio), e 5 gotas de água oxigenada (0,3%) e agitar. 
Preparar o branco contendo todos os ingredientes simultaneamente, exceto água oxigenada. Observar a mudança de coloração no período de 3,0 minutos. Descreva a reação química.
B) Pesar seis amostras de vagem (5 gramas cada) e aquecer em água fervente, durante 1, 2, 3, 4, 6 e 8 minutos (controle no tempo zero). Resfrie rapidamente em água gelada (2 minutos).
Amassar cada amostra em gral com um pistilo, com 30,0 ml de água destilada fria. Transferir para o béquer devidamente identificado e adicionar 1,0 ml de guaiacol 0,5% e mais 0,5ml de peróxido de hidrogênio (0,3%). Agitar e deixar em repouso durante 3,0 minutos e filtrar. Fazer a leitura em espectrofotômetro a 420nm.
Plotar os dados em um gráfico (Absorbância X Tempo de aquecimento), observe o tempo de aquecimento necessário para inativação da enzima.
AULA PRATICA DE BIOQUÍMICA APLICADA - 4
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO – CURVA DE TEMPO PARA A ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR
Objetivos
Traçar uma curva de tempo para a reação de hidrólise do amido pela amilase 
salivar
Quantificar o substrato utilizando uma solução de iodo/iodeto de potássio
Relação teórico-prática
Química de carboidratos; enzimas.
Reativos
Solução de amido a 0,7%
Solução de iodo 0,1mol/L
Solução de iodeto de potássio 0,5 mol/L
Solução de tampão imidazol 0,1mol/L pH 7,2
Saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) diluída em tampão imidazol (1:250 a 1:500)
Diluição da saliva
Transferir 20 microlitros da mistura de saliva para um tubo de ensaio contendo 4,98 mL de tampão imidazol
* Evitar pegar só espuma da solução de salina
**Manter na geladeira ou em banho de gelo até o momento do uso
Procedimento técnico
Organizar uma bateria com quatro tubos de ensaio
Identificá-los com números de 1 a 4
Adicionar os reagentes conforme a tabela:
	Reagentes (mL)
	Tubo
	Tubo
	Tubo
	Tubo
	
	1
	2
	3
	4
	Solução de amido
	0,1
	0,1
	0,1
	0,1
	Tampão imidazol
	0,1
	0,1
	0,1
	0,1
	Saliva diluída em tampão imidazol
	0,1
	0,1
	0,1
	0,1
	Solução de iodo/iodeto
	5,0
	-
	-
	-
Levar os tubos 2, 3 e 4 ao banho-maria a 37º C.
Incubá-los durante 10 min (tubo 2); 20 min (tubo 3) e 30 min (tubo 4).
Após cada tempo, adicionar 5 mL de solução de iodo/iodeto de potássio em cada tubo.
Calibrar o espectrofotômetro a 640 nm (filtro vermelho) com um tubo contendo 5 mL de solução de iodo/iodeto de potássio, 0,1 mL de tampão inidazol e 0,1 mL de saliva diluída em tampão imidazol (tubo branco).
Proceder a leitura das absorbâncias dos demais tubos.
Traçar o gráfico: tempo de incubação (minutos) X absorbância. Interpretar.
AULA PRATICA DE BIOQUÍMICA APLICADA - 5
APLICAÇÃO DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS EM ALIMENTOS
Materiais
- Abacaxi verde, abacaxi maduro, mamão verde, mamão maduro, figo verde
- solução tampão fosfato 0,1 M pH 6,0
- solução de 5% de gelatina em tampão fosfato 0,2 M pH 6,0 contendo 2 mg/mL de cisteína
- coalho comercial diluído 1:50 
- leite integral
- cloreto de cálcio 0,5 %
- banho-maria 50º C
- banho-maria 35º C
Obtenção do extrato enzimático de proteases vegetais
Pesar 100 g de amostra (frutos) e homogeneizar com 200 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 6,0 em liquidificador
Filtrar em gaze e recolher o filtrado em proveta de 250 mL
Aquecer metade do extrato de abacaxi a 100º Cpor 10 minutos
Utilizar o filtrado (extrato enzimático) para os demais ensaios
Teste qualitativo de atividade proteolítica
Pipetar 4 mL de solução 5% de gelatina em tampão fosfato 0,2 M pH 6,0 em sete tubos de ensaio numerados (1 a 7)
Adicionar 2 mL de cada extrato enzimático em cada tubo (1 a 6) e 2 mL de água destilada no tubo 7 (branco).
Incubar 30 minutos a 50º C
Após incubação, colocar os tubos em banho-de-gelo. Verificar em qual dos tubos ocorreu hidrólise da gelatina.
	Tubo
	Gelatina 5%
	Extrato
	Resultado
	1
	4 mL
	2 mL extrato abacaxi verde
	
