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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO DISCIPLINA DE PARASITOLOGIA VLAUDIA M. A. COSTA JOÃO INÁCIO IRMÃO RECIFE 2008 PARASITOLOGIA CLÍNICA EXAMES PARASITOLÓGICOS A maioria dos parasitos intestinais pode ser diagnosticada pelo exame das fezes, embora outros materiais como urina, escarro, secreções, tecidos e conteúdo duodenal, podem ser utilizados para identificação de algumas espécies de parasitas. No diagnóstico parasitológico podemos identificar mais frequentemente ovos e larvas de helmintos e os cistos, oocistos e trofozoítos de protozoários. A identificação correta dos parasitos vai depender principalmente das condições das amostras. Portanto, é fundamental a colheita adequada do material. No material fecal normalmente encontramos elementos como resíduos alimentares, células vegetais, grão de pólen, leucócitos e outros artefatos que podem facilmente ser confundidos com parasitos. Adultos de Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, proglotes de Taenia spp e de Dipylidium caninum podem ser encontrados no bolo fecal, sem que a presença de ovos seja identificada. Desta forma é importante a realização do exame macroscópico. A detecção e a identificação dos parasitos intestinais depende, portanto, da qualidade da amostra entregue ao laboratório. Na colheita deve-se observar o tipo de recipiente, volume, tempo da amostra, utilização de algumas drogas pelo pacientes, compostos químicos. Estes fatores podem interferir na realização do exame. O recipiente deve estar seco e limpo. Amostras secas nas bordas e na superfície devem ser rejeitadas. O pote deve estar livre de anti-sépticos, agentes germicidas, gotas de óleo e de urina para evitar a destruição de formas vegetativas. Fezes excretadas no solo não devem ser utilizadas para evitar a contaminação com larvas de vida livre. O material não pode ser obtido de privadas, pois a água e a urina poderiam destruir trofozoítos. Os medicamentos como antibiótico, antidiarréicos, antiácidos, derivados de bismuto e do bário, vaselina e óleos minerais podem interferir nos resultados levando a resultado falso negativo. A utilização de antibióticos pode afetar a flora intestinal normal causando diminuição ou ausência temporária dos organismos, visto que muitos parasitos se alimentam de bactérias intestinais. De um modo geral as amostra devem ser colhidas em dias separados, uma série de três amostras em não mais de 10 dias. Este procedimento propicia uma maior positividade, uma vez que a eliminação de ovos e cistos nem sempre ocorre continuamente. O tempo de colheita do material também influencia no resultado. Os trofozoítos de protozoários não se multiplicam nem encistam fora do organismo humano, e geralmente se degeneram após a excreção. Desta forma recomenda-se a leitura 30 minutos após a colheita de fezes líquidas, as fezes pastosas devem ser processadas até uma hora após evacuação. Pelo curto tempo nestes casos, este material deve ser colhido com substâncias conservantes como formalina, MIF, SAF, etc. Quando se trata de fezes sólidas este material pode ser observado até 24 horas ou preservados. SOLUÇÕES CONSERVADORAS DE MATERIAL FECAL Formalina a 10% MIF (mertiolato iodo formaldeído) SAF: TAF: utilizada na conservação de helmintos (larvas e vermes adultos). EXAME MACROSCÓPICO As amostras fecais não preservadas devem ser examinadas macroscopicamente para determinar consistência, odor, cor, presença ou ausência de sangue, muco, proglotes e vermes adultos. NORMAS TÉCNCAS DE SEGURANÇA LABORATORIAL Utilizar uniforme adequado nos trabalhos de laboratório. Manusear o material biológico devidamente protegido Evitar aspirar ou inalar produtos químicos ou biológicos. Identificar os produtos ou soluções antes de usar. formadas Semi-formadas Pastosas Líquidas Cistos trofozoito Encaminhar ao lixo a vidraria danificada. Desprezar todas soluções sem identificações. Manter em soluções conservadoras o material diagnosticado para demonstração futura. O transporte de substâncias voláteis, ácidos ou bases fortes, deverá ser realizado com cuidados especiais de segurança. Manter em local de fácil acesso extintor de incêndio. Deixar no laboratório apenas os reativos, soluções e corantes de uso diário. Colocar em local de fácil acesso antídotos. CONTROLE DE QUALIDADE Não utilizar soluções, reagentes e corantes com a data vencida. Observar a adequada calibração de equipamentos (alça de platina) Manter o equipamento óptico (microscópio, lupa) em bom estado de conservação. Controle diário da temperatura de banho-maria e estufa. Não submeter vidraria e equipamentos calibrados à alta temperatura. Conservar adequadamente amostras padrões de parasitos e material de ensino. Estabelecer controle de qualidade externo mantendo intercâmbio com outros profissionais (instituições de referência). COPROLOGIA RESÍDUOS ALIMENTARES E ELEMENTOS ANORMAIS Introdução: Devido a uma grande variedade de elementos que o exame microscópio pode revelar nas fezes, nem mesmo os coprologistas mais