Aula 10 e 11 amilases

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
1
Katialaine Araújo
CAP – Sala 205 Bl. 6 
katialaine@yahoo.com.br
Bioquímica Tecnológica 
Enzimas industriais: Amilases
Introdução
• Amido
- O mais abundante carboidrato de reserva na natureza
- Encontrado em diferentes órgãos vegetais
Sementes, frutas, tubérculos etc
- Muitos destes materiais = importância na alimentação humana
Milho, arroz, batata, trigo, mandioca etc
- Importância crescente na produção de bioprodutos
Fonte renovável de energia (etanol)
Matéria prima para plásticos biodegradáveis (bioplásticos)
70-80% das calorias de consumo humano
- Aplicação industrial: espessante, estabilizador de colóides, agente 
gelificante e de “corpo”, retenção de H2O, adesivo etc.
• Amido
- Homopolissacarídeo  monômeros = glicoses
Introdução
Introdução
Introdução
Introdução
Introdução
• Amilose
- Molécula linear 
(ramificação <0,5%)
- Ligações α-1,4
- ~20-30% do amido
- DP: 500-5000 
resíduos de glicose
- ~250.000 Da
• Amilopectina
- Estrutura ramificada (ramificação: 4-6%)
- Ligações α-1,4 e α-1,6 (17-25:1)
- 0,1-5⋅108 Da
- DP: 60.000-3.000.000 resíduos Gli
- ~75% do amido
• Amilopectina
• Amilopectina
Dupla-hélice
Introdução
• Grânulos de amido
- Insolúveis
- Pouca hidratação (10-20%) em H2O fria – processo reversível
Suspensão de baixa viscosidade quando misturado em água
- Forma goma (dispersão ↑visc.) quando aquecido em H2O
- Proporção amilose:amilopectina, temperatura de gelificação e 
tamanho do grânulo é característica de cada tipo de amido
Batata Mandioca Trigo Milho
Tamanho (µm) 5-100 4-35 2-55 2-30
Forma Oval/esférico Oval arredondado arredondado/poligonal
% Amilose 21 17 28 28
Tgelatinização (°C) 58-65 52-65 52-85 62-80
% mercado ~5 ~5 ~8 ~80
Introdução
• Grânulos de amido – ao microscópio (MEV)
Introdução
batata mandioca
trigomilho
• Grânulos de amido – ao microscópio
Birrefringência
Resultado do alto grau de orientação molecular interna
Cruz de polarização (“Cruz de Malta”) em microscópio com luz polarizada
Introdução
Introdução
Moléculas de amilose maiores (centro)
Moléculas de amilose menores (periferia) Parte da amilose podem se cristalizar 
junto com a amilopectina p/ formar 
as lamelas cristalinas
Localização da amilose não é muito certa, mas imagina-se que ela se concentre 
predominantemente na região amorfa
arranjo radial ordenado
Propriedades tecnológicas
• Gelificação
- Ruptura da ordem molecular no interior do grânulo com aquecimento
Inchaço irreversível
Perda da birrefringência e da cristalinidade
Lixiviação da amilose (grânulo  fase aq)
Ruptura do grânulo com a manutenção do aquecimento
Resultado: pasta de amido = goma viscosa
H2O formam ponte H entre 
amilose e amilopectina
Hidratação e solubilização 
das moléculas de amido
- Propriedades de inchamento e gelatinização dependem de:
Estrutura amilopectina (comp. cadeia, grau ramificação, peso molecular)
Composição do amido (prop. amilose:amilopectina, teor de P, lipídeos)
Arquitetura granular (ex: qto ↑cristalinidade = >estabilidade, >resistência 
à gelatinização)
viscosidade temperatura
tempo
Brabender ou RVA
• Retrogradação
- Formação de um gel firme e viscoelástico após resfriamento
- Principio: reassociação das cadeias em um estado mais ordenado
Formação de áreas cristalinas, aumento da opacidade
Hélices simples, duplas hélices
Saída de água do sistema = SINERESE
Aumento da viscosidade
- Amilose retrograda mais rapidamente que amilopectina
Forte tendência a se reassociar  pontes H entre amiloses adjacentes 
= estruturas cristalinas (dupla hélice)
- Processo responsável (pelo menos em parte) por:
Envelhecimento do pão
