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Análises 
Químicas
e Bioquímicas
em Plantas
Egídio Bezerra Neto
Levy Paes Barreto
UFRPE
2011
Ministério da Educação
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
Reitor: 
Prof. Valmar Corrêa de Andrade
Vice-Reitor: 
Prof. Reginaldo Barros
Diretor da Editora Universitária da UFRPE: 
Antão Marcelo Freitas Athayde Cavalcanti
Av. Dom Manoel de Medeiros, s/n 
Dois Irmãos – Recife / PE
CEP: 52171-900 
Autores: 
Prof. Egídio Bezerra Neto e Prof. Levy Paes Barreto
Projeto Gráfico e Capa:
Bruno de Souza Leão
Departamento de Química
Tel.: (81)3320-6367
egidio@dq.ufrpe.br
levy@dq.ufrpe.br
Catalogação na Fonte
Setor de Processos Técnicos da Biblioteca Central – UFRPE
B574m Bezerra Neto, Egídio
 Análises químicas e bioquímicas em plantas /
 Egídio Bezerra Neto, Levy Paes Barreto. --
 Recife: UFRPE, Editora Universitária da UFRPE, 2011.
 261p. : il.
 1. ANÁLISE QUÍMICA 2. QUÍMICA VEGETAL
 3. NUTRIÇÃO MINERAL I. Barreto, Levy Paes
 II. Título
 CDD 581.19
ISBN: XXXXXXXXXXXXXX
Apresentação
1 | Coleta e Preparo de Amostra 
Vegetal para Análise Química
2 | Determinação de Umidade
3 | Determinação de Resíduo 
Mineral (R.M.)
4 | Determinação de Açúcares 
Redutores em Caldo de Cana
5 | Determinação de Sacarose 
em Caldo de Cana
6 | Determinação de Amido
7 | Determinação de Carboidratos 
Solúveis Totais
8 | Determinação de Sacarose
9 | Determinação de Açúcares Redutores
10 | Determinação de Carboidratos 
Totais Não Estruturais
11 | Determinação de Óleo em 
Sementes de Oleaginosas 
12 | Determinação de Fibra Bruta
13 | Determinação de Nitrogênio Total 
e Estimativa do Teor de Proteína Bruta
14 | Determinação de Proteína Solúvel 
 
15 | Determinação de Aminoácidos 
Livres Totais 
 
16 | Determinação de Prolina Livre 
em Tecido Foliar Fresco
7
Su
m
ár
io
9
13
16
 
20
 
27
35
 
41
48
53
 
59
 
64
69
 
73 
79
 
84
 
90
17 | Determinação de Glicinabetaina 
 
18 | Determinação de Nitrato 
em Tecido Vegetal 
 
19 | Determinação da Atividade de Nitrato 
Redutase (E.C.1.6.6.1) em Tecido Vegetal 
 
20 | Determinação da Atividade 
da Peroxidase (EC 1.11.1.7) 
 
21 | Atividade da Fenilalanina 
Amônia Liase (EC. 4.3.1.5) 
 
22 | Determinação da Atividade 
da Beta Glucanase (EC 3.2.1.39) 
 
23 | Separação de Pigmentos Fotossintéticos por 
Cromatografia em Papel 
 
24 | Determinação de Clorofila 
em Tecido Foliar 
 
25 | Derminação da Acidez 
em Suco de Frutas 
 
26 | Determinação do pH em Suco de Frutas 
 
27 | Determinação de SST em Suco de Frutas 
 
28 | Determinação de Vitamina C 
em Suco de Frutas 
 
29 | Determinação de Fenóis Totais 
 
30 | Determinação de Fenóis 
Totais e Taninos
93
99
103
110
115
119
123
127
130 
136
138
141
146
150
31 | Determinação de Carbono Orgânico 
Total em Tecido Vegetal 
 
32 | Digestão Nitro-Perclórica para Análise 
de Elementos Minerais 
 
33 | Determinação de Fósforo 
 
34 | Determinação de Enxofre 
 
35 | Determinação de Cloreto 
 
36 | Determinação de Boro 
 
37 | Determinação de Silício 
 
38 | Determinação de Sódio e Potássio em 
Tecidos Vegetais por Fotometria de Chama 
 
39 | Determinação de Nutrientes Minerais por 
Espectrofotometria de Absorção Atômica 
 
Anexo 1 | Conselhos Úteis para 
Trabalhos em Laboratório 
 
Anexo 2 | Instruções para Elaboração 
de Relatórios de Análises Químicas 
 
Anexo 3 | Transformações de Resultados 
de Análises Químicas 
 
Anexo 4 | Exercícios Propostos 
 
Anexo 5 | Padronização de Soluções 
 
156
161
165
170
173
177
182
188
192
203
205
207
209
240
Anexo 6 | Composição Bromatológica 
Aproximada de Algumas Hortaliças, 
Frutas e Culturas de Larga Escala 
 
Anexo 7 | Princípios Básicos de Análises 
Espectrofotométrica 
 
Anexo 8 | Tabela de Eynon-Lane 
para Análise de Açúcares, 
Titulando 10 mL da Solução de Soxhlet 
 
Anexo 9 | Concentração de Alguns Ácidos 
Comuns em Laboratórios 
 
Anexo 10 | Teores Adequados de Nutrientes 
Minerais nas Folhas para Diversas Culturas 
 