experimentados são capazes de identificar tudo que é visto nas preparações de lâminas fecais. A coprologia tem como objetivo estudar as mais diversas funções digestivas, que direta ou indiretamente, estejam ligadas a formação de massa fecalógica final. A presença de estruturas como polimorfonucleares, eritrócitos, piócitos, grão de amido, fios e pêlos vegetais, cristais de Charcot Leyden, macrófagos, Blastocystis, etc., muitas vezes confundem os técnicos em microscopia com estruturas outras, tais como: trofozoítos, cistos, larvas e ovos. O referido tema possuí grande relevância no que diz respeito, principalmente aos chamados diagnósticos diferenciais dos esfregaços fecais, dando condições técnicas ao laboratório, para fornecer resultados que induzam ao medico o diagnóstico, facilitando a formulação das requisições direcionadas para cada caso específico. Ex.: requisição direcional para coprocultura ou para exame parasitológico. FINALIDADES GERAIS DA COPROLOGIA: Estudo das funções digestivas. Pesquisa do sangue oculto. Pesquisa bacteriológica Pesquisa parasitológica Na avaliação coprológica deve-se proceder de forma científica desde a avaliação com orientação médica ao paciente, até o tipo de dieta, coleta e manuseio até chegar aos resultados coprológicos finais. Normalmente o paciente é orientado, de acordo com o tipo de exame que se pretende fazer. Ex. na pesquisa de sangue oculto fecal, não podemos permitir que o doente ingira carnes ou medicamentos ferrosos, que certamente iriam mascarar os resultados. Para o exame parasitológico de rotina, não se deve prescrever qualquer tipo de regime alimentar especial. Para os exames coprológicos especiais como dosagem de gordura fecal e/ou das funções digestivas, recomenda-se o Regime misto ou seja, o paciente conserva os seus hábitos alimentares, acrescentando as substâncias alimentares específicas em qualidade e quantidade estipuladas pelo médico requisitante. DIETA DE GAUTIER para estudo dos elementos residuais das fezes: Carne de bovino-------------------------------------------------- 60 g Leite ---------------------------------------------------------------300 mL Manteiga --------------------------------------------------------- 30 g Pão -----------------------------------------------------------------100 g Batata --------------------------------------------------------------100 g OBS.: nestas quantidades prescritas, basta 1 única refeição de prova, não havendo necessidade de dieta porperíodo de 3 dias, como manda as dietas em geral. Ingerir uma cápsula de Carmim 0,3 g ao iniciar a dieta, a fim de facilitar o reconhecimento das fezes. Deve-se coletar todo o material da evacuação normal ( a mais próxima da prova) em frasco de boca larga limpo e seco remetendo imediatamente para o laboratório, ou colocar em geladeira 4 oC para exame posterior. A maioria dos autores critica a utilização de purgantes para acelerar as evacuações. PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES PROCEDIMENTO: Espalhar pequena quantidade de fezes sobre o papel de filtro limpo e colocar duas gotas de água oxigenada sobre o esfregaço. Adicionar duas gotas de solução de benzidina. Observar imediatamente a cor. Leitura: A reação de benzidina é sensível, mas as gorduras podem torná-la positiva. Nenhuma mudança de cor: Negativo Cor esverdeada: Traços Cor verde claro: + Cor vede escuro: ++ Cor verde azulado: +++ Azul intenso: ++++ ASPECTOS GERAIS DA MATÉRIA FECAL: Aspectos do material fecal como, consistência, forma, cor, odor, viscosidade e pH, são fatores de grande relevância para o diagnóstico coprológico, como um todo, sendo considerados desde uma simples indução diagnóstica, até mesmo a alterações de caracteres patológicos de malignidade. Ex.: Fezes em formato típico de fita pode ser indício de algum estreitamento do reto sigmóide. Fezes com odor típico de cola de carpinteiro, fala a favor de infecção por ameba. Fezes com presença de sangue podem induzir a simples diagnósticos de processos hemorroidários ou câncer. EXAME MICROSCÓPICO Resíduos alimentares de origem animal Tecido conjuntivo, fibras musculares, gorduras e sabões. RESÍDUOS ALIMENTARES DE ORIGEM VEGETAL Amido intracelular, amido extracelular (amido amorfo), amido cru, celuloses, fibras e pêlos vegetais, vasos espiralados e células vegetais. ELEMENTOS DE ORIGEM INTESTINAL DE NATUREZA NÃO PARASITÁRIA: Muco, eritrócitos, leucócitos, piócitos, células epiteliais, cristais. ELEMENTOS DE ORIGEM INTESTINAL DE NATUREZA PARASITÁRIA E/OU PUROS COMENSAIS Protozoários, helmintos, artrópodes, Blastocystis, Meloidogyne e leveduras. CONCLUSÃO DE ESTUDO COPROLÓGICO COM DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS LÂMINAS L1: leucócitos + eritrócitos + piócitos (raros/ausentes) + cristal de Charcot Leyden = diagnóstico sugestivo de Amebíase (Disenteria amebiana). L2: leucócitos + eritrócitos + piócitos (inúmeros) + ausência de cristal de Charcot Leyden = diagnóstico sugestivo de um processo bacilar (disenteria bacilar). Nestes casos em particular, o cristal e os piócitos foram