Perda de água em sobremesas (amido como gelificante)
Diminuição da digestibilidade do amido
Propriedades tecnológicas
• Tipos de amido
- Nativo (sem modificação)
- Modificados
Amidos cerosos (waxy starches)
Amidos com alto teor de amilose
Podem ser resultado de 
modificações genéticas
Modificações físicas
Modificações químicas
Modificações enzimáticas
Propriedades tecnológicas
• Tipos de amido: amido ceroso
- Virtualmente livre de amilose
Gelatiniza facilmente – pasta clara e pegajosa, não forma gel
Estabilizante e espessante em alimentos (esp. refrigerados/congelados)
Menor retrogradação
Estabilidade a congelamento-descongelamento
Textura (suavidade, cremosidade) e aparência
Preparação de adesivos
Propriedades tecnológicas
• Tipos de amido: amido com alto teor de amilose
- 50 a 70% (ou até 90%) de amilose
Elevada força do gel
Elevada tendência a retrogradar
Habilidade de formação de filme
Maior temperatura de gelatinização (em condições normais de 
cozimento, não elevam a viscosidade)
Diminui absorção de gordura em produtos fritos e os deixa crocantes
Propriedades tecnológicas
Amidos modificados
• O que é?
- Alteração do amido  propriedades diferenciadas
Características melhoradas das massas e dos géis
Suportar as condições de processamento ou inserir novas funcionalidades
1. modificar as características de cozimento;
2. diminuir retrogradação e tendência em formar géis;
3. aumentar a estabilidade ao resfriamento e descongelamento;
4. aumentar transparência e adesividade;
5. melhorar a textura e propiciar formação de filmes; 
6. adicionar grupamentos hidrofóbicos e introduzir poder emulsificante.
• Por que?
• Amido pré-gelatinizado
- Instantâneo, solúvel em água fria
Gelatinização e rompimento dos grânulos
- Pré-cozido
- Suspensão de amido  secagem
- Produz dispersões viscosas a frio
Podem ser utilizados sem cozimento
- Empregado em produtos instantâneos
Sopas, cremes, sobremesas, produtos de panificação e confeitaria etc.
- Modificação física
Amidos modificados
• Modificação por ação de ácidos
- Tratamento com HCl a quente
- Hidrólise (com possível repolimerização): formação de dextrinas
- Géis mais claros, fluidos e menos viscosos
- Balas de goma, pães de queijo e adesivos.
- Propriedades adesivas e formadoras de filmes
- Solubilidade em H2O fria
Amidos modificados
• Oxidação
- Hipoclorito  oxidação das hidroxilas
Grupos carbonílicos ou carboxílicos ao acaso
Carga residual negativa  repulsão das moléculas
Dificulta aproximação das cadeias: estabiliza dispersão, retarda retrogradação
↓viscosidade, ↓T gelatinização, ↑claridade
Exemplo de aplicação: massas, panificação (↓retrogradação)
• Outros
- Fosfatação (monoéster de fosfato-amido)
- Esterificação (ex: ác. acético, ác. cítrico)
Amidos modificados
• Ligações cruzadas
- Maior temperatura de gelatinização
- Maior resistência do grânulo (T, cisalhamento, pH)
- Pasta com maior viscosidade
- Produtos submetidos a ↑T, ↓pH (ex: produtos enlatados)
Cadeia 1
Cadeia 2
OH
OH
O
OO
Cadeia 1
Cadeia 2
O
O
C=O
C=O
CH2
CH2+
Anidrido 
succínico
Amidos modificados
Ciclodextrinas
• Características
- Oligossacarídeos cíclicos
- α-D-glicopiranoses unidas por ligações 1,4
α (6), β (7) ou γ (8 α-D-glicopiranoses)
- Funil truncado, com núcleo hidrofóbico e 
superfície hidrofílica
• Características
14,5g/100mL 1,9g/100mL 23,2g/100mL (solubilidade)
β: as mais baratas
Diferenças nas P.H. intramoleculares e melhor ajuste c/ estrutura da H2O = ↓entropia 
[Sabadini et al. (2006) Carbohydrate Reseach. 341(2):270-274]
Ciclodextrinas
• Utilização
- Complexos de inclusão com moléculas 
hóspedes não polares 
- Encapsulação de aromas, fármacos,compostos de cor etc.