Anexo 11 | Tabela Períódica 
dos elementos químicos
254
256
257
260
246
248
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 7
ApresentAção
O livro “Análises Químicas e Bioquímicas em Plan-
tas” é direcionado à área agrária, mais especificamente às 
Universidades e Centros de Ensino. Foi concebido com base 
no interesse dos professores-autores Dr. Egídio Bezerra Neto 
e Levy Paes Barreto (que lecionam no Departamento de Quí-
mica da Universidade Federal Rural de Pernambuco) de favo-
recer o processo de aprendizado ao trazer para os estudantes 
valiosas recomendações sobre trabalhar num laboratório, a 
sequência usada na elaboração de relatórios de aulas práticas 
(que tanto os confunde) e representações de tabelas. Os que 
desejarem aprender vão encontrar nesse livro uma ferramen-
ta útil para responder aos seus questionamentos no que con-
cerne a essas análises.
A estrutura de cada prática traz esclarecimentos importan-
tes que se traduzem logo na introdução, seguida pelos métodos 
e técnicas utilizados. Para sedimentar o aprendizado, o livro 
conta com exercícios propostos nos anexos. Tais ações desen-
volvem sobremaneira o lado cognitivo e fazem aflorar o interes-
se por um tema que pertence à realidade do mundo acadêmico 
e que no futuro, fará parte do dia a dia dos profissionais que a 
Universidade assume a missão de formar.
Considero meus queridos colegas Egídio e Levy pesquisa-
dores competentes, que com muita dedicação nos presenteiam 
esta obra: ao mesmo tempo um material rico, que norteia as 
análises de natureza Química e Bioquímica.
Agradeço o convite para apresentar esse trabalho, o que me 
honrou. Expresso também a minha alegria pela homenagem 
(veja contra-capa) ao meu também querido colega Prof. Emano-
el Lopes de Albuquerque.
Sêneca nos disse que “Ensinando, aprende-se”. Este livro é 
uma prova do trabalho responsável dos professores que divi-
dem agora com os seus alunos um pouco do que aprenderam 
ensinando e os convidam a aprender mais, para que um dia 
possam ensinar outros. Esse é o pensamento coletivo da nossa 
Universidade, comprometida na busca do conhecimento cien-
tífico. E é na difusão desse conhecimento que encontramos no 
meio acadêmico a contribuição maior que podemos deixar para 
a sociedade.
Rosângela Ma S. Lucena
Profa. do Departamento de Química da UFRPE
Recife, agosto de 2011
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 9
ColetA e prepAro 
de AmostrA VegetAl pArA
Análise QuímiCA
i. introdução
O sucesso de qualquer método analítico que visa a caracte-
rização do estado fisiológico da planta, dos processos bioquími-
cos, e dos produtos dela obtidos, baseia-se fundamentalmente 
em dois fatores:
a. Correto estabelecimento dos métodos para coleta, conserva-
ção e preparo das amostras de órgãos ou de tecidos a anali-
sar.
b. Interpretação correta dos resultados em função de um siste-
ma referencial.
Na amostragem de uma população a ser analisada deve-se 
estabelecer a representatividade da amostra, isto é, tomar um 
número de amostras individuais ou compostas que realmente 
espelhem a população dentro da variabilidade natural.
Os tecidos frescos são altamente perecíveis, assim como, 
após a coleta continuam a funcionar os processos fisiológicos e 
1
10 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
começa a se estabelecer a senescência com o aumento da respira-
ção, hidrólise de proteínas, etc. Para a realização de testesbioquí-
micos, os quais simulam as condições in vivo, é necessária a uti-
lização de tecido recém-colhido. Neste caso, devem-se promover 
as análises imediatamente após a coleta ou promover um sistema 
adequado para a conservação da amostra, como o congelamento, 
por exemplo.
Para análise de certos componentes orgânicos como proteí-
nas, carboidratos, etc. bem como dos nutrientes minerais, o me-
lhor meio de conservação da amostra é através da desidratação 
em estufa com circulação forçada de ar regulada entre 60 e 70°C, 
moagem e em seguida acondicionamento em recipiente herme-
ticamente fechado. A amostra assim tratada chama-se “amostra 
preparada ou amostra pré-seca”.
Em algumas situações, antecedendo o processo de conser-
vação da amostra, é necessário realizar a descontaminação do 
material vegetal. No caso de amostras impregnadas por solo ou 
poeira, as mesmas devem ser lavadas inicialmente com água cor-
rente (potável), posteriormente com detergente neutro a 0,1% e 
por último com água destilada. No entanto, se o material vegetal 
foi adubado via foliar ou pulverizado com defensivos agrícolas, 
o mesmo deve ser submetido a lavagem com HCl a 3% em subs-
tituição ao detergente neutro citado anteriormente. É importante 
que o tempo total de lavagem não ultrapasse 3 minutos com vis-
tas a evitar perdas de nutrientes como K e Ca.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 11
ii. mArChA AnAlítiCA do prepAro 
de AmostrA VegetAl pArA Análise VisAndo 
o AspeCto AlimentAr ou nutriCionAl
1. Colher (ou obter no mercado) a amostra, seguindo os critérios 
da representatividade;
2. Quando necessário, lavar o material com água corrente, de-
tergente neutro a 0,1% ou HCl a 3%, conforme o caso, seguida 
de lavagem com água destilada, e deixar secar à sombra;
3. Acondicionar em saco plástico limpo e transportar para o la-
boratório, o mais breve possível;
4. Cortar o material em pequenos fragmentos (0,5–1,0cm) e co-
locar em recipiente aberto tipo bandeja;
5. Levar o material a uma estufa regulada a 60–70°C e deixar 
desidratando por cerca de 48–72 horas (ao final desse tempo, 
o material deve apresentar aspecto quebradiço);
6. Moer o material em moinho de facas de aço inoxidável (tipo 
Willey), com peneira de 2mm;
7. Acondicionar o material em recipiente hermeticamente fe-
chado e devidamente identificado. 
12 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química 
de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 
17p. (IAPAR. Circular, 74).
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 13
determinAção de umidAde
i. introdução
O conteúdo de água das plantas, também denominado de 
teor de umidade, varia de uma espécie vegetal para outra e, 
dentro da mesma espécie, varia de um órgão para outro, bem 
como, com o estádio de desenvolvimento da planta. As plan-
tas lenhosas contêm, em seus caules, cerca de 50% de água. Os 
caules das plantas herbáceas contêm normalmente 70 a 80% de 
água enquanto que certos frutos podem atingir até mais de 90% 
de água, como por exemplo, a melancia. As sementes maduras 
geralmente contêm de 7 a 15% de água (veja ANEXO 5). Como 
regra geral o teor de água nos tecidos está relacionado com as 
atividades metabólicas dos mesmos.
É importante conhecer o teor de umidade dos tecidos e das 
amostras porque a preservação das mesmas está relacionada 
com o teor de umidade, além de que para se comparar o valor 
nutritivo de dois ou mais alimentos, tem-se que levar em consi-
deração os respectivos teores de matéria seca. A matéria seca é 
a amostra isenta de umidade.
Nos trabalhos de rotina dos laboratórios, geralmente se de-
termina o teor de umidade de tecidos vegetais pelo método in-
direto. Por este processo, pesa-se uma quantidade de amostra 
e em seguida a mesma é posta para desidratar completamente. 
2
14 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Após completa desidratação, pesa-se a matéria seca e por dife-
rença calcula-se o quanto a amostra tinha de umidade, expres-
sando-se o resultado em termos de percentagem. Na realidade, 
outras substâncias voláteis (óleos essenciais, por exemplo) além 
da água, são desprendidas, ocasionando algum erro, o qual 
pode geralmente ser considerado desprezível.
Tradicionalmente, na determinação de umidade, recomen-
da-se pesar a amostra e colocar a mesma em uma estufa regu-
lada a 100-105°C até obter peso constante. Entretanto na prática, 
muitos laboratórios adotam o método rápido de determinação 
de umidade. Pelo método rápido, a amostra após ser pesada é 
colocada em uma estufa regulada a 135° C por uma hora; em 
seguida deixa-se a mesma esfriar em um dessecador e pesa-se 
a matéria seca.
ii. mArChA AnAlítiCA pArA determinAção de 
umidAde pelo método rápido
1. Tarar um pesa-filtro previamente seco em estufa;
2. Pesar no próprio pesa-filtro 5,0 g da amostra;
3. Colocar o pesa-filtro (aberto) em uma estufa regulada a 135°C 
(± 2°C) e deixar desidratando por uma hora;
4. Fechar o pesa-filtro e transferir para um dessecador;
5. Aguardar cerca de 10 a 15 minutos e em seguida pesar o pesa-
filtro com a amostra seca;
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 15
6. Calcular o teor de umidade e expressar o resultado em ter-
mos de percentagem.
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
16 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de resíduo 
minerAl (r.m.)
i. introdução
Os elementos minerais que as plantas absorvem, seja pelas 
raízes, seja pela parte aérea são classificados em elementos es-
senciais, elementos úteis (ou benéficos) e elementos tóxicos. Não 
existe uma metodologia universal para analisar todos estes ele-
mentos conjuntamente. Contudo, a maior parte dos elementos 
contidos nos tecidos vegetais pode ser analisada partindo de 
um extrato único. A preparação de extratos vegetais para a aná-
lise dos elementos minerais pode ser realizada tanto através de 
uma digestão seca como de uma digestão úmida. A digestão 
seca é obtida através da incineração (calcinação) da amostra e 
em seguida dissolução do resíduo mineral (cinza) em um ácido. 
Portanto, a cinza corresponde ao resíduo inorgânico resultante 
da oxidação (através da queima) completa da matéria orgânica, 
e representa o total de elementos minerais. A digestão por via 
úmida é obtida através da ação de ácidos minerais concentra-
dos (ácido nítrico, ácido perclórico, etc.) à temperatura elevada 
(veja capítulo 32).
Durante a digestão por via seca, além de água, gases como 
CO2, NH3, e outros são eliminados, permanecendo no cadinho 
3
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 17
apenas o resíduo mineral, o qual é formado de cátions como: K+, 
Na+, Mg2+, Fe3+, Al3+, etc. e ânions como silicato, fosfato e sulfato 
e dos respectivos óxidos. O conteúdo de resíduo mineral varia 
de espécie para espécie vegetal. Dentro da mesma espécie ve-
getal varia com o órgão e idade da planta. O teor de cinzasestá 
diretamente relacionado com a atividade metabólica. Desta for-
ma, as folhas contêm muito mais cinzas de que as sementes. O 
lenho (madeira) contém pouca cinza.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Aquecer um cadinho em uma mufla à temperatura de 350°C 
por uma hora;
2. Deixar o cadinho esfriar em dessecador e em seguida pesar 
no mesmo 2,0000g da amostra;
3. Colocar o cadinho com a amostra em um fogareiro elétri-
co ou bico de Bunsen com chama branda e deixar o material 
carbonizar completamente. Reconhece-se que o material está 
completamente carbonizado quando o mesmo deixar de eli-
minar fumaça;
4. Transferir o cadinho para uma mufla previamente aquecida a 
300°C e em seguida regular a mesma para 575°C (± 25°C);
5. Após quatro horas, baixar a temperatura da mufla para 300°C. 
Quando esta temperatura for atingida, transferir o cadinho 
para um dessecador, deixar o mesmo esfriar e pesar;
18 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
6. Calcular a concentração de cinzas e expressar em termos de 
percentagem.
Observações: 
1. Nunca abrir a mufla quando a mesma estiver aquecida a mais 
de 350°C.
2. Se após quatro horas de calcinação a amostra ainda não se 
apresentar com cor clara, continuar o processo de calcinação 
por mais duas ou quatro horas.
3. Não desprezar as cinzas. As mesmas podem ser utilizadas 
para a determinação do conteúdo de certos elementos como 
fósforo, cálcio, potássio, sódio, etc. Para isto, é necessário pre-
parar o extrato das cinzas conforme segue:
a. Com o auxílio de um bastão de vidro dissolver as cinzas 
(R.M.), usando 10 mL de HCl 2 N; 
b. Filtrar para um balão volumétrico de 100 mL;
c. Lavar o cadinho e resíduo do filtrado com água destilada 
e completar o volume do balão volumétrico;
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 19
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos 
químicos e biológicos, Vicosa: UFV, 2002. 235p.
20 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de AçúCAres 
redutores em CAldo de CAnA
 