elementos diferenciadores do diagnóstico laboratorial em lâmina. O diagnóstico diferencial em lâmina fecal é muito importante quando o médico necessita intervir com urgência, seja com relação ao tipo específico de exame que deva se requisitar ou mesmo com relação à terapêutica, principalmente quando se trata de paciente de baixa idade ou idosos. EXAME PARASITOLÓGICO DAS FEZES O exame parasitológico de fezes constitui na prática médica providência de fundamental importância para o diagnóstico das parasitoses intestinais. Sua execução envolve a utilização de vários métodos que objetivaram a pesquisa de protozoários intestinais nas suas formas císticas e vegetativas, como também de ovos, larvas e por vezes vermes adultos de helmintos. Além da possível presença de formas infectantes ou infestantes, de enteroparasitos, há também a possibilidade de que o material em exame contenha bactérias e vírus patogênicos. Portanto, deve ser observada uma série de cuidados não só na manipulação, como também na limpeza da vidraria e na destinação da amostra examinada. O emprego de substâncias desinfetantes se faz necessário. COLETA DE MATERIAL: Geralmente a colheita do material é feita em casa, portanto é necessário algumas recomendações, uma vez que sua coleta adequada é de fundamental importância. As amostras não devem ser colhidas durante uma semana depois que o paciente tenha tomado substâncias que deixam resíduos cristalinos, tais como compostos antidiarréicos, antiácidos, bismuto e bário. Além disso, laxativos oleosos tais como óleo mineral pode interferir no exame. Antibióticos e meios de contraste reduzem os números de organismos, particularmente protozoários, nas fezes durante 2 a 3 semanas. As amostras devem ser isentas de urina e não devem estar contaminadas por água do vaso sanitário ou pelo solo, pois estes podem conter protozoários e helmintos livres ou podem destruir trofozoítos. Água armazenada no laboratório também podem tornar-se contaminadas com estes organismos. Como os números de formas diagnosticados de alguns parasitos podem variar, é aconselhável examinar os espécimes obtidos em dias alternados ou de 3 em 3 dias, com um total de três espécimes sendo o mínimo para assegurar ausência de infecção. As fezes para exame coprológico devem ser colhidas em recipientes de boca larga cuidadosamente limpos, sem necessidade de esterilização. Colher o material correspondente à parte intermediária da evacuação, que é em geral de maior uniformidade. Quando o exame seriado obtido normalmente é examinado e não identifica parasito, podem ser conseguidos espécimes purgados, particularmente quando se suspeitam de infecções por protozoários. Deve-se usar purgativos salinos, como sulfato ou fosfasoda tamponada em vez de compostos de óleo mineral ou de magnésia, que podem interferir com o exame por causa dos glóbulos de óleo ou detritos cristalinos. ASPECTO MACROSCÓPICO DO MATERIAL FECAL Deve-se fazer um exame macroscópico das fezes, porque permite observar: a) Consistência: moldada, pastosa, diarréica. b) Presença de sangue e muco c) cor d) Helmintos adultos ou partes dos mesmos Quando se tratar de material moldado, ou mesmo pastoso, são indicados os métodos de concentração, ao passo que em se tratando de material diarréico, liquefeito ou com muco ou sangue, impõe-se os exames diretos a fresco ou após fixação pela hematoxilina férrica. Esta conduta é explicada pelo fato de que, geralmente, nas enteroprotozooses, as formas vegetativas são encontradas no material diarréico, enquanto cistos estão presentes em fezes pastosas e moldadas. Evidentemente, as formas vegetativas muito frágeis não resistem aos trâmites dos métodos de concentração. Todavia, também estes devem ser aplicados ao material liquefeito, portanto nas helmintoses intestinais podem sobrevir, muitas vezes, crises diarréicas. PROTOZOÁRIOS DE VIDA LIVRE TIPOS DE MOVIMENTO Movimento Amebóide: Processa-se por meio da emissão de prolongamentos do protoplasma, que são os pseudópodes. É o movimento das amebas, pode ser lento ou rápido. (amebídeos de vida livre) Movimento Flagelar: Processa-se as custas de flagelos, são filamentos longos, delgados e flexíveis. O número de flagelos nos animais varia de 01 a 08. É um movimento tipo saltitante, helicoidal, chicoteando o meio líquido (Euglena). Movimento Ciliar: Processa-se por meio de cílios, que são filamentos curtos e numerosos, envolvendo todo corpo do animal. É um movimento ondulante, oscilatório (Paramecium, Opalina, etc.) Algumas formas que são de vida livre ou saprozóicas no interior de animais: Rhizopoda Amoeba proteus Mastigophora Trichomonas, Chilomastix, Euglena Ciliophora - Paramecium, Opalina, Zeleriella, Nyctotherus OBSERVAÇÃO DO MATERIAL Exame Direto 1. colocar uma gota do material a ser examinado numa lâmina, cobrindo com uma lamínula. 2. Usando a objetiva de 45X, observar a presença de formas móveis dos protozoários (trofozoítos) 3. Procurar focalizar o protozoário, que é facilmente reconhecido pelo seu movimento típico OBSERVAÇÃO DE FLAGELADOS E CILIADOS 1. Preparar a lâmina com o material a observar 2. Levar ao microscópio,usando a objetiva de 45X e observar os movimentos da forma pesquisada. 