	2
	4 mL
	2 mL extrato abacaxi maduro
	
	3
	4 mL
	2 mL extrato de mamão verde
	
	4
	4 mL
	2 mL extrato de mamão maduro
	
	5
	4 mL
	2 mL extrato de figo verde
	
	6
	4 mL
	2 mL de extrato de abacaxi fervido
	
	7
	4 mL
	2 mL de água
	
Efeito de proteases vegetais e da renina sobre a coagulação do leite
Pipetar 8 mL de leite em 8 tubos de ensaio numerados (1 a 8)
Pipetar 1 mL de cloreto de cálcio em cada um dos tubos
Incubar a 35º C por 10 min para equilibrar a temperatura
Pipetar em cada um dos tubos 1 mL dos extratos enzimáticos vegetais (1 a 6)
Incubar os tubos de 1 a 6 em banho-maria a 50º C
Pipetar 1 mL do coalho comercial diluído no tubo 7
Pipetar 1 mL de água destilada no tubo 8 (branco)
Incubar os tubos 7 e 8 a 35º C 
Observar se ocorreu coagulação do leite após 10, 30 minutos e após 1 hora de incubação, inclinando levemente os tubos de ensaio
Testar o sabor das amostras após 1 hora de incubação
	Tubo
	Leite
	Cloreto de cálcio 5%
	Extrato enzimático
	Incubação (tpt)
	10 minutos coagulado (sim ou não)
	30 minutos coagulado (sim ou não)
	1 hora coagulado (sim ou não)
Sabor do leite (amargo?)
	1
	8 mL
	1 mL
	1 mL extrato abacaxi verde
	50º C
	
	
	
	2
	8 mL
	1 mL
	1 mL extrato abacaxi maduro
	50º C
	
	
	
	3
	8 mL
	1 mL
	1 mL extrato mamão verde
	50º C
	
	
	
	4
	8 mL
	1 mL
	1 mL extrato mamão maduro
	50º C
	
	
	
	5
	8 mL
	1 mL
	1 mL extrato figo
	50º C
	
	
	
	6
	8 mL
	1 mL
	1 mL extrato abacaxi fervido 
	50º C
	
	
	
	7
	8 mL
	1 mL
	1 mL coalho diluído
	35º C
	
	
	
	8
	8 mL
	1 mL
	 1 mL água destilada
	35º C
	
	
	