método de eynon-lAne
i. introdução
Os monossacarídeos em geral, em reações de óxido-redução, 
comportam-se como agentes redutores, fornecendo elétrons ao 
sistema, sendo eles, simultaneamente oxidados, transforman-
do-se nos ácidos carboxílicos correspondentes. Um exemplo 
dessa reação é ilustrado na Figura 1. 
O método de Eynon-Lane para análise de açúcares redu-
tores, está fundamentado na propriedade acima exposta, de 
forma que o cobre, presente na solução de Soxhlet, é reduzido 
pelo açúcar redutor. Nessa reação, a redução do cobre cúprico 
(Cu2+) para cobre cuproso (Cu+) ocorre com a formação de um 
precipitado vermelho tijolo, característico da formação de óxido 
cuproso (Equação II). Durante a titulação, usa-se o indicador 
azul de metileno para auxiliar na visualização do ponto final 
da reação.
Os sucos de frutas em geral são ricos em monossacaríde-
os como glucose, frutose, etc., os quais podem ser analisados 
conjuntamente pelo método de Eynon-Lane. O caldo de cana-
4
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 21
de-açúcar apresenta, entre outros açúcares redutores, uma 
elevada proporção de glucose e frutose. A mistura equimole-
cular desses dois açúcares é denominada de açúcar invertido, 
e sua análise constitui uma rotina de elevada importância na 
agroindústria açucareira.
H
H OH
OH
OH
OH
HO
H
H
H
H
H
C
C
C
C
C
C
O
glucose
NaO
KO
Cu
H
H O
O
C
C
C
C
O
O
cupritartarado 
de sódio e potássio
+ 2
+ 2 + 
HO
H OH
OH
OH
OH
HO
H
H
H
H
H
C
C
C
C
C
C
O
ácido 
glucônico
Cu2O
óxido
cuproso
NaO
KO
H
H OH
OH
C
C
C
C
O
O
tartarato duplo 
de sódio e potássio
Figura 1. Esquema representativo da oxidação da glucose, pelo cobre presente 
na solução de Soxhlet, durante a titulação pelo método de Eynon-Lane.
22 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. mArChA AnAlítiCA pArA determinAção 
de AçúCAr inVertido em CAldo de CAnA-de-
AçúCAr
1. Pesar 20g de caldo de cana em uma cápsula de porcelana (ou 
recipiente equivalente);
2. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico 
de 200mL, e adicionar 4mL do clarificante acetato neutro de 
chumbo (54,3°Brix);
3. Agitar suavemente o balão e em seguida adicionar 6mL da 
solução fosfato-oxalato para remover o cálcio e o excesso de 
chumbo;
4. Completar o volume do balão com água destilada. Se neces-
sário adicionar 2 a 3 gotas de éter para remover a espuma;
5. Agitar e filtrar com papel de filtro qualitativo;
6. Com o filtrado, encher uma bureta de 50mL e zerar a mes-
ma;
7. Preparar a solução de Soxhlet, pipetando para um erlenmeyer 
de 250mL, 25mL da solução A e 25mL da solução B do licor de 
Fehling. Usar pipetas volumétricas nesta operação;
8. Pipetar para dois erlenmeyers separadamente, 10mL da solu-
ção de Soxhlet recentemente preparada (item 7). Nesta opera-
ção também é recomendado usar pipeta volumétrica;
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 23
Ensaio Preliminar*
9. Em um erlenmeyer contendo 10mL da solução de Soxhlet 
(item 8), adicionar a frio, 15mL do filtrado contido na bureta 
(item 6) e colocar para aquecer em um fogareiro elétrico;
10. Marcar 15 segundos após o início da fervura, e então adi-
cionar 3 gotas do indicador azul de metileno e continuar a 
titulação gota a gota, sem remover o erlenmeyer da fonte de 
aquecimento. O final da titulação é reconhecido pela mudan-
ça da cor azul para vermelho tijolo;
11. Se após adicionar o indicador (item anterior), verificar que 
já ocorreu a mudança de cor, torna-se necessário fazer uma 
diluição do filtrado. Como sugestão, pipetar 50mL do filtrado 
para um balão volumétrico de 100mL, completar o volume 
com água destilada e repetir o ensaio preliminar conforme 
descrito nos itens 9 e 10;
12. Anotar o volume do filtrado gasto no ensaio preliminar, o 
qual servirá como referência para a realização do ensaio de-
finitivo;
Ensaio Definitivo*
13. Novamente, encher a bureta com o filtrado (diluído se for o 
caso), zerar a mesma e em seguida pegar outro erlenmeyer 
contendo 10mL da solução de Soxhlet e adicionar a frio, o vo-
lume do filtrado correspondente ao que foi gasto na titulação 
do ensaio preliminar, menos 2mL; 
24 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
14. Colocar o erlenmeyer para aquecer e 2 minutos após o início 
da fervura, adicionar 3 gotas de azul de metileno e completar 
a titulação sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimen-
to. A titulação do ensaio definitivo não deve gastar mais que 
1 minuto após a adição do indicador;
19. Anotar o volume gasto na titulação do ensaio definitivo e 
calcular a percentagem de açúcar invertido do caldo de cana, 
mediante correlação com os valores da tabela de Eynon-Lane 
(ANEXO 8).
*OBS.: Esta análise também pode ser realizada em ensaio úni-
co, com adição de 15mL do filtrado a frio na solução de Soxhlet, 
adicionando-se o indicador azul de metileno dois minutos após 
a fervura e continuando a titulação até a viragem da cor de azul 
para vermelho tijolo (Pessoa et al., 2007).
iii. prepAro dos reAgentes
a. Acetato neutro de chumbo. Dissolver cerca de 250g de aceta-
to neutro de chumbo em500mL de água (solução saturada) e 
em seguida filtrar em tecido de náilon de malha fina.
b. Solução A de Soxhlet. Dissolver 34,639g de sulfato de cobre 
pentahidratado (CuSO4.5H2O) em cerca de 300mL de água 
destilada e em seguida completar o volume para 500mL. Fil-
trar e transferir para recipiente apropriado.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 25
c. Solução B de Soxhlet. Dissolver 173g de tartarato duplo de 
sódio e potássio em cerca de 300mL de água destilada, adicio-
nar 100mL de hidróxido de sódio a 50% e em seguida comple-
tar o volume para 500mL. Filtrar e transferir para recipiente 
apropriado.
d. Solução fosfato-oxalato. Pesar 3,0g de oxalato de potássio e 
7,0g de fosfato dissódico, dissolver separadamente em água 
destilada, em seguida misturar as duas soluções e completar 
o volume para 100mL. 
e. Solução de azul de metileno a 1%. Pesar 1,0g de azul de 
metileno, dissolver em água destilada e completar o volume 
para 100mL.
26 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para 
análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 
1020p.
PESSOA, C. de O.; SANTOS, D. S. dos; BARRETO, L.P. Efeito do 
tempo de aquecimento precedente à adição do indicador na análise 
de amido pelo método de Eynon-Lane. In: VII JORNADA DE 
ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO DA UFRPE, 2007.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 27
determinAção de sACArose 
em CAldo de CAnA
método de eynon-lAne
i. introdução
A sacarose é o açúcar comum comercial, amplamente dis-
tribuído nas plantas superiores, constituindo em certas espé-
cies, tais como a cana-de-açúcar e a beterraba, uma reserva de 
grande importância. Nestas, por exemplo, sua extração pro-
duz matéria prima para grandes indústrias mundiais. Quimi-
camente a sacarose é um dissacarídeo formado pela união de 
uma molécula de glucose com uma molécula de frutose. Ao 
contrário da glucose e da frutose que são açúcares redutores, 
a sacarose não é um açúcar redutor, portanto não pode ser de-
terminada diretamente pelo método de Eynon-Lane. No en-
tanto, a sua hidrólise produz partes iguais de glucose e frutose 
(açúcar invertido) os quais são açúcares redutores, podendo-
se desta forma, determinar o teor de sacarose, indiretamente, 
por este método. Para tanto, provoca-se hidrólise da sacarose, 
determina-se o teor de açúcar invertido e em seguida, através 
de um cálculo estequiométrico obtém-se o teor de sacarose 
que continha a amostra. Veja a estequiometria a seguir:
5
28 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
É importante salientar que todo caldo de cana-de-açúcar 
contém normalmente uma determinada quantidade de açúcar 
invertido, a qual é denominada aqui como açúcar invertido 
previamente existente no caldo (a.i.c). A esta quantidade de 
açúcar invertido soma-se o proveniente da hidrólise da sa-
carose (a.i.s), dando o que denominamos de açúcar invertido 
total (a.i.t). Como mostram as equações abaixo, por subtração 
pode-se saber o teor de açúcar invertido proveniente da hidró-
lise da sacarose.
C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6
sacarose água glucose frutose
H+
342 (sacarose)
X
sacarose = a.i. x 0,95
= =X 0,95342 x 1
360
360 (açúcar invertido)
1
a.i.c + a.i.s = a.i.t
a.i.s = a.i.t - a.i.c
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 29
O método químico de determinação de açúcares redutores 
baseia-se na propriedade que têm estes açúcares de reduzir o 
cobre da solução Soxhlet. O cobre presente na solução de Soxh-
let encontra-se na forma de cupritartarato de sódio e potássio 
(Cu2+), oriundo da reação de sulfato de cobre com o tartarato 
duplo de sódio e potássio. Esta solução apresenta-se de cor azul 
piscina. Sob a ação de agentes redutores, como os açúcares re-
dutores em geral, e em condições favoráveis, o cobre precipi-
ta na forma de óxido cuproso (Cu2O), reconhecível pela colo-
ração vermelho tijolo. Sob a forma de óxido cuproso, o cobre 
encontra-se com o número de oxidação 1+, isto é, Cu+, e portanto 
encontra-se reduzido.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Pesar 20,0g de caldo de cana em uma cápsula de porcelana 
(ou recipiente equivalente);
2. Transferir, quantitativamente, para um balão volumétrico 
de 200mL, e adicionar 4mL do clarificante acetato neutro de 
chumbo (54,3°Brix);
3. Agitar suavemente o balão e em seguida adicionar 6mL da 
solução fosfato-oxalato para remover o cálcio e o excesso de 
chumbo;
4. Completar o volume do balão com água destilada. Se neces-
sário, adicionar 2 a 3 gotas de éter para remover a espuma;
30 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
5. Agitar e filtrar com papel de filtro rápido;
6. Para provocar a hidrólise da sacarose, transferir 50mL do fil-
trado para um balão volumétrico de 100mL e adicionar 20mL 
de água destilada;
7. Introduzir um termômetro no balão volumétrico e colocar 
para aquecer em “Banho-Maria” até o líquido atingir 65°C;
8. Atingida a temperatura desejada, retirar o balão volumétrico 
da fonte de aquecimento e imediatamente adicionar 5mL de 
ácido clorídrico concentrado (12,5 N);
9. Agitar suavemente o conteúdo do balão e em seguida deixar 
em repouso por 30 minutos para que ocorra a hidrólise da sa-
carose. Enquanto espera a hidrólise da sacarose, determinar 
o teor do açúcar invertido previamente existente no caldo de 
cana (a.i.c).
Açúcar Invertido Previamente Existente no Caldo
10. Tomar outra porção do filtrado (item 5), encher e zerar uma 
bureta de 50mL, para determinação do açúcar invertido pre-
viamente existente no caldo de cana;
11. Preparar a solução de Soxhlet, pipetando para um erlen-
meyer de 250mL, 25mL da solução A e 25mL da solução B do 
licor de Fehling. Usar pipetas volumétricas nesta operação;
12. Agitar a solução de Soxhlet, referida no item anterior e em 
seguida, com o uso de uma pipeta volumétrica, transferir 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 31
quatro porções de 10mL, para erlenmeyers individuais, com 
capacidade para 250mL;
13. Em um erlenmeyer contendo 10mL da solução de Soxhlet 
(item 12), adicionar a frio, 15mL do filtrado contido na bureta 
(item 10) e colocar para aquecer em um fogareiro elétrico;
14. Marcar 15 segundos após o início da fervura, e então adi-
cionar 3 gotas do indicador azul de metileno e continuar a 
titulação gota a gota, sem remover o erlenmeyer da fonte de 
aquecimento. O final da titulação é reconhecido pela mudan-
ça da cor azul para vermelho tijolo;
15. Se após adicionar o indicador (item anterior), verificar que 
já ocorreu a mudança de cor, torna-se necessário fazer uma 
diluição do filtrado. Como sugestão, pipetar 50mL do filtrado 
para um balão volumétrico de 100mL, completar o volume 
com água destilada e repetir o ensaio preliminar conforme 
descrito nos itens 13 e 14;
16. Anotar o volume do filtrado gasto no ensaio preliminar, o 
qual servirá como referência para a realização do ensaio de-
finitivo;
Ensaio Definitivo*
17. Novamente encher e zerar a bureta com o filtrado (diluído 
se for o caso) e, em seguida, usar outro erlenmeyer contendo 
10mL da solução de Soxhlet e adicionar, a frio, o volume do 
32 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
filtrado correspondente ao que foi gasto na titulação do en-
saio preliminar, menos 2mL;
18. Colocar o erlenmeyer para aquecer e 2 minutos após o início 
da fervura,adicionar 3 gotas de azul de metileno e completar 
a titulação sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimen-
to. A titulação do ensaio definitivo não deve gastar mais que 
1 minuto após a adição do indicador;
19. Anotar o volume gasto na titulação do ensaio definitivo e 
calcular a percentagem de açúcar invertido do caldo de cana, 
mediante correlação com os valores da tabela de Eynon-Lane 
(ANEXO 7).
Açúcar Invertido Total
20. Transferir o conteúdo do balão volumétrico referido no item 
9, para um balão volumétrico de 500mL e em seguida com 
o auxílio de NaOH 2,5 M e de um peagâmetro (ou papel in-
dicador), elevar o pH do meio para quase neutro (levemente 
ácido);
21. Completar o volume do balão volumétrico e em seguida 
determinar o teor de açúcar invertido total, titulando a solu-
ção de Soxhlet em dois ensaios, conforme foi realizado para 
a determinação do açúcar invertido previamente existente no 
caldo de cana;
22. Calcular a percentagem de açúcar invertido total, em segui-
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 33
da a percentagem de açúcar invertido proveniente da hidró-
lise da sacarose e, finalmente, a percentagem de sacarose.
*OBS.: Esta análise também pode ser realizada em ensaio úni-
co, com adição de 15mL do filtrado a frio na solução de Soxhlet, 
adicionando-se o indicador azul de metileno dois minutos após 
a fervura e continuando a titulação até a viragem da cor de azul 
para vermelho tijolo (Pessoa et al., 2007).
iii. prepAro dos reAgentes 
(Veja capítulo 4)
34 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz. 2008. 1020p.
PESSOA, C. de O.; SANTOS, D. S. dos; BARRETO, L.P. Efeito do tempo 
de aquecimento precedente à adição do indicador na análise de 
amido pelo método de Eynon-Lane. In: VII JORNADA DE ENSINO, 
PESQUISA E EXTENSÃO DA UFRPE, 2007.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 35
determinAção de Amido
método VolumétriCo de eynon-lAne
i. introdução
O amido é um polissacarídeo de reserva das plantas supe-
riores, formado pela união de várias moléculas de glicose. Pode 
ser encontrado em folhas, no entanto seu armazenamento é 
mais comum em raízes, tubérculos e grãos. O amido é extraído 
industrialmente do trigo, milho, arroz, mandioca, batata, etc. 
Por ser um alimento bastante rico em calorias e de fácil assi-
milação pelo organismo humano, é muito utilizado na alimen-
tação de crianças e de adultos. Pela mesma razão, dos animais 
domésticos em geral.
Da mesma forma que a sacarose, o amido não pode ser 
determinado diretamente pelo método de Eynon-Lane, pois 
o mesmo não é um açúcar redutor. No entanto, sua hidrólise 
completa produz a glicose, a qual pode ser determinada direta-
mente pelo método de Eynon-Lane, por se tratar de um açúcar 
redutor. Desta forma, para se analisar o amido pelo método de 
Eynon-Lane, provoca-se a sua hidrólise através de um ácido 
mineral forte, determina-se o teor de glicose e em seguida cal-
cula-se estequiometricamente quanto havia de amido na amos-
tra. A seguir, é fornecida a equação da hidrólise do amido, com 
6
36 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
a demonstração da estequiometria necessária à conversão de 
glicose em amido.
 