3. Retirar com papel de filtro, parte da água existente entre a lâmina e lamínula, com cuidado, até conseguir uma diminuição do movimento do flagelado ou ciliado e verificar as características morfológicas MÉTODOS LABORATORIAIS APLICADOS NA IDENTIFICAÇÃO DE PARASITOS DO APARELHO DIGESTIVO QUALITATIVOS Preparação à fresco: Este método é indicado para o material fecal emitido recentemente (menos de 20 minutos), de consistência líquida ou pastosa e que se admite que contenham trofozoítos de protozoários. Exame Pelo Método Direto Este método foi utilizado pela primeira vez por Leeuwenhoek quando identificou a Giardia lamblia no século XVII. Tem sido empregado quando há carência de recursos ou a infestação parasitária é reconhecidamente intensa. Pode ser empregado em fezes de consistência variada, recentemente emitidas ou não. MÉTODO DE SEDIMENTAÇÃO ESPONTÂNEA (HOFFMAN, PONS & JANER) FUNDAMENTO: Precipitação de partículas, inclusive de cistos, ovos e larvas de parasitos ao fundo do cálice de sedimentação, devido a força de gravidade. INDICAÇÃO: Utilizado na pesquisa de ovos de S. mansoni, é atualmente usado na rotina diária dos laboratórios, na detecção de cistos de protozoários, de ovos e larvas de helmintos. Adolf Lutz, eminente pesquisador brasileiro, empregou o modelo pela primeira vez, no entanto, foi a partir dos trabalhos de Hoffman, Pons e Janer, que a técnica passou a ser conhecida mundialmente. A vantagem deste método é a economia dispensando o uso de reagentes e centrífugas. A desvantagem é a grande quantidade de detritos fecais, dificultando, com freqüência a preparação e o exame da lâmina. PROCEDIMENTO: 1. Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em copo graduado ou Becker de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml de água corrente e misturar vigorosamente. 2. Preparar a suspensão juntando 100 ml de água corrente. 3. Filtrar essa suspensão através de gaze dobrado 4 vezes, recolhendo-a em copo de sedimentação de capacidade de 125 ml. 4. Se necessário, adicionar água corrente, até completar aproximadamente ¾ do volume do copo cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas. 5. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena porção do sedimento na camada inferior, depositando sobre uma lâmina. Se a preparação estiver muito espessa, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente. Colher amostra adicional do centro e do fundo do sedimento. 6. Examinar ao microscópio, a presença de ovos, larvas e cistos. CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO PELO SULFATO DE ZINCO (FAUST & Cols.) FUNDAMENTO: Flutuação de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos em solução de sulfato de zinco. INDICAÇÃO: Indicado na pesquisa de protozoários e de ovol leves de helmintos (Ancilostomídeos, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura). Esta técnica é imprópria para espécimes que contenham grande quantidade de gorduras. A técnica pode ser utilizada com fezes preservadas em formaldeído, SAF e outros fixadores, no entanto a densidade específica deverá se ajustada em 1.2 g/mL. O aumento de densidade poderá resultar em uma distorção dos organismos. Obs.: 1. ovos de trematódeos e de cestóides podem estar presentes, portanto um exame completo deve- se examinar também o sedimento. 2. uma permanência prolongada da suspensão em sulfato de zinco, pode resultar em distorção dos cistos e ovos de nematódeos. A preparação deve ser examinada até 20 minutos. Deve-se utilizar tubos com fundo PROCEDIMENTO: 1. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10 ml de água. Filtrar a suspensão através de gazes dobradas em quatro vezes , e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 2. Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar ( 650x g ( 2500rpm) por 1 minuto ). 3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ao sedimento , antes de ressuspendê-lo. Completar com água 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar. 4. Repetir a etapa 3, até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. 5. Depois que o último sobrenadante é decantado, adicionar 1 a 2 ml do reagente , e ressuspender o sedimento: completar com sulfato de zinco 33% até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar (650 x g( 2500rpm) por 1 min ). 6. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação Coloca-lo em uma estante em posição vertical. 7. Com uma alça de arame (diâmetro de 5 a 7 mm) tocar no centro da membrana formada na superfície, transferido várias alçadas para uma lâmina de microscopia. Examinar ovos larvas e cistos. 