AULA PRATICA DE BIOQUÍMICA APLICADA - 6
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE AMIDO EM BANANAS COM DIFERENTES ESTÁDIOS DE MATURAÇÃO
Materiais
Bananas em diferentes estádios de maturação
Placas de Petri
Facas
Solução de lugol
Procedimento
Cortar seções transversais das bananas em diferentes estádios de maturação e colocá-las em placas de Petri 
Pingar uma gota de Lugol em cada uma das amostras
Observar o resultado – relacione a coloração da casca, com o teor de amido. Prove algumas amostras e relacione também com a doçura.
AULA PRATICA DE BIOQUÍMICA APLICADA – 7
DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO
A caseína é a principal proteína encontrada no leite. Apresenta seu ponto isoelétrico no pH 4,7.Dependendo do pH do meio, uma proteína pode apresentar carga elétrica positiva, negativa ou nula. As variações do pH na solução influenciam as cargas dos radicais dos aminoácidos constituintes das proteínas. Com isso a própria estrutura protéica se modifica, bem como seus fatores de solubilidade (carga elétrica e capacidade de hidratação das moléculas). 
Em solução, quando as moléculas de determinada proteína estiverem carregadas positivamente ou negativamente, a solubilidade dessa proteína será maior, pois as moléculas se repelirão entre si, aumentando a interação com o solvente. Existe um pH intermediário, que varia de proteína para proteína (pois depende dos radicais R dos aminoácidos que a constituem), em que há um equilíbrio entre as cargas positivas e negativas. Este pH é conhecido como PONTO ISOELÉTRICO da proteína – pI. Nesse pH, a proteína apresenta solubilidade mínima, porque a carga efetiva da molécula é nula (há um balanço entre cargas positivas e negativas), ficando diminuída a repulsão entre as moléculas e havendo interação eletrostática das moléculas entre si. Como conseqüência, forma-se grumos que tendem a precipitar.
Materiais
- pHmetro
- Ácido acético 2 M
- Ácido acético 1 M
- Ácido acético 0,1 
- Ácido acético 0,01 
- Água destilada
- Solução de caseína: diluir 1 g de caseína em 50 mL de água. A esta suspensão adicionar 25 mL de NaOH 1M e agitar lentamente até dissolver a caseína. Adicionar 25 mL de ácido acético 1M e agitar lentamente. Ajustar o pH para valores em torno da neutralidade.
Procedimento
1 - Dispor uma série de tubos de ensaio como na tabela a seguir (outra página).
2 - Pipetar em cada tubo 0,5 mL de solução de caseína.
 3 - Agitar todos os tubos por inversão.
 4 - Observar a turbidez logo após a agitação e anotar no quadro de resultados, conforme a intensidade.
 5 - Medir o pH de todos os tubos com pHmetro.
 6 - Concluir indicando qual o pI da caseína.
	Tubos
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	H2O destilada (mL)
	4,0
	4,4
	4,3
	3,7
	3,5
	2,5
	0,5
	3,9
	3,7
	Ác. Acético 0,01 M (mL)
	0,5
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	Ac. Acético 0,1 M (mL)
	-
	0,1
	0,2
	0,8
	-
	-
	-
	-
	-
	Ac. Acético 1 M (mL
	-
	-
	-
	-
	1,0
	2,0
	3,0
	-
	-
	Ac. Acético 2 M (mL
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	0,8
	1,0
 
.
	Quadro de resultados
	Tubos
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	pH
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Turbidez
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Convenção: Turbidez - intensidade crescente
 0, +, ++, +++, ++++
AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA – 8
EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM DE CASEÍNA
 
1. Extração e caracterização
 
Em um béquer de 100 ml contendo 10 ml de leite, adicionar 40 ml de água destilada. Retirar uma alíquota de 1 ml e realizar a reação do biureto (1 ml de amostra + 4 ml do reagente de biureto). Analisar. 
A seguir, utilizando-se de um medidor de pH, acrescentar ácido acético 5%, gota a gota, até que ocorra precipitação. Isto deve ocorrer quando o pH está próximo de 4,6. A adição do ácido ao leite provoca a precipitação da caseína, juntamente com água, lipídeos, proteínas. Deixar em repouso por 5 minutos. 
Agitar o frasco e recolher uma alíquota de 10 ml.
Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos e recolher o sobrenadante. Determinar o teor de proteínas no sobrenadante.
Adicionar 2 ml de éter etílico, e a seguir, homogeneizar com um bastão de vidro. A adição de éter etílico tem por finalidade retirar materiais gordurosos. Centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos e desprezar o sobrenadante. 
Se necessário adicionar, novamente, 2 ml de éter etílico, homogeneizando com bastão de vidro. Centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Adicionar 2 ml de etanol absoluto e homogeneizar. A adição de etanol tem por finalidade retirar a água de solvatação que permaneceu junto à proteína. Centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos e desprezar o sobrenadante. Repetir esta etapa, adicionando álcool, caso seja necessário.
Opcionalmente, após o tratamento com éter etílico e etanol, pode-se pesar a matéria seca (caseína) e comparar com o resultado da dosagem de proteínas feita pela técnica do biureto.
Finalmente, adicionar 2ml de hidróxido de sódio 2 N e redissolver o precipitado, completando com água destilada para um volume final de 5 ml.
Realizar a dosagem de proteínas.
 