Antes de se provocar a hidrólise do amido, é necessário re-
mover os açúcares solúveis que porventura existam na amos-
tra, como sacarose, glicose, frutose, etc. A remoção dos açúcares 
solúveis é feita através de uma solubilização em água destilada 
e em seguida filtração.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Pesar 1 a 3g da amostra, transferir para um béquer de 125mL 
e adicionar cerca de 50mL de água destilada;
2. Agitar por 1 hora em mesa agitadora orbital e em seguida 
filtrar lavando o resíduo com 250mL de água destilada;
3. Transferir o resíduo para um erlenmeyer de 500mL, adicionar 
200mL de água destilada e, em seguida, 20mL de HCl 8 M;
(C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6
amido
amido = glicose x 0,9
água glicose
X = = 0,9 162180
162
162 (amido)
X
18 180
180 (glicose)
1
+
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 37
4. Adaptar ao erlenmeyer, um condensador de refluxo e colocar 
para aquecer por três horas, sob ebulição suave;
5. Após as três horas de aquecimento, deixar esfriar e com o 
auxílio de NaOH 2,5 M e de um peagâmetro (ou papel indi-
cador), elevar o pH do meio para quase neutro (levemente 
ácido);
6. Adicionar 4mL de acetato neutro de chumbo (54,3°Brix), ho-
mogeneizar e em seguida adicionar 6mL da mistura fosfato-
oxalato;
7. Transferir o conteúdo do erlenmeyer para um balão volumé-
trico de 500mL e completar o volume;
8. Filtrar e com o filtrado encher uma bureta de 50mL. Em se-
guida, zerar a bureta para posterior titulação da solução de 
Soxhlet;
9. Para preparar a solução de Soxhlet, pipetar para um erlen-
meyer 20mL da solução A e 20mL da solução B. Usar pipetas 
volumétricas nesta operação.
10. Agitar suavemente a solução de Soxhlet referida no item an-
terior e, em seguida, com o uso de uma pipeta volumétrica, 
transferir 2 porções de 10mL, para erlenmeyers individuais, 
com capacidade para 250mL;
Ensaio Preliminar*
11. Em um dos erlenmeyers contendo 10mL da solução de So-
38 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
xhlet, adicionar a frio, 15mL do filtrado referido no item 8 e 
colocar para aquecer em fogareiro elétrico;
12. Marcar 15 segundos após o início da fervura, e então adi-
cionar 3 gotas do indicador azul de metileno e continuar a 
titulação gota a gota, sem remover o erlenmeyer da fonte de 
aquecimento. O final da titulação é reconhecido pela mudan-
ça de cor azul para vermelho tijolo;
13. Se após adicionar o indicador (item anterior), verificar que 
já ocorreu a mudança de cor, torna-se necessário fazer uma 
diluição do filtrado. Como sugestão, pipetar 50mL do filtrado 
para um balão volumétrico de 100mL, completar o volume 
com água destilada e repetir o ensaio preliminar conforme 
instruções anteriores;
14. Anotar o volume do filtrado gasto no ensaio preliminar, o 
qual servirá como referência para o ensaio definitivo;
Ensaio Definitivo*
15. Novamente encher e zerar a bureta com o filtrado (diluído 
se for o caso) e em seguida pegar um erlenmeyer contendo 
10mL da solução de Soxhlet e adicionar a frio, o volume do fil-
trado correspondente ao que foi gasto na titulação do ensaio 
preliminar, menos 2mL;
16. Colocar o erlenmeyer para aquecer e, 2 minutos após o início 
da fervura, adicionar 3 gotas de azul de metileno e completar 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 39
a titulação sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimen-
to. A titulação do ensaio definitivo não deve gastar mais que 
1 minuto após a adição do indicador;
17. Anotar o volume gasto na titulação do ensaio definitivo e 
calcular a percentagem de amido na amostra analisada.
*OBS.: Esta análise também pode ser realizada em ensaio úni-
co, com adição de 15mL do filtrado a frio na solução de Soxhlet, 
adicionando-se o indicador azul de metileno dois minutos após 
a fervura e continuando a titulação até a viragem da cor de azul 
para vermelho tijolo (Pessoa et al., 2007).
iii. prepAro dos reAgentes 
(Veja capítulo 4)
40 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicasem plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz. 2008. 1020p.
PESSOA, C. de O.; SANTOS, D. S. dos; BARRETO, L.P. Efeito do tempo 
de aquecimento precedente à adição do indicador na análise de 
amido pelo método de Eynon-Lane. In: VII JORNADA DE ENSINO, 
PESQUISA E EXTENSÃO DA UFRPE, 2007.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 41
determinAção de 
CArBoidrAtos solúVeis totAis
método espeCtrofotométriCo de AntronA
i. introdução
Quimicamente os carboidratos são polihidroxialdeídos 
ou polihidroxicetonas ou compostos que por hidrólise pro-
duzem esses compostos. Fisiologicamente são compostos de 
elevado teor calorífico, servindo como fonte de energia para os 
organismos em geral. Além da função de reserva energética, 
merece destaque a função estrutural desempenhada pela ce-
lulose, como componente da parede celular dos vegetais. No 
universo dos carboidratos existem aqueles que são insolúveis 
em água tal como a celulose e os que são solúveis em água 
como a sacarose, frutose e glicose, estes últimos são chamados 
de açúcares solúveis.
Os carboidratos solúveis podem ser determinados colori-
metricamente mediante o aquecimento dos mesmos em pre-
sença de antrona. Nestas condições, a reação ocorre com a 
formação de compostos de coloração esverdeada. A reação da 
antrona fundamenta-se na ação hidrolítica e desidratante do 
ácido sulfúrico concentrado sobre os carboidratos, e na conse-
7
42 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
quente condensação com a antrona, formando um composto 
colorido. Quando a reação é realizada com dissacarídeos, tris-
sacarídeos ou polissacarídeos, estes são hidrolisados a monos-
sacarídeos os quais são desidratados para furfural ou hidroxi-
metil furfural. Essas substâncias se condensam com a antrona 
originando um composto de coloração azul (Figura 2).
A primeira etapa da determinação de carboidratos solú-
veis em tecido vegetal consta da extração de tais açúcares, 
empregando-se um solvente ou sistema de solventes cuja 
escolha vai depender da natureza do tecido a ser analisado, 
se no estado fresco ou seco. Quando se pretende determinar 
carboidratos em amostra seca, a água destilada é o solvente 
mais indicado para a extração dos açúcares solúveis. No en-
tanto, se o material a ser analisado tratar-se de folhas verdes, 
recomenda-se o uso de etanol a 70% ou 80% como sistema 
de solvente extrator de açúcares. Sabe-se que os carboidra-
tos, mesmo os de baixo peso molecular, não se solubilizam 
em etanol, e sim, solubilizam-se muito bem em água. Por ou-
tro lado, o etanol é um ótimo solvente para as clorofilas, as 
quais interferem negativamente na análise dos carboidratos 
solúveis pelo método da antrona, haja vista tratar-se de um 
método colorimétrico. Para solucionar este problema, após a 
extração dos carboidratos solúveis em folhas frescas, usando 
etanol a 70% ou 80%, removem-se os pigmentos fotossintéti-
cos através de uma cromatografia de partição, empregando-
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 43
se clorofórmio ou benzeno, resultando com isto a fase aquo-
sa livre dos pigmentos e contendo os carboidratos.
Figura 2. Esquema da reação química característica da identificação de 
carboidratos em presença de antrona.
+
H
O
Hhidroximetil
furfural
derivado 
de coloração
azul
antrona
HO
H
C
H
O
C
H
O
H
H OH
OH
OH
OH
HO
H
H
H
H
H
C
C
C
C
C
C
O
hexose
hidroximetil
furfural
HO
H
C
H
O
C
H
H2SO4
-3H2O O
H
O
OHH C
H
C
O
44 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. mArChA AnAlítiCA
Preparo do extrato : amostra pré-seca
1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um erlen-
meyer de 125mL;
2. Adicionar 20mL de etanol* a 80%;
3. Agitar por 30 minutos e em seguida filtrar em tecido de nái-
lon de malha fina;
4. Completar o volume do filtrado para 50mL com água desti-
lada;
5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para um 
tubo de ensaio rosqueával, identificar e manter o extrato di-
luído em refrigerador até o momento da análise química.
*OBS.: Este extrato também pode ser usado para a determi-
nação de sacarose. Embora a água destilada seja um bom 
solvente para a extração dos carboidratos solúveis, é reco-
mendado usar etanol a 70 ou 80% por duas razões: o etanol 
auxilia a quebrar a tensão superficial facilitando uma me-
lhor interação do solvente com a amostra, além de propiciar 
uma melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvi-
mento de microorganismos.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 45
Preparo do extrato: folhas frescas
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas fres-
cas, com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a ner-
vura central e cortar o restante em pequenos pedaços com 
cerca de 3 a 5 mm.
2. Pesar 200 mg das amostras de folhas e transferir para um 
tubo de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5 mL de etanol a 80 % e triturar em um homoge-
neizador de tecido vegetal.
4. Filtrar, transferindo quantitativamente para um balão 
volumétrico de 25 mL, usando uma tela de náilon de ma-
lha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5 mL do mesmo solvente e transferir, sob filtração, o 
material para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em segui-
da completar o volume do balão volumétrico com o mesmo 
solvente.
7. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
46 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Procedimentos para o desenvolvimento da cor
6. Preparar uma bandeja de isopor (ou de polipropileno) com 
gelo triturado e colocar estantes com tubos de ensaio devi-
damente identificados para extratos das amostras e soluções 
padrões;
7. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, 0,2mL dos ex-
tratos das amostras e das soluções padrões e manter em ba-
nho de gelo;
8. Adicionar a cada tubo de ensaio, 2,0mL do reagente antro-
na, fechar hermeticamente os tubos de ensaio e agitar su-
avemente até que a mistura se apresente bem homogênea, 
mantendo os tubos de ensaio em banho de gelo;
9. Cautelosamente transferir os tubos de ensaio para um apa-
relho de “banho-maria”, regulado a 100°C e manter sob aque-
cimento por 10 minutos, para o desenvolvimento da cor (azul 
esverdeada);
10. Após o desenvolvimento da cor, transferir novamente os 
tubos de ensaio para banho de gelo e aguardar cerca de 5 
minutos para que sejam resfriados;