8. Depois de concluída a etapa 4, com auxílio de pipeta, encher o tubo até a borda com solução de sulfato de zinco. Colocar uma lamínula (22 x 22 mm) na superfície do tubo. Deixando-a em contato com o líquido durante 8 a 10 minutos. Remover a lamínula, invertendo a sua posição, e colocar a face com a gota sobre uma lâmina. Examinar para larvas e cistos. MÉTODO DE WILLIS FUNDAMENTO: Baseia-se na capacidade da solução saturada de cloreto de sódio em fazer flutuar ovos de helmintos considerados leves. INDICAÇÃO: 1. Recomendado para a pesquisa de ovos de helmintos de baixo peso específico como ancilostomídeos e Trichuris trichiura ou ainda de ovos férteis de Ascaris lumbricoides. Não é recomendado para protozoários, ovos inférteis de A. lumbricoides e ovos de tremaódeos ou E. vermicularis.. Este método é bastante eficiente na identificação de ovos de ancilostomídeos, sobretudo nos casos em que há baixa infestação. Pode-se usar açucar ao invés do sal no preparo da solução (Sheather). PROCEDIMENTO 1. Colocar uma quantidade de fezes de aproximadamente 1 a 2 g. coletada de várias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3 cm de diâmetro com capacidade aproximada de 20 ml. Completar ¼ da capacidade do recipiente com solução saturada de cloreto de sódio. 2. Suspender as fezes na solução saturada salina até haver uma total homogeneização. 3. A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos; não deverá haver formação de bolhas de ar entra a lamínula e a superfície do líquido. A gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula . 4. Remover a lamínula e inverter rapidamente a sua posição sobre uma lâmina. 5. Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento. CENTRÍFUGO-SEDIMENTAÇÃO POR FORMOL ACETATO DE ETILA FUNDAMENTO: Fornece o diagnóstico para ovos, larvas e cistos de todas as espécies de parasitos intestinais detectáveis, além de separar dos detritos, deixando o sedimento limpo. INDICAÇÃO: Destina-se à pesquisa de protozoários e helmintos nas fezes PROCEDIMENTO: 1. Diluir aproximadamente 2 g de fezes em 5 mL de solução de formalina a 10% e filtrar por meio de gaze dobrada. 2. colocar em tubo de centrifuga e acrescente 1 ou 2 gotas de detergente comercial. 3. acrescentar 3 mL de acetato de etila comercial; 4. tampe o tubo e agite por 10 segundos 5. destampar e centrifugar por 2 minutos a 2000rpm Observar a formação de quatro camadas distintas 1a camada - sedimento no fundo do tubo 2a camada formalina 3a camada detritos 4a camada acetato de etila 6. despreze a camadas sobrenadantes com um movimento rápido 7. ressuspender o sobrenadante com 7 ml de água. Tampe o tubo e agite 8. centrifugar 2000 rpm por 2 minutos. Desprezar o sobrenadante 9. deixar o tubo emborcado sobre gaze por 2 minutos 10. ressuspender o sedimento com lugol. Colocar uma gota do sedimento sobre lâmina e procedera leitura. FUNÇÃO DO FORMOL: fixar e manter íntegras as estruturas de ovos, larvas e cistos por períodos prolongados. Tem função também de diluente. FUNÇÃO DO ACETATO DE ETILA: o acetato de etila remove as substâncias graxas e possibilita a flutuação dos detritos. É um eficiente solvente para objetos de plástico (tubo, pipetas, estantes, empregá-los sempre com objetos de vidro) FUNÇÃO DO DETERGENTE: o detergente se destina a aumentar a positividade para ovos de A. lumbricoides. Os ovos inférteis de ascaris têm a superfície acentuadamente mamilonada, permitindo que muitas gotículas de acetato de etila se alonguem na sua face voltada para o fundo do tubo. Em consequência alguns desses ovos seriam retidos junto ao sobrenadante. Em presença de detergente, que tem a propriedade de baixar a tensão superficial, as gotículas de acetato confluem umas em relação as outras com maior facilidade, reduzindo a possibilidade delas alongarem debaixo de estruturas como os ovos inférteis de Ascaris. CENTRÍFUGO-SEDIMENTAÇÃO POR FORMOL ÉTER (MÉTODO DE RITCHIE) FUNDAMENTO: Fornece o diagnóstico para ovos, larvas e cistos de todas as espécies de parasitos intestinais detectáveis, além de separar dos detritos e gorduras fecais. INDICAÇÃO: Destina-se à pesquisa de protozoários e helmintos nas fezes FUNÇÃO DO ÉTER: O éter tem a mesma função do acetato de etila, isto é, ele dissolve as substâncias graxas e faz flutuar os detritos, porém ele é mais volátil, explosivo e inflamável. PROCEDIMENTO: 1. Colocar 1 ou 2g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10ml de água corrente ou solução salina a 0,85%; 2. Filtrar a suspensão através de gaze dobrada duas ou quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 3. Centrifugar 2000 rpm por minuto); 4. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ou solução salina a 0,85% ao sedimento antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente (ou solução salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar 2000rpm por 1 min). 5. Repita a etapa 4, até que o sobrenadante se apresente relativamente claro. 6. Depois que o último sobrenadante é decantado, ressuspender o sedimento com 1 a 2 ml de formalina a 10% (dar preferência à solução tamponada de formalina a 10% , pH. Neutro). Completar o volume da suspensão em 10 ml com formalina a 10%. Deixar em repouso em repouso durante 5 minutos. 7. Adicionar 3ml de éter ou acetado de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posição invertida, por 30 minutos. Remover a tampa com cuidado. 