Mascara constituintes indesejáveis (odor 
desagradável, compostos amargos)
Protege conta oxidação química e reações 
indesejadas (interações com componentes da 
formulação)
Aumenta solubilidade de compostos lipofílicos
Liberação controlada de compostos
Estabilizam compostos voláteis (estocagem)
Ciclodextrinas
• Preparo
- Derivados do amido parcialmente hidrolizado
- Ciclodextrina glicosil transferase (CGTase): ciclização intramolecular
Bacillus circulans, B. macerans
E.C. 2.4.1.9
Amido parcialmente liquefeito ciclodextrinas
CGTase
Amido
α-amilase
Ciclodextrinas
• Amido
- Gelificação
Espessante, estabilizante
- Propriedades dependem do tipo do amido
- Propriedades alteradas: amidos modificados
• Ciclodextrinas
- Resultado da alterações enzimáticas do amido
- Propriedades muito interessantes para indústrias
Ex: encapsulação
Resumindo....
Enzimas amilolíticas
• Enzimas que atuam sobre o amido
- Utilizadas principalmente em: - Resultados desejáveis:
Aumento do poder redutor
Propiciam fermentação (leveduras)
Retardam retrogradação
Produção de xaropes
Dextrinas
Etapa anterior a fermentação
- α-amilase
- β-amilase
- glicoamilase e α-glicosidase
- isoamilase e pululanase
• Enzimas que atuam sobre o amido
- Quatro grupos (van der Maarel, 2002):
1. Endoamilases
2. Exoamilases
3. Enzimas desramificantes
4. Transferases
α-Amilase
β-Amilase
α-Glicosidase
Glicoamilase ou amiloglicosidase
Isoamilase
Pululanase
Ex: ciclodextrina glicosil transferase (CGTase)
Enzimas amilolíticas
• α-Amilase
E.C. 3.2.1.1
A + H2O  B + C
hidrolases
glicosilases
Glicosidases em 
ligações O-glicosil
Endoidrólise de ligações α-
D-1,4-glicosidicas em 
polissacarídeos contendo 3 
ou + α-D-glicoses unidas 
por ligações α-1,4
Enzimas amilolíticas
• α-Amilase
- Hidrolisa ligações glicosídicas α-1,4 internas ao acaso, exceto 
aquelas próximas à ramificação
- Produtos de hidrólise:
Poli e oligosacarídeos de glicose (dextrinas) com diferentes tamanhos
α-Limite dextinas (produtos ramificados de diferentes tamanhos)
(produtos hidrolisados mantêm a forma α)
- Propriedades:
Dependentes de Ca2+ (cofator para a maioria das α-amilases, além 
de estabilizar a enzima contra desnaturação térmica e pH)
pH: ~neutro (5-7), mas podem resistir até pH 4 a 11
T: α-amilases termorresistentes resitem até 100°C (algumas até 130°C)
- Aspergillus oryzae, Bacillus amyloliquefaciens, B. licheniformis
- ↓viscosidade, ↑poder redutor
Enzimas amilolíticas
• α-Amilase
Enzimas amilolíticas
• α-Amilase
Enzimas amilolíticas
• α-Amilase
- α-amilase do malte
- α-amilase fúngica
- α-amilase bacteriana
pHótimo = ~5,0 (pHestab. = 4,5-9,0)
Tótima = 50-60°C
pHótimo = 5,0 (pHestab. = 4,5-7,5)
Tótima = 50-60°C
pHótimo = 5,5-7,0 (pHestab. = 5-9)
Tótima = 90°C
B. licheniformis
pHótimo = 6,0-7,0 (pHestab. = 5-9)
Tótima = 65-80°C
B. subtilis
Enzimas amilolíticas
E.C. 3.2.1.2
A + H2O  B + C
hidrolases