11. Transferir o conteúdo do tubo de ensaio para uma cube-
ta espectrofotométrica de 1,0mL e fazer a leitura em um co-
lorímetro com filtro vermelho ou em espectrofotômetro a 
620nm;
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 47
12. Proceder aos cálculos e expressar os resultados em termos 
de percentagem de carboidratos solúveis em relação à amos-
tra analisada.
OBS.: É recomendado realizar esta determinação com três 
repetições analíticas, e usar cubetas espectrofotométricas 
de vidro. 
iii. reAgentes
Reagente específico (antrona a 0,2%). Pesar 0,200g de antro-
na, dissolver em ácido sulfúrico 12,854 M e completar o volume 
para 100mL. Recomenda-se que esta solução seja preparada no 
mesmo dia a ser utilizada. O ácido sulfúrico 12,85 molar é pre-
parado adicionando-se 500mL do ácido puro (96%) a 200mL de 
águadestilada.
Soluções padrões
Solução estoque de glucose (solução estoque 2,5 g.L-1). Pesar 
0,500g de glucose (P.A.), dissolver em 100mL de água destilada 
e completar o volume para 200mL com etanol a 80%. Transferir 
para recipiente adequado e manter em refrigerador. A partir 
desta solução, são preparados os padrões de trabalho, nas con-
centrações de 0 a 200 mg.L-1.
48 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétri-
cos de 100mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de glucose (2,5 
g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este pro-
cedimento, estarão preparadas as soluções padrões de glicose 
nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200 mg.L-1. O pa-
drão zero corresponde à água deionizada.
OBS.: Mais precisamente, as soluções padrões diluídas tam-
bém podem ser preparadas com base na massa em vez do 
volume.
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
YEMM, E. W. ; WILLIS, A. J. The estimation of carbohydrates in plant 
extracts by anthrone. Biochemical Journal, v.57, p.508-514, 1954.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 49
determinAção de sACArose
método espeCtrofotométriCo 
de VAn hAndel
i. introdução
A sacarose é obtida industrialmente da cana de açúcar ou 
da beterraba. É um dissacarídeo constituído por uma molécula 
de α-D-glucose interligada com uma molécula de β-D-frutose 
por ligação α 1-2. A sacarose não é um açúcar redutor, pois a 
mesma não possui hidroxila glucosídica livre. Este dissacarí-
deo é encontrado amplamente no reino vegetal, e na maioria 
das espécies predomina sobre os demais carboidratos solúveis. 
O método da antrona (Yemm & Willis, 1954) é um método co-
lorimétrico que quantifica todos os açúcares solúveis presentes 
na amostra (mono e oligossacarídeo). Tal metodologia pode ser 
empregada para a determinação dos oligossacarídeos solúveis 
de uma amostra, desde que se aplique um artifício para remo-
ver ou mascarar a presença dos monossacarídeos presentes na 
amostra. Van Handel (1968) descreve uma metodologia para a 
determinação da sacarose mediante uma prévia destruição dos 
monossacarídeos presentes na amostra, pela ação do hidróxido 
de potássio, e posterior desenvolvimento da cor em presença 
da antrona.
8
50 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. proCedimento AnAlítiCo
Preparo de extrato: amostra pré-seca.
1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um erlen-
meyer de 125mL;
2. Acrescentar 20mL de etanol* (80%) e tampar o erlenmeyer;
3. Colocar para agitar em mesa agitadora orbital por 30 mi-
nutos;
4. Filtrar o extrato em tecido de náilon de malha fina, lavando 
o mesmo e completar o volume para 50mL com água des-
tilada;
5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para um 
tubo de ensaio rosqueával, identificar e manter o extrato dilu-
ído em refrigerador até o momento da análise química.
*OBS.: Para a determinação de sacarose pode ser usado o 
mesmo extrato preparado para a determinação de carboi-
dratos solúveis totais. Embora a água destilada seja um bom 
solvente para a extração dos carboidratos solúveis, é reco-
mendado usar etanol a 70 ou 80 % por duas razões: o etanol 
auxilia a quebrar a tensão superficial facilitando uma melhor 
interação do solvente com a amostra, além de propiciar uma 
melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvimento 
de microorganismos.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 51
Preparo do extrato: folhas frescas
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, 
com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura 
central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca 
de 3 a 5 mm.
2. Pesar 200 mg das amostras de folhas e transferir para um 
tubo de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5 mL de etanol a 80 % e triturar em um homoge-
neizador de tecido vegetal.
4. Filtrar, transferindo quantitativamente para um balão volu-
métrico de 25 mL, usando uma tela de náilon de malha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5 mL do mesmo solvente e transferir, sob filtração, o 
material para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em segui-
da completar o volume do balão volumétrico com o mesmo 
solvente.
7. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
52 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Desenvolvimento da cor
6. Pipetar para tubos de ensaio rosqueáveis, em separado, 
200µL das soluções padrões de sacarose e dos extratos das 
amostras;
7. Acrescentar 200µL de KOH a 30 % em metanol;
8. Fechar hermeticamente os tubos de ensaio e colocar para 
aquecer em banho-maria por 10 minutos a 100°C;
9. Deixar resfriar em banho de gelo;
10. Com os tubos de ensaio ainda mergulhados no banho de 
gelo, acrescentar 2mL do reagente antrona, e em seguida agi-
tar suavemente até que a mistura se apresente bem homo-
gênea;
11. Transferir novamente para banho-maria a 100°C por 10 mi-
nutos para que ocorra o desenvolvimento da cor;
12. Após o desenvolvimento da cor, transferir novamente os 
tubos de ensaio para banho de gelo e aguardar cerca de 3 a 5 
minutos para esfriar;
13. Efetuar as leituras espectrofotométricas no comprimento 
de onda de 620nm.
OBS.: É recomendado realizar esta determinação com três re-
petições analíticas.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 53
iii. prepAro dos reAgentes
Reagente específico: antrona a 0,2 % em ácido sulfúrico.
Pesar 0,200g de antrona, dissolver em ácido sulfúrico 12,85 M 
e completar o volume para 100mL. Recomenda-se que esta so-
lução seja preparada no mesmo dia a ser utilizada. O ácido sul-
fúrico 12,85 molar é preparado adicionando-se 500mL do ácido 
puro (96%) a 200mL de água destilada.
Solução padrão de sacarose (solução estoque 2,5g.L-1). Pesar 
0,500g de sacarose P.A., dissolver em água destilada e completar 
o volume para 200 mL. Transferir para recipiente adequado e 
manter em refrigerador. A partir desta solução, são preparados 
os padrões de trabalho, nas concentrações de 0 a 200mg.L-1.
Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétri-
cos de 100 mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de sacarose 
(2,5g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este 
procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de saca-
rose nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L-1. O 
padrão zero corresponde à água deionizada.
54 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
Van HANDEL, E. Direct microdetermination of sucrose. Anal. 
Biochem., v.22, p.280-283, 1968.
YEMM, E.W.; WILLS, A.J. The estimation of carbohydrates by 
anthrone. Biochemical Journal, v.57, p.508-514, 1954.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 55
determinAção de AçúCAres 
redutores
método espeCtrofotométriCo 
de somogyi e nelson
i. introdução
Os monossacarídeos em geral, em reações de óxido-redução, 
comportam-se como agentes redutores, fornecendo elétrons ao 
sistema, sendo eles, simultaneamente oxidados, transforman-
do-se nos ácidos carboxílicos correspondentes. Um exemplo 
dessa reação é ilustrado na Figura 3 (Bezerra Neto e Barreto, 
2004).
O método de Somogyi e Nelson fundamenta-se na pro-
priedade acima exposta, de forma que o cobre, presente na so-
lução de Somogyi, é reduzido pelo açúcar redutor, formando 
um cromóforo azulado, relativamente estável, ao ser dissolvi-do em presença do arsenomolibdato do reagente de Nelson, 
permitindo dessa forma a sua leitura em espectrofotômetro a 
760nm (Nelson, 1944; Somogyi, 1952).
Os sucos de frutas em geral são ricos em monossacaríde-
os como glucose, frutose, etc., os quais podem ser analisados 
conjuntamente pelo método de Somogyi e Nelson. O caldo 
9
56 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
de cana-de-açúcar apresenta, entre outros açúcares redutores, 
uma elevada proporção de glucose e frutose. A mistura equi-
molecular desses dois açúcares é denominada de açúcar inver-
tido, e sua análise constitui uma rotina de elevada importância 
nas usinas de açúcar.
Figura 3. Esquema representativo da oxidação da glucose, pelo cobre presente 
na solução de Somogyi, e a consequente redução do cobre a óxido cuproso.
H
H OH
OH
OH
OH
HO
H
H
H
H
H
C
C
C
C
C
C
O
glucose
NaO
KO
Cu
H
H O
O
C
C
C
C
O
O
cupritartarado 
de sódio e potássio
+ 2
+ 2 + 
HO
H OH
OH
OH
OH
HO
H
H
H
H
H
C
C
C
C
C
C
O
ácido 
glucônico
Cu2O
óxido
cuproso
NaO
KO
H
H OH
OH
C
C
C
C
O
O
tartarato duplo 
de sódio e potássio
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 57
ii. proCedimento AnAlítiCo
Preparo de extrato: : amostra pré-seca 
Partindo de material vegetal pré-seco.
1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um er-
lenmeyer de 125mL;
2. Acrescentar 20mL de etanol* (80%) e tampar o erlenmeyer;
3. Colocar para agitar em mesa agitadora orbital por 30 mi-
nutos;
4. Filtrar o extrato em tecido de náilon de malha fina, lavan-
do o mesmo e completar o volume para 50mL com água 
destilada;
5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para 
um tubo de ensaio rosqueável, identificar e manter o ex-
trato diluído em refrigerador até o momento da análise 
química.
*OBS.: Para a determinação de açúcares redutores pode ser 
usado o mesmo extrato preparado para a determinação de 
carboidratos solúveis totais. Embora a água destilada seja um 
bom solvente para a extração dos carboidratos solúveis, é re-
comendado usar etanol a 70 ou 80 % por duas razões: o etanol 
auxilia a quebrar a tensão superficial facilitando uma melhor 
interação do solvente com a amostra, além de propiciar uma 
58 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvimento de 