2. Dosagem quantitativa da caseína do leite
A quantidade de proteínas presentes em uma solução ou suspensão pode ser medida pelo método quantitativo do biureto.
Material
Solução padrão de albumina 10 mg/ml
Reagente de biureto 
Dosagem
Retirar uma alíquota de 0,2 ml de amostra e acrescentar 0,8 ml de água. A seguir, acrescentar 4 ml do reagente de biureto e ler contra o branco, em 540 nm. 
Determinar a concentração de caseína, através da curva de calibração,obtida em aula anterior. Calcular a concentração de caseína em um litro de leite. 
3. Valores teóricos
Proteínas totais do leite de vaca = 3,3 g%
80% deste total corresponde a caseínas
	Proteínas do leite de vaca
	Concentração aproximada (g%)
	pI
	(s1-Caseína
	1,37
	4,1
	K-Caseína
	0,37
	3,7
	(-Caseína
	0,62
	4,5
	(-Caseína
	0,12
	5,8 – 6,0
	(-Lactoglobulina
	0,30
	5,3
	(-Lactoalbumina
	0,07
	5,1
	Albumina do soro bovino
	0,03
	4,7
	Imunoglobulina (IgG)
	0,06
	5,6 – 6,0
3. Esquema operacional
 
	10 ml de leite + 40 ml de água
SYMBOL 175 \f "Symbol"
		ácido acético gota a gota até precipitação
SYMBOL 175 \f "Symbol"
	Repouso por 5 minutos. Agitar
SYMBOL 175 \f "Symbol"
	Retirar alíquota de 10 ml.
Centrifugar. Desprezar o sobrenadante
SYMBOL 175 \f "Symbol"
	2 ml de éter etílico. Homogeneizar
 SYMBOL 175 \f "Symbol"
	Centrifugar. Desprezar o sobrenadante
SYMBOL 175 \f "Symbol"
	2 ml de etanol absoluto. Homogeneizar
SYMBOL 175 \f "Symbol"
	Centrifugar. Desprezar sobrenadante
SYMBOL 175 \f "Symbol"
	Ressuspender o precipitado
SYMBOL 175 \f "Symbol"
	Determinar a concentração de proteínas
AULA PRATICA DE BIOQUÍMICA APLICADA - 9
INFLUÊNCIA DE NITRATOS E NITRITOS SOBRE A MIOGLOBINA
Objetivo: Determinar a influência de nitratos e nitritos na formação de pigmentos em carnes.
Instruções para a aula:
Preparar 4 equipes.
Equipamentos:
Banho-maria a 80º C.
Materiais para cada equipe:
5 pipetas graduadas de 1 mL
5 bastões de vidro
5 tubos de ensaio grandes (18x180mm) 
Soluções: 
Solução de nitrito de sódio 10, 20, 50, 100 e 200 ppm (disponibilizar ± 5 mL)
Solução de nitrato de sódio 50, 250 e 500 ppm (disponibilizar ± 5 mL)
Solução de ácido ascórbico 20 mg/mL (disponibilizar ± 5mL)
Solução de H2O2 (1 mL de solução H2O2 30% em 50 mL de água destilada)
 (disponibilizar ± 5 mL)
PROCEDIMENTO
Equipe 1: Efeito do NO2 sobre a mioglobina
Para este estudo, serão utilizados 5 tubos de ensaio contendo 2 g de carne. A cada um destes tubos, adicionar 1 mL de solução de nitrito de sódio de diferentes concentrações (10, 20, 50, 100 e 200 ppm)
Homogeneizar com auxílio de um bastão de vidro e deixar os tubos em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após repouso, aquecer os tubos em banho-maria a 80º C por 30 minutos.
Observar a coloração da carne nos tubos, anotar os resultados. Citar no relatório os pigmentos formados em cada tubo.
Equipe 2: Efeito do NO2 sobre a mioglobina na presença de ácido ascórbico
Para este estudo, serão utilizados 5 tubos de ensaio contendo 2 g de carne. A cada um destes tubos, adicionar 1 mL de solução de nitrito de sódio de diferentes concentrações (10, 20, 50, 100 e 200 ppm) e 0,2 mL de ácido ascórbico.
Homogeneizar com auxílio de um bastão de vidro e deixar os tubos em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após repouso, aquecer os tubos em banho-maria a 80º C por 30 minutos.
Observar a coloração da carne nos tubos, anotar os resultados. Citar no relatório os pigmentos formados em cada tubo.
Equipe 3: Efeito do NO3 sobre a mioglobina na presença de ácido ascórbico
Adicionar 1 mL de solução de nitrato de sódio de diferentes concentrações (50 ppm, 250 ppm, 500 ppm) a cada um dos três tubos que serão utilizados nesta etapa.
Proceder como descrito nos itens 2, 3 e 4 no procedimento I.
Preparo do tubo controle
1. Adicionar 1 mL de água destilada a dois tubos de ensaio contendo 2 g de carne moída.
2. Homogeneizar com auxílio de bastão de vidro e deixar em repouso por 30 minutos.
3. Aquecer em banho-maria a 80º C por 15 minutos.
4. Adicionar 1 mL de H2O2 após aquecimento.
5. Anotar as colorações formadas após cada etapa e explicar os resultados.
IV. Equipe 4: Efeito do NO3 sobre a mioglobina na presença de ácido ascórbico
Adicionar 1 mL de solução de nitrato de sódio de diferentes concentrações (50 ppm, 250 ppm, 500 ppm) a cada um dos três tubos que serão utilizados nesta etapa + 0,2 mL de ácido ascórbico (20 mg/mL)
Efeito do peróxido de hidrogênio sobre o nitrosohemocromo
Adicionar 1 mL de solução de nitrito de sódio de concentração final 100 ppm a um tubo de ensaio contendo 2 g de carne moída.
Homogeneizar com auxílio de um bastão de vidro e deixar os tubos em repouso por 30 minutos à temperatura ambiente.
Após repouso, aquecer os tubos em banho-maria a 80º C por 30 minutos.
Adicionar 1 mL de H2O2 após aquecimento
Anotar as colorações formadas após cada etapa e explicar os resultados
	