glicosilases
Glicosidases em 
ligações O-glicosil
Exoidrólise de ligações α-D-
1,4-glicosidicas em 
polissacarídeos com 
remoção sucessiva de β-
maltoses a partir da 
extremidade não redutora
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
- Hidrolisa ligações glicosídicas α-1,4 liberando maltoses a partir 
das extremidades não redutoras
- Produtos de hidrólise:
Maltoses (forma β) e β-limite dextrinas
Não atuam em α-1,6: degradação incompleta da amilopectina
- Propriedades:
Não requerem Ca2+
• β-Amilase
Apenas 50-60% de conversão a maltose
pH: pH 4 a 6
T: 30-50°C (rara entre termófilos, inativada a >60°C)
Enzimas amilolíticas
- Origem:
• β-Amilase
Vegetais: Ocorre em cevada, trigo, batata doce e soja
Pouco relatada em micro-organismos
Descrita em Pseudomonas, Bacillus, Streptococcus entre outros
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase
Enzimas amilolíticas
• β-Amilase: β-limite dextrinas
Qi & Tester (2011) J Pharmaceut Sci 14(1):60-66
Enzimas amilolíticas
E.C. 3.2.1.3
A + H2O  B + C
hidrolases
glicosilases
Glicosidases em 
ligações O-glicosil
Exoidrólise de ligações α-D-
1,4-glicosídicas de 
terminais não redutores 
com liberação sucessiva β-
D-glicoses
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
E.C. 3.2.1.20
A + H2O  B + C
hidrolases
glicosilases
Glicosidases em 
ligações O-glicosil
• α-Glicosidase
Exoidrólise de ligações α-D-
1,4-glicosídicas de 
terminais não redutores 
com liberação sucessiva α-
D-glicoses
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase ou amiloglicosidase
- Hidrolisa ligações glicosídicas α-1,4 liberando glicoses a partir 
das extremidades não redutoras
Atua também em ligações α-1,6, embora a uma taxa menor
- Aspergillus niger (pHótimo = 4,5; Tótima = 60°C)
- Rhizopus sp (pHótimo = 5,0; Tótima = 55°C)
- Condições ótimas: pH = 4,5-5,5 e T = 45-60°C (rara entre termófilos)
Enzimas amilolíticas
• α-Glicosidase
α-glicosidase glicoamilase
Substrato Cadeia curta, oligossacarídeos Cadeias longas, polissacarídeos
Produto α-D-glicoses β-D-glicoses
- Hidrolisa ligações glicosídicas α-1,4 liberando glicoses a partir 
das extremidades não redutoras
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
• Glicoamilase
Enzimas amilolíticas
E.C. 3.2.1.68
A + H2O  B + C
hidrolases
glicosilases
Glicosidases em 
ligações O-glicosil
Hidrólise de ligações 
α-D-1,6-glicosídicas
• Isoamilase
Enzimas amilolíticas
E.C. 3.2.1.41
A + H2O  B + C
hidrolases
glicosilases
Glicosidases em 
ligações O-glicosil
Hidrólise de ligações 
α-D-1,6-glicosídicas
• Pululanase
Enzimas amilolíticas
• Isoamilase • Pululanase
- Hidrólise de ligações α-D-1,6-
glicosídicas em glicogênio, 
amilopectina e β-limite dextrinas. 
- Hidrólise de ligações α-D-1,6-
glicosídicas em glicogênio, 
amilopectina, α- e β-limite dextrinas.
Enzimas desramificantes
- Não ataca pululano. - Atua sobre pululano.