8. Centrifugar 2000rpm 1 min. Quatro camadas se formarão: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitas, (2) camada de formalina, (3) tampão de detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície. 9. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com um estilete fino,e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes. 10. Uma pequena quantidade de líquido que permanece nas paredes do tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento, preparando as lâminas para a pesquisa de ovos, lavas e cistos. MÉTODO DE BAERMANN-MORAES FUNDAMENTO: Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas e na tendência destas de sedimentar, espontaneamente, quando se encontram na água. INDICAÇÃO: Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra também a presença de larvas de ancilostomídeos e por vezes até adultos de nematódeos pequenos como E. vermiculares. Ao serem examinadas fezes que permaneceram, antes do exame, em temperatura ambiente por período superior a 24 horas, ou ainda de indivíduos que sofrem de constipação intestinal, ocorre a possibilidade de que as larvas encontradas sejam rabditóides ou filarióides de ancilostomídeos e não de Strongyloides stercoralis PROCEDIMENTO: 1. Encher o funil com água corrente, aquecida a 40-45ºC. 2. Abrir a pinça de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de água para evitar a formação de bolhas de ar na haste e no tubo de látex. 3. Colocar 8 a 10 g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada quatro vezes e, se necessário, juntar mais água, até que as fezes fiquem submersas. 4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 5. Abrir a pinça e coletar parte do líquido em vidro de reógio; examinar ao microscópio estereoscópio (aumentos 20 a 30 x). Deixar em repouso durante alguns minutos, pois desta forma as larvas migrarão para o centro do vidro de relógio, ou proceder de acordo com o item 6. 6. Coletar em tubo cônico de centrífuga. Centrifugar (500 x g por 1 min), e examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de Lugol, para a identificação das características morfológicas das larvas, e examinar ao microscópio com aumento de 20x. MÉTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA FUNDAMENTO: Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas de S. stercoralis contidas no material fecal. INDICAÇÃO: Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra também a presença de larvas de Ancilostomídeos, notadamente em pacientes portadores de constipação intestinal. A observação microscópica deve ser cuidadosa e toda larva visualizada deverá ser identificada segundo a chave de classificação proposta por AMATO NETO & cols. PROCEDIMENTO: 1. Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trás; 2. Encher, com aproximadamente 70 a 100 ml de água corrente aquecida a 40-45°C, um copo cônico de sedimentação (capacidade de 125ml); 3. Transferir o recipiente com as fezes para o interior do copo cônico de sedimentação, de modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para não formar bolhas de ar; 4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 5. Colher o sedimento, no fundo do copo cônico, com pipeta capilar longa. Alguns autores recomendam retirar o recipiente do copo Cônico antes da colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente, para evitar o revolvimento do líquido; 6. Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de lugol. MÉTODO DE HARADA-MORI FUNDAMENTO O método visa o cultivo de larvas em papel de filtro. INDICAÇÃO Empregado no cultivo de larvas de ancilostomídeos e Strongyloides stercoralis presentes no material fecal. PROCEDIMENTO: 1. Distribuir 0,5 g de fezes em tira de papel de filtro (3 x 15 cm), deixando as extremidades livres. 2. colocar a tira em um tubo de ensaio (18 cm), com água destilada, de modo q1ue a extremidade inferior toque na água; 3. tampar o tubo de ensaio, deixar 7 a 14 dias na temperatura ambiente 4. examinar com lupa o fundo do tubo 5. adicionar formalina 10% de piperazina a 5% e colocar o tubo de ensaio em banho-maria a 50oC por 15 minutos a fim de matar as larvas; 6. retirar as larvas e coloca-las entre lâmina e lamínula para identificação. MÉTODO DE TAMISAÇÃO (pesquisa e identificação de proglotes) FUNDAMENTO: Este método fundamenta-se na tamisação do material fecal, como meio de captura de anéis (proglotes) de tenídeos. INDICAÇÃO: É indicado para a retirada de anéis de escólex de tenídeos das fezes para fins de diagnóstico para controle de cura; como também são encontrados vermes adultos de A. lumbricoides, E. vermicularis, T. trichiura, Ancilostomídeos e H. nana. Estes parasitas são encontrados no bolo fecal durante o início do tratamento. recomenda-se realizar o método com o material fecal excretado durante o dia. Para melhor conservação, as fezes devemser colocadas em formalina 10% PROCEDIMENTO: Emulsionar as fezes com água. Coar a emulsão através de peneira metálica. Este procedimento deve ser realizado em uma pia, servindo-se de um jato de água corrente. Vermes adultos