microorganismos. 
Preparo do extrato: folhas frescas
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, 
com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura 
central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca de 
3 a 5 mm.
2. Pesar 200 mg das amostras de folhas e transferir para um 
tubo de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5 mL de etanol a 80 % e triturar em um homoge-
neizador de tecido vegetal.
4. Filtrar, transferindo quantitativamente para um balão volu-
métrico de 25 mL, usando uma tela de náilon de malha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5 mL do mesmo solvente e transferir, sob filtração, o ma-
terial para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em seguida 
completar o volume do balão volumétrico com o mesmo sol-
vente.
7. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 59
Desenvolvimento da cor
6. Pipetar para diferentes tubos de ensaio, 0,2mL das soluções 
padrões de glicose e dos extratos das amostras;
7. Acrescentar em cada tubo de ensaio 1,0mL do reagente de 
Somogyi, agitar suavemente e tampar o tubo de ensaio;
8. Aquecer os tubos de ensaio em banho-maria, à temperatura de 
100°C por 15 minutos;
9. Esfriar os tubos em banho de gelo e depois acrescentar 1,0mL 
do reagente de Nelson;
10. Agitar suavemente e deixar em repouso por 20 minutos;
11. Acrescentar 5,0mL de água destilada e agitar suavemente;
12. Efetuar as leituras em espectrofotômetro no comprimento 
de onda de 760nm;
iii. prepAro dos reAgentes
Reagente de Somogyi
28,0g de fosfato dibásico de sódio anidro (Na2HPO4) ou 71g de fos-
fato dibásico de sódio duodeca-hidratado (Na2HPO4.12H2O);
40,0g de tartarato duplo de sódio e potássio;
4,0g de hidróxido de sódio (dissolvido em 100mL de água 
destilada);
8,0g de sulfato de cobre (dissolvido em 80mL de água des-
tilada);
180,0g de sulfato de sódio anidro;
60 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Misturar os reagentes, dissolver bem e deixar em repouso 
por dois dias. Filtrar a solução em papel de filtro, armazenar em 
frasco escuro a temperatura ambiente.
Reagente de Nelson 
50,0 g de molibdato de amônio (dissolvido em 900mL de água 
destilada);
23,0mL de ácido sulfúrico concentrado (18 M);
6,0g de arsenato de sódio (Na2HAsO4.7H2O), dissolvido em 
50mL de água destilada;
Misturar os reagentes, dissolver bem e deixar em repouso 
por dois dias. Filtrar a solução em papel de filtro, armazenar em 
frasco escuro a temperatura ambiente.
Solução padrão de glucose (solução estoque 2,5g.L-1). Pesar 
0,500g de glucose P.A., dissolver em água destilada e completar 
o volume para 200mL. Transferir para recipiente adequado e 
manter em refrigerador. A partir desta solução, são preparados 
os padrões de trabalho, nas concentrações de 0 a 200mg.L-1.
Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétri-
cos de 100 mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de glucose (2,5 
g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este pro-
cedimento, estarão preparadas as soluções padrões de glucose 
nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L-1. O pa-
drão zero corresponde à água deionizada.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 61
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
NELSON, Norton. A photometric adaptation of the Somogyi method 
for the determination of glucose. J. Biol. Chem., v.153, p.375-380, 
1944.
SOMOGYI, Michael. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem., 
v.195, p.19-23, 1952.
62 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção 
de CArBoidrAtos totAis 
não estruturAis
método espeCtrofotométriCo dA AntronA
i. introdução
Carboidratos são compostos ricos em energia e que têm como 
principais funções nos vegetais: participar ativamente do metabo-
lismo geral, atuar como compostos de reserva energética ou de-
sempenhar função estrutural. Os carboidratos solúveis envolvem 
os monossacarídeos, oligossacarídeos e alguns poucos polissaca-
rídeos. Esses, conjuntamente com os polissacarídeos hidrolisáveis 
formam os chamados carboidratos totais não estruturais (CTNE), 
que diferem dos carboidratos estruturais por conter a energia assi-
milável pelos animais monogástricos. A determinação de carboi-
dratos pelo método da antrona é própria para a quantificação dos 
carboidratos solúveis contidos em amostras vegetais. Contudo, tal 
metodologia também pode ser empregada para a determinação de 
CTNE em amostra vegetal, desde que se convertam os oligo e po-
lissacarídeos (amido) em suas unidades monoméricas, com o míni-
mo de extração e hidrólise de carboidratos estruturais.
10
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 63
ii. proCedimento AnAlítiCo
Preparo do extrato
1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um erlen-
meyer de 125mL;
2. Adicionar 20mL de ácido clorídrico 0,2 M;
3. Colocar para aquecer por uma hora em “banho-maria”, emseguida deixar esfriar e filtrar em tecido de náilon de ma-
lha fina;
4. Completar o volume do filtrado para 100mL com água des-
tilada;
5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para um 
tubo de ensaio rosqueával, identificar e manter o extrato dilu-
ído em refrigerador até o momento da análise química.
Procedimentos para o desenvolvimento da cor
6. Preparar uma bandeja de isopor (poliestireno) com gelo tri-
turado e colocar estantes com tubos de ensaio devidamente 
identificados para extratos das amostras e soluções padrões;
7. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, 0,2mL dos ex-
tratos das amostras e das soluções padrões e manter em ba-
nho de gelo;
64 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
8. Adicionar a cada tubo de ensaio, 2,0mL do reagente antrona, 
fechar hermeticamente os tubos de ensaio e agitar suavemen-
te até que a mistura se apresente bem homogênea, mantendo 
os tubos de ensaio em banho de gelo;
9. Cautelosamente transferir os tubos de ensaio para um apare-
lho de “banho-maria”, regulado a 100°C e manter sob aqueci-
mento por 10 minutos, para o desenvolvimento da cor (azul 
esverdeada);
10. Após o desenvolvimento da cor, transferir novamente os 
tubos de ensaio para banho de gelo e aguardar cerca de 5 
minutos para que sejam resfriados;
11. Transferir o conteúdo do tubo de ensaio para uma cubeta es-
pectrofotométrica de 1,0mL e fazer a leitura em um coloríme-
tro com filtro vermelho ou em espectrofotômetro a 620nm;
12. Proceder aos cálculos e expressar os resultados em termos 
de percentagem de carboidratos solúveis em relação à amos-
tra analisada.
Observações 
1. É recomendado realizar esta determinação com três repe-
tições analíticas. 
2. O método da antrona também pode ser empregado para 
a determinação dos polissacarídeos de reserva (PR), ex-
pressos como amido. Para isto é necessário fazer a deter-
minação dos CTNE e na mesma amostra determinar CST 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 65
(carboidratos solúveis totais). Em seguida calcula-se o teor 
de PR pela equação seguinte: % PR = (% CTNE - % CST) 
x 0,9; onde 0,9 representa o fator de conversão de glucose 
em amido.
iii. reAgentes
Reagente específico (antrona a 0,2 %). Pesar 0,200g de antro-
na, dissolver em ácido sulfúrico 12,854 M e completar o volume 
para 100mL. Recomenda-se que esta solução seja preparada no 
mesmo dia a ser utilizada. O ácido sulfúrico 12,854 molar é pre-
parado adicionando-se 500mL do ácido puro (96%) a 200mL de 
água destilada.
Ácido clorídrico 0,2 M. Em um balão volumétrico com ca-
pacidade para 250mL, adicionar cerca de 200mL de água desti-
lada, acrescentar 4,2mL de ácido clorídrico concentrado (12 M) 
em seguida completar o volume com água destilada. 
Soluções padrões
Solução estoque de glucose (solução estoque 2,5 g.L-1). Pesar 
0,500g de glucose P.A., dissolver em água destilada e completar 
o volume para 200mL. Transferir para recipiente adequado e 
manter em refrigerador. A partir desta solução, são preparados 
os padrões de trabalho, nas concentrações de 0 a 200 mg.L-1.
Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumé-
66 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
tricos de 100mL: 1, 2, 4, e 8 mL da solução estoque de glucose 
(2,5g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este 
procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de gli-
cose nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L-1. O 
padrão zero corresponde à água deionizada.
OBS.: Mais precisamente, as soluções padrões diluídas também 
podem ser preparadas com base na massa em vez do volume.
iV. BiBliogrAfiA
SOUZA, A.E.R. de; SILVA, A.B. da; BEZERRA NETO, E.; 
ALBUQUERQUE, E.L. de. Calibração de metodologia para análise 
de carboidratos totais não estruturais em tecido vegetal. In: XXIX 
REUNIÃO NORDESTINA DE BOTÂNICA, Mossoró-RN. Anais… 
SNB. 2006. Cd-Rom.
YEMM, E. W. ; WILLIS, A. J. The estimation of carbohydrates in plant 
extracts by anthrone. Biochemical Journal, v.57, p.508-514, 1954.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 67
determinAção de Óleo em 
sementes de oleAginosAs
método de soxhlet
i. introdução
As matérias graxas dos vegetais (óleos e gorduras) são mis-
turas de glicerídeos e cerilídios constituídos de ácidos graxos 
os mais diversos, impurificados por vários lipóides. São encon-
tradas fazendo parte das membranas celulares (onde exercem 
a função estrutural), na superfície de folhas e frutos (desem-
penhando a função protetora) e em grandes quantidades nas 
sementes de oleaginosas, com a função de reserva. As matérias 
graxas de origem vegetal, em particular os óleos, são ampla-
mente extraídas das sementes de plantas oleaginosas, como: 
soja, girassol, algodão, oliva, mamona, pinhão manso, etc., as-
sim como do endosperma sólido do coco, e do mesocarpo do 
dendê (também chamado de óleo de palma). 
É crescente a demanda por óleos ricos em ácidos graxos po-
liinsaturados nos produtos alimentícios de modo geral. O de 
maior consumo é o óleo de soja, o qual possui 61% de ácidos 
graxos poliinsaturados. O óleo de milho, o óleo de caroço de 
11
68 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
algodão e o óleo de amendoim contém respectivamente 42, 50 e 
21% de ácidos graxos poliinsaturados (Shreve e Brink Jr., 1980)
Do ponto de vista químico, os óleos são ésteres de ácidos 
graxos com glicerol. São insolúveis em água, mas solúveis em 
solventes orgânicos tais como, éter de petróleo, hexano, benze-