Enzimas amilolíticas
Pululano é um tipo de polímero 
produzidos por alguns tipos de 
MO (maltotrioses ligadas entre si 
por ligações alfa 1,6)
• Isoamilase
• Pululanase
- Maior afinidade por cadeias longas
Enzimas desramificantes
- Maior afinidade por cadeias curtas
- Klebsiella, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Aerobacter
- Klebsiella sp.
pHótimo = 6,0 (5,5-6,5)
Tótima = 50°C
- Pseudomonas 
amyloderamosa
pHótimo = 3,0-4,0
Tótima = 50-55°C
- Favobacterium sp.
pHótimo = 6,0
Tótima = 40°C
- Produtos: oligossacarídeos de glicoses unidas por ligações α-1,4
- Thermus 
caldophilus
pHótimo = 5,5
Tótima = 75°C
Enzimas amilolíticas
• Isoamilase, pululanase
Enzimas amilolíticas
• Isoamilase, pululanase
Enzimas amilolíticas
Aplicações das enzimas amilolíticas
• Alimentos
- Panificação
↓viscosidade da massa, ↑volume do pão, melhora textura (+ homogênea),crosta mais macia, melhora o gosto e a cor
Previne envelhecimento/endurecimento (< retrogradação)
- Cervejaria
Malte já tem enzimas endógenas
Uso de cereais não maltados requer suplementação de enzimas
Hidrólise do amido, aumento da fermentabilidade
Cerveja light (glicoamilase)
- Sucos e frutas
Previne turvação (retrogradação do amido)
Excesso de enzima pode causar “gomosidade” no pão
• Detergentes
• Ração animal
• Papel e celulose
- α-Amilase
Auxilia limpeza  remove amido que “cola” sujidades
• Têxtil
- Degomagem
Amilases: forma branda de remover goma (base de amido) utilizada p/ 
↑resistência na tecelagem e evitar rompimento da fibra
Especialmente úteis em detergentes para lava-louças
- Amilases aumentam a digestibilidade do amido
- Amidos modificados enzimaticamente (α-amilase)
Utilizado para recobrir o papel (proteção mecânica durante o processo, 
↑resistência do produto final)
Aplicações das enzimas amilolíticas
• Produção de xaropes (hidrólise do amido)
- Maltodextrinas (α-amilases bacterianas)
- Xaropes de maltose
- Xaropes de glicose
- HFCS (High Fructose Corn Syrups)  xarope de milho com alto 
teor de frutose – açúcar industrial dos americanos (não usam 
sacarose)
- Frutose
- 30% mais doce que a sacarose
- Não cristalisa
Aplicações das enzimas amilolíticas
Produção de HFCS
Van der Maarel, et al. (2002) 
J. Biotechnol. 94:137–155
• α-Amilase
• β-Amilase
• Glicoamilase
• Enzimas desramificantes
- Endoenzima, ataca α-1,4 ao acaso
- Enxoenzima, ataca α-1,4 a partir da extremidade não redutora 
liberando maltose
- Enxoenzima, ataca α-1,4 (e α-1,6) a partir da extremidade não 
redutora liberando glicose
- Ataca α-1,6 no interior da cadeia
- Isoamilase e pululanase
Resumindo....
Bibliografia
1. Damodaran, S.; Parkin, K.L.; Fennema, O.W. Química de 
alimentos de Fennema. 4a Ed. Artmed. 2010. Cap. 3.
2. Denardin, C.C.; Silva L.P. Estrutura dos grânulos de amido e 
sua relação com propriedades físico-químicas. Ciência Rural. 
39(3):945-954, 2009.
3. Polaina, J.; MacCabe, A. P. Industrial enzymes: Structure, 
function and application. Springer. 2007. Cap 2.
4. Van der Maarel, M.J.E.C.; Van der Veen, B.; Uitdehaag, 
J.C.M.; Leemhuis, H.; Dijkhuizen, L. Properties and 
applications of starch-converting enzymes of the α-amylase 
family. Journal of Biotechnology. 94:137–155, 2002.
Créditos:
Estas aulas foram originalmente criadas pelo professor Juliano 
Bicas e posteriormente adaptadas pelas professoras Isabel 
Braga e Katialaine Araújo