	
TUBO
	Resultados
	
	
	Coloração
	Pigmentos Formados
	
Equipe 1
	1
	2 g de carne + 1 mL NO2 (10 ppm)
	
	
	
	2
	2 g de carne +1 mL NO2 (20 ppm)
	
	
	
	3
	2 g de carne + 1 mL NO2 (50 ppm)
	
	
	
	4
	2 g de carne + 1 mL NO2 (100 ppm)
	
	
	
	5
	2 g de carne + 1 mL NO2 (200 ppm)
	
	
	
Equipe 2
	1
	2 g de carne + 1 mL NO2 (10 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	
	2
	2 g de carne + 1 mL NO2 (20 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	
	3
	2 g de carne + 1 mL NO2 (50 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	
	4
	2 g de carne + 1 mL NO2 (100 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	
	5
	2 g de carne +1 mL NO2 (200 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	Equipe 3
	1
	2 g de carne + 1 mL NO3 (50 ppm)
	
	
	
	2
	2 g de carne +1 mL NO3 (250 ppm)
	
	
	
	3
	2 g de carne + 1 mL NO3 (500 ppm)
	
	
	
	4
	2 g de carne + 1 mL H2O→ ∆ + 1 mL H2O2
	
	
	
	5
	2 g de carne + 1 mL H2O→ ∆ + 1 mL H2O2
	
	
	Equipe 4
	1
	2 g de carne + 1 mL NO3 (50 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	
	2
	2 g de carne + 1 mL NO3 (250 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	
	3
	2 g de carne + 1 mL NO3 (500 ppm) + 0,2 mL de ácido ascórbico (20mg/mL)
	
	
	
	4
	2 g de carne + 1 mL NO2 (200 ppm)→ ∆ + 1 mL H2O2 → nitroso-hemocromo
	
	
	
	5
	2 g de carne + 1 mL NO2 (200 ppm)→ ∆ + 1 mL H2O2 → nitroso-hemocromo 
	
	
Nota: as amostras foram incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente em seguida aquecidas em banho-maria a 80º C por 30 minutos.