no, clorofórmio e tetracloreto de carbono. São pouco solúveis 
em álcool frio, com exceção dos óleos de cróton, rícino e oliva.
A extração das matérias graxas pode ser feita por três pro-
cessos:
a.Simples fusão com aquecimento a seco ou em presença de 
água. Por este processo, o calor dilacera as células vegetais e 
o óleo ou a gordura após a fusão se separa das impurezas por 
diferença de densidade.
b. Pressão mecânica a frio, quando se tratar de um óleo, ou a 
quente, no caso de uma gordura. Neste processo, a matéria 
gordurosa é expulsa por pressão.
c. Extração por solvente orgânico, que consiste em submeter a 
amostra à ação de um solvente orgânico e em seguida filtrar 
para separar os detritos vegetais da fase líquida, a qual cons-
ta da mistura da matéria graxa com o solvente. Finalmente 
o óleo (ou gordura) é separado do solvente por destilação, 
sendo recuperado o solvente. Esta separação ocorre graças a 
diferença entre o ponto de ebulição dos solventes orgânicos 
empregados (cerca de 60 a 70°C) e o ponto de ebulição das 
matérias graxas (em torno de 300°C). A extração das matérias 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 69
graxas por este processo tem sido historicamente denomina-
da de extrato etéreo devido às primeiras extrações terem sido 
realizadas com o uso do éter.
É importante salientar que o extrato etéreo obtido de mate-
riais pobres em óleo e gordura, como as folhas em geral, apre-
senta em sua constituição uma boa parcela de outros compos-
tos de natureza lipídica, como os pigmentos.
O processo industrial de extração de óleo depende da 
matéria-prima, no caso do caroço de algodão, utiliza-se a ação 
combinada da prensagem seguida da extração por solvente, com 
o objetivo de aumentar o rendimento. Porém, quando a matéria-
prima é o grão de soja, a extração por solvente é realizada de 
modo contínuo, em contracorrente, através de diversos estágios 
de extração. Em termos de eficiência, a extração por solvente 
pode recuperar até 98% do óleo (rendimento de 14,2kg/hl), 
enquanto a prensagem hidráulica (11,2kg/hl) ou em prensa-
parafuso (11,9kg/hl) pode recuperar 80-90% do óleo(Shreve e 
Brink Jr., 1980).
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Tarar um balão coletor previamente seco em estufa;
2. Com o auxílio de um almofariz e de um pistilo, macerar as 
sementes e pesar, em papel de filtro, 5,0g das mesmas, en-
volver no próprio papel de filtro e colocar em um cartucho 
70 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
extrator;
3. Transferir este conjunto para um extrator de Soxhlet;
4. Adaptar o extrator de Soxhlet ao balão e, em seguida, adicio-
nar solvente (hexano) em quantidade suficiente para sifonar 
uma vez e mais a metade da capacidade do extrator;
5. Conectar o conjunto extrator ao condensador e em seguida 
levar a uma fonte de aquecimento;
6. Ligar a fonte de aquecimento e a circulação de água (para 
resfriamento) e deixar a extração se processar por 8 horas;
7. Após a extração, recuperar o restante do solvente, retirar o 
cartucho com a amostra e levar o balão coletor para uma es-
tufa regulada a 100°C;
8. Deixar o balão coletor na estufa por três horas e em seguida 
transferir o mesmo para um dessecador;
9. Deixar o balão coletor (contendo óleo) no dessecador por cer-
ca de 10 minutos e em seguida pesar o mesmo e calcular a 
percentagem de óleo na amostra analisada.
OBS.: Não desprezar a amostra desengordurada (livre de extra-
tivos), pois a mesma serve para a análise de fibra bruta.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 71
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz. 2008. 1020p.
SHREVE, R.N.; BRINK JR., J.A. Indústrias de processos químicos. 4ª 
Edição. Rio de Janeiro: LTC, 1980. 732 p.
SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos 
químicos e biológicos. Visosa: UFV, 2002. 235p.
STRYER, L. Bioquímica. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 
1996. 1000p il.
72 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de fiBrA BrutA
método grAVimétriCo
i. introdução
As fibras dos vegetais são constituídas principalmente por ce-
lulose, hemiceluloses e lignina, componentes estes encontrados 
em altas concentrações na parede celular das plantas. 
Em termos analíticos, denomina-se fibra bruta, a fibra de celu-
lose associada a porções variáveis dos demais componentes cita-
dos acima, não extraídos por ácidos e bases diluídos e a quente.
A celulose é o principal componente da parede celular e o 
composto de carbono mais abundante na natureza. É encon-
trada em forma mais pura nas fibras de algodão submetido a 
cuidadoso tratamento de purificação. O material obtido por 
esse processo serve como celulose-padrão e apresenta cerca de 
99,8% de pureza.
As hemiceluloses são os principais polissacarídeos não ce-
lulósicos da parede celular e diferem da celulose, em termos 
analíticos, principalmente por serem solúveis em soluções al-
calinas diluídas e serem hidrolisadas pela ação de ácidos dilu-
ídos a quente. Esse grupo de carboidratos estruturais é forma-
do por xilana, xiloglicana, glicomanana, arabinoxilana e calose 
(Lacerda, 2002; Taiz e Zeiger, 2009)
12
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 73
A lignina é um polímero de natureza fenólica, constituí-
do por três diferentes álcoois de fenilpropanóides: coniferil, 
cumaril e sinapil. Tais álcoois são biossintetizados a partir 
do aminoácido fenilalanina. Como um polímero, a lignina 
é um composto de elevado peso molecular, e é considerada 
como produto final do metabolismo do vegetal, pois quando 
o processo de lignificação é completado, a célula morre, for-
mando o tecido de resistência. Tal composto pode ser hidroli-
sado pela ação dos ácidos ou bases sob condições apropriadas 
e altas temperaturas.
A determinação da fibra bruta de uma amostra vegetal é ba-
seada na remoção (extração) dos demais constituintes da amos-
tra, que não sejam a própria fibra bruta. Essa extração é realiza-
da através da hidrólise, solubilização e filtração dos compostos 
mais facilmente hidrolisáveis e solúveis, os quais não fazem 
parte do conjunto denominado de Fibra Bruta.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Transferir o resíduo da determinação de óleo para um erlen-
meyer de 500mL, adicionar 200mL de ácido sulfúrico a 1,25%, 
fervente e, em seguida, colocar para aquecer em ebulição su-
ave e sob refluxo por 30 minutos;
2. Filtrar, sob sucção (a vácuo), em funil de Büchner, usando 
como filtro um tecido de náilon de malha fina;
74 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
3. Lavar o resíduo com cerca de 100mL de água destilada (fer-
vente) e, em seguida, transferir o resíduo para o mesmo erlen-
meyer usado anteriormente, usando 200mL de NaOH a 1,25% 
(fervente);
4. Colocar para aquecer em ebulição suave e sob refluxo por 30 
minutos;
5. Filtrar sob sucção (a vácuo), em funil de Büchner, usando um 
papel de filtro previamente seco e tarado conjuntamente com 
um pesa-filtro;
6. Proceder uma lavagem do resíduo, usando água destilada 
quente, sob filtração a vácuo, até neutralizar o meio (usar pa-
pel indicador);
7. Proceder mais uma lavagem por filtração usando 20mL de 
álcool etílico, e em seguida, 20mL de éter de petróleo;
8. Transferir o papel com o resíduo para um pesa-filtro previa-
mente seco e tarado, e em seguida colocar em uma estufa re-
gulada a 100°C;
9. Após permanecer duas horas na estufa, transferir o pesa-fil-
tro com o resíduo para um dessecador e deixar por cerca de 
10 minutos;
10. Após esfriar, pesar o pesa filtro contendo o resíduo (fibra 
bruta + cinzas).
11. Transferir o papel de filtro com o resíduo para um cadinho 
previamente queimado e tarado, e calcinar a 575°C ( ± 25°C) 
até obter as cinzas (cerca de 4 horas);
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 75
12. Levar o cadinho com as cinzas para um dessecador e 
deixar esfriar por cerca de 10 a 15 minutos;
13. Pesar o cadinho contendo as cinzas e calcular a percenta-
gem de fibra bruta na amostra.
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, 
mimeografado, 1975. 130p. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
LACERDA, C.F. Fisiologia Vegetal. Fortaleza: UFC, 2002. 356 p. il.
SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos 
químicos e biológicos. Vicosa: UFV. 2002. 235p.
TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 
2009. 820 p. il.
76 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de nitrogênio 
totAl e estimAtiVA do teor 
de proteínA BrutA
método de ArrAste de VApor (KjeldAhl)
i. introdução
As proteínas são compostos nitrogenados consideradas ma-
cromoléculas formadas a partir da união de vários aminoácidos 
entre si e que são largamente encontradas nos reinos animal 
e vegetal. Quanto à função biológica, as proteínas podem ser 
classificadas em enzimas, proteínas de armazenamento, proteí-
nas transportadoras, proteínas protetoras, toxinas e hormônios. 
Dependendo do produto vegetal o teor de proteína bruta pode 
variar de 0,2% (maçã, mamão, etc.) até 17% (castanha do Pará) 
(Franco, 2000).
Considerando que as proteínas em geral contêm cerca de 
16% de N, o teor de proteína bruta (PB) de uma amostra vege-
tal pode ser determinado partindo-se da análise do nitrogênio 
total e em seguidamultiplicando-se seu teor (%) pelo fator 6,25. 
Este fator é usado principalmente para órgãos de reserva, como 
por exemplo, grãos de milho e também para ovo e carne. No en-
13
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 77
tanto, conforme cita Silva (1990), dependendo da natureza do 
material analisado, outros fatores de transformação podem 
ser usados, em função das proteínas existentes nestes mate-
riais, possuírem um percentual de N diferente de 16. Alguns 
exemplos de fatores de transformação de N-total em proteína 
bruta são dados a seguir: endosperma de trigo (5,70), farelo 
de trigo (6,31), grão de trigo (5,83), grão de aveia (5,83), farelo 
de algodão (5,30), farelo de linho (5,30), amendoim (5,46), leite 
(6,38) e gelatina (5,55).
A determinação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl é re-
alizada em três etapas, a saber: digestão, destilação e titulação. 
Durante a digestão da amostra, o nitrogênio orgânico é mine-
ralizado pelo ácido sulfúrico em presença de catalisadores, a 
temperatura elevada (300°C). A mineralização do nitrogênio 
orgânico pode ser representada pela equação abaixo:
 