como o Ascaris lumbricoides e Enterobius vermicularis são encontrados freqüentemente misturados ou na superfície das fezes, como também as proglotes de tenias. Outros helmintos como o Trichuris trichiura, ancilostomídeos e Hymenolepis nana são depositados no bolo fecal após o início do tratamento. Freqüentemente poderão ser encontrados helmintos adultos nas amostras fecais e ausência dos ovos. Esses processos macroscópicos são vantajosos para a demonstração e coleta de pequenos helmintos, de proglotes e de escólex. Identificação de Proglotes de Taenia Dois métodos são indicados para a identificação de proglotes de Taenia: o ácido acético e o de CAMPOS (AMATO NETO & CORREA, 1980). Método do Ácido Acético Glacial: 1. Colocar em uma placa de Petri, contendo ácido acético glacial, a proglote a ser identificada, durante 15 a 20 minutos. 2. Após o período, comprimi-la entre lâminas. 3. Examinar sob iluminação intensa. Método de CAMPOS: 1. Dissolver três comprimidos de metoquina em 5 ml de água destilada-deionizada. 2. Mergulhar nesta solução, durante 15 minutos, a proglote a ser identificada. 3. Após este período, comprimi-la entre lâminas. 4. Examinar sob iluminação intensa. MÉTODO DA FITA GOMADA (GRAHAM) FUNDAMENTO Baseia-se na utilização da fita gomada na apreensão de estágios evolutivos de parasitos, localizados na região perianal. INDICAÇÃO Este método é indicado para a pesquisa de todos os parasitos que prioritária ou ocasionalmente se deslocam até a região perianal. Assim sendo, poderemos detectar o Enterobius vermicularis, Taenia sp, e eventualmente ovos de Ascaris lumbricoides, Ancilostomídeos e Trichuris trichiura. PROCEDIMENTO 1. Coleta do material deverá ser realizada pela manhã antes que o paciente realize sua higiene. Recomendar que o paciente não utilize pomada ou outro qualquer medicamento de uso tópico na região anal ou perianal na noite anterior ao exame. 2. Tomar um pedaço de fita gomada com aproximadamente 10 cm, colar nas extremidades dois retângulos de papel "oficio", a fim de servirem para identificação dos pacientes e manuseio do técnico, sem risco de contaminação. 3. Montar em tubo de ensaio. (l5xI50) de modo que a parte adesiva permaneça livre, na parte externa do fundo do tubo. 4. Recomendar que o paciente fique em decúbito ventral, e aplicar a fita gomada montada sobre a região perianal, tendo o cuidado de afastar os glúteos. 5. Após a coleta, aplicar a fita gomada sobre a lâmina pressionando levemente do centro para a periferia a fim de evitar a apreensão de bolhas de ar. 6. Preparar no mínimo duas lâminas. Em seguida levar a microscopia. 7. As lâminas assim preparadas poderão ser encaminhadas até dois meses após, devido a capacidade de conservação da técnica TÉCNICA DE KINYOUN FUNDAMENTO Os coccídios coram-se pela fucsina básica , adquirindo coloração vermelha ou rosa brilhante intensa; e são álcool ácido resistente, destacando-se de outros resíduos, leveduras e bactérias. INDICAÇÃO Este método é indicado para pesquisa dos coccídios intestinais, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis e Isospora belli PROCEDIMENTO: 1. Preparar o esfregaço com uma a duas gotas de fezes frescas ou preservadas. Deixar secar a temperatura ambiente. 2. Fixar submetendo direto ao calor rapidamente. 3. Cobrir com Fucsina 3 a 5 minutos 4. Lavar rapidamente 5. Diferenciar com álcool ácido até não sair mais corante. 6. Lavar com água 7. Contra corar com azul de metileno 30 segundos a 1 minuto. 8. Deixar secar e examinar ao microscópio Obs.: a coloração de fundo da preparação depende do corante utilizado; azul de metileno concede a cor azul aos organismos que não se coram pela fucsina, enquanto o verde malaquita cora o fundo verde e o ácido pícrico em amarelo SOLUÇÃO DE FUCSINA CARBÓRICA Fucsina básica 4,0 g Fenollíquido 8,0 g Álcool a 95 % 20 mL Água destilada 100 mL Dissolver a fucsina no álcool e no fenol. Filtrar antes de usar. SOLUÇÃO DE ÁCOOL-ÁCIDO CLORÍDRICO A 0,1% HCl P.A 0,1 mL Álcool 99 mL SOLUÇÃO ESTOQUE DE AZUL DE METILENO Azul de metileno 1,4 g Álcool a 95% 100 mL SOLUÇÃO DE USO AZUL DE METILENO Solução estoque 10 mL Água destilada 90 mL MÉTODOS QUANTITATIVOS Estes métodos são empregados quando se deseja avaliar a intensidade da infestação parasitária, ou ainda quando se pretende comparar métodos laboratoriais. Descreveremos dois destes métodos; o de STOLL-HAUSHEER e o KATO-KATZ. MÉTODO DE STOLL-HAUSHEER (contagem de ovos) FUNDAMENTO Baseia-se na diluição de quantidade conhecida de fezes e a contagem do número de ovos de uma amostra da diluição, de maneira a deduzir a intensidade parasitária. INDICAÇÃO Indicado na avaliação da carga parasitária e suas repercussões patogênicas. Ex. Ancilostomídeos. PROCEDIMENTO 1. Preencher com NaOH (N/1 O), o frasco de Stoll até a marca que corresponde a 56 mL. 2. Adicionar fezes até que o líquido (NaOH) alcance a marca de 60 mL. 3. Introduzir no frasco pérolas de vidro (+ 12) e em seguida, obturá-lo com rolha de borracha. 4. Agitar bem até a perfeita homogeneização logo após, retirar com pipeta aspiratória 0,1 mL da suspensão. Pipeta aspiratória ou pipeta automática. 5. Colocar em lâmina, cobrir com lamínula e examinar em pequeno aumento. 6. Contar o número total de ovos na lâmina. 7. Calcular o número de ovos por grama de fezes, multiplicando o valor encontrado por 150 8. Examinar sempre mais de uma lâmina e trabalhar com a média aritmética. O resultado encontrado é indicado por alguns autores como ovos/rnL OBS. O resultado deverá ser corrigido segundo a consistência das fezes. Fezes formadas, multiplicar o resultado por 1; fezes pastosas por 1,5; e fezes diarréicas por 3. Os resultados conseguidos em material fecal líquido não são confiáveis. A agitação recomendada no ítem 4 nunca deverá ser com movimentos circulares e sim de alto para baixo. MÉTODO DE KATO-KATZ FUNDAMENTO Fundamenta-se na contagem de ovos de helmintos em lâmina qpós o peneiramento e contato com substância conservadora. INDICAÇÃO Indicado para avaliação da carga parasitária no diagnóstico e controle de cura após o tratamento. Ex. Schistosoma mansoni. Contar os ovos encontrados em toda a lâmina e multiplicar por 23, a fim de ter o número de ovo por grama de fezes. OBS.:Apesar de ser recomendado para a pesquisa de helmintos, este método tem sido empregado com mais frequência na esquistossomose, devido às modificações que podem ocorrer na morfologia dos ovos de outros parasitas. A função da glicerina é a clarificação da matéria fecal, tornando-a transparente e permitindo melhor visualização dos ovos aí presentes. Os ovos de Ascaris e de Trichuris conservam-se bem por semanas ou meses, enquanto os ovos de Ancilostomídeos têm sua visualização comprometida por este método. PROCEDIMENTO: 1. Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente. 2. Comprimir a tela metálica ou de náilon sobre as fezes, fazendo com que parte passe através das malhas. 3. Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício do cartão, colocado sobre a lâmina. 4. Depois de encher o orifício central, remover com cuidado o cartão, deixando as fezes com a lamínula. 5. Cobrir as fezes com a lamínula de celofane, invertendo e pressionando a lâmina sobre o papel absorvente. 6. Deixar a preparação em repouso (clarificação) durante 30 minutos a 34-40°C ou à temperatura ambiente por 1-2 horas. 7. Examinar apreparação ao microscópio MÉTODOS PARA EXAME DOS PARASITOS DO SANGUE O exame microscópico do sangue constitui valioso recurso para o diagnóstico das doenças parasitárias cujos agentes apresentam formas evolutivas sanguíneas. A preparação de bons esfregaços sanguíneos é importante na diferenciação de parasitos, principalmente de protozoários. COLHEITA DE SANGUE O sangue pode ser colhido por punção do lóbulo da orelha, da superfície palmar da ponta de um dedo da mão, no caso de lactentes da superfície plantar do grande artelho ou no calcanhar. No caso da orelha, é a margem livre do lóbulo e não a face lateral que deve ser puncionada. A picada deve ser feita com deliberação e lentamente, para não provocar dor. A picada deve ter profundidade de 3mm. Não se deve utilizar um local edemaciado ou congestionado. Em animais de laboratório a colheita de sangue é feita segundo o seu porte. EXAME A FRESCO Uma pequena gota de sangue, examinada entre lâmina e lamínula em médio aumento. Esta nos permite demonstrar de forma rápida microfilárias e Trypanosoma. EXAME SECO (PREPARAÇÃO CORADA) Pode ser realizado em gota espessa e/ou camada delgada ou esfregaço. GOTA ESPESSA Colher 3 a 4 gotas de sangue na lâmina e com a ponta de um estilete, desfibriná-la. Deixar secar ao abrigo de corrente de ar quente que podem causar esporos de fungos contaminantes, ou deixar secar em estufa a 37 C. o desfibramento impede a coagulação e consequentemente fendilhamento da preparação, garantindo a necessária aderência do sangue ao vidro durante a coloração. Realizar desemoglobinização antes da coloração. CAMADA DELGADA OU ESTIRAMENTO Colhida a gota de sangue na lâmina, imedatamente coloca-se a lâmina distensora na posição. Por capilaridade, o sangue espalha prontamente na zona de contato das lâminas. Num movimento rápido e contínuo, a lâmina distensora é deslocada para frente, obtendo-se assim a camada delgada. COLORAÇÃO DA CAMADA DELGADA MÉTODO DE GIEMSA FUNDAMENTOS Fixação do estiramento pelo metanol e coloração pela solução de Giemsa. MÉTODO DE LEISHMAN FUNDAMENTOS Fixação e coloração do estiramento pela solução de azul de metileno e eosina BIBLIOGRAFIA NEVES, D. P & Cols. Parasitologia humana. Ed. Atheneu, 11a ed, 2005. REY, L. Bases da Parasitologia Médica. Ed. Guanabara Koogan, 3a ed, 2010. REY, L. Parasitologia. Ed. Guanabara Koogan, 4a ed, 2008. CIMERMAN, B.; FRANCO, M.A. Atlas de parasitologia. São Paulo: Atheneu, 1999. COURA, J. R. Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias. Volumes I e II. Editora Guanabara Koogan. 2005 DE CARLI , G.A.- Parasitologia Clínica. Seleção de Métodos e técnicas de Laboratório para o Diagnóstico das Parasitoses Humanas SP. Ed.Atheneu,810pp, 2001 This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.