Após a digestão, processa-se a destilação, na qual o nitro-
gênio já mineralizado na forma do cátion amônio (NH4
+) é 
volatilizado na forma de amônia pela ação de uma base forte 
(NaOH por exemplo) e, em seguida, é recebido pelo ácido bórico 
(H3BO3), tornando-se disponível para uma posterior titulação. 
N-orgânico + H2SO4 (NH4)2SO4 + CO2 + H20
(catalisadores) (I)
78 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
As reações envolvidas durante a destilação são representadas 
a seguir:
 
Após a destilação, a amônia (NH3) é titulada por um ácido 
(H2SO4 por exemplo) e o nitrogênio é quantificado estequio-
metricamente. A titulação pode ser representada conforme 
esquema abaixo:
 
ii. esteQuiometriA dos CálCulos
De acordo com a equação V, 2 NH4
+ reagem exatamente 
com um mol de H2SO4. Seguindo-se esta proporção e sabendo-
se a concentração e volume do ácido empregado na titulação, 
calcula-se a quantidade de N total da amostra, conforme rela-
ções abaixo :
2 NH4H2BO3 + H2SO4 (NH4)2SO4 + 2 H3BO3
NH3 + H3BO3 NH4H2BO3
(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2 NH4OH + Na2SO4
2 NH4+ + H2SO4
28g (N)
14g (N)
14g (N)
0,7g (N)
0,7mg (N)
(NH4)2SO4 + 2H+
98g (H2SO4)
49g (1000mL de H2SO4 1N)
1000mL de H2SO4 1N
1000mL de H2SO4 0,05N
1mL de H2SO4 0,05N
NH4OH NH3 + H2O
(IV)
(III)
(V)
(II)
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 79
iii. mArChA AnAlítiCA
1. Pesar 100mg de uma amostra vegetal. Transferir para um 
tubo digestor e adicionar 7mL da mistura digestora;
2. Adaptar o tubo digestor a um bloco digestor localizado em 
uma capela e colocar para aquecer obedecendo a seguinte se-
quência de tempo e temperatura:
Uma hora a 100°C
Uma hora a 200°C
Uma hora a 300°C
3. Deixar esfriar, dissolver o digerido com cerca de 10mL de 
água destilada e acoplar o tubo digestor ao destilador de Kjel-
dahl. 
4. Proceder à destilação com o auxílio de 25mL de NaOH (50%) 
e recolher o destilado em um erlenmeyer contendo 10mL de 
ácido bórico com indicador misto. Após obter 20mL de desti-
lado, toda a amônia deve ter sido destilada.
5. Titular a amônia destilada usando uma solução padrão de 
H2SO4 0,05 N. Para a mistura de indicador utilizada, o ponto 
final da titulação corresponde à mudança de cor: de verde 
para vermelho claro.
6. Proceder aos cálculos expressando o teor de N-total em ter-
mos percentuais. Em seguida, estimar o teor de proteína 
bruta multiplicando o teor de N-total pelo fator de conversão 
adequado ao material analisado.
80 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
OBS.: Para calcular o teor de N-total na amostra, considerar que 
1,0mL do ácido sulfúrico 0,05 N gasto na titulação corresponde a 
0,7mg de nitrogênio na amostra (Bezerra Neto e Barreto, 2004).
iV. prepAro dos reAgentes
a. Mistura digestora
175ml de água destilada;
3,6g de selenito de sódio (Na2SeO3) anidro ou 5,47g de selenito 
de sódio penta hidratado (Na2SeO3.5H2O);
4,0g de sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O);
21,3g de sulfato de sódio (Na2SO4) anidro ou 48,5g de sulfato de 
sódio deca hidratado (Na2SO4.10H2O).
200mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado (36 N).
b. Solução de ácido bórico mais indicador misto.
Dissolver 20g de ácido bórico em 1 litro de água destilada e 
acrescentar 15ml de uma solução alcoólica a 0,1% de verde 
de bromocresol e 6ml de solução alcoólica de vermelho de 
metila a 0,1%.
c. Solução de ácido sulfúrico (0,05 N). Colocar cerca de 500mL 
de água destilada em um balão volumétrico de 1000mL e em 
seguida acrescentar 1,4mL de ácido sulfúrico concentrado 
(36 N) e padronizar (Anexo 5)
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 81
V. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
FRANCO, G. Tabela de composição química dos alimentos. 9 ed. 
São Paulo: Atheneu, 2000. 307p.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos 
químicos e biológicos. Vicosa: UFV, 2002. 235p.
82 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção 
de proteínA solúVel
método espeCtrofotométriCo de BrAdford
i. introdução
As proteínas são compostos nitrogenados, consideradas 
macromoléculas formadas a partir da união de vários aminoá-
cidos entre si. Várias são as classificações que se podem empre-
gar para as proteínas. Uma destas classificações, por exemplo, 
subdivide as proteínas em duas categorias, proteínas solúveis 
e proteínas estruturais. As proteínas estruturais geralmente 
encontram-se ligadas a outros compostos e são constituintes 
das membranas celulares, enquanto que as proteínas solúveis 
participam diretamente do metabolismo vegetal, notadamente 
como enzimas.
O reagente Coomassie Brilliant Blue G-250 reage com as pro-
teínas produzindo um complexo de coloração azul escuro. A 
ligação do corante às proteínas causa um aumento no pico má-
ximo de absorção do corante de 465 para 595nm, cuja absor-
bância apresenta uma correlação bastante linear com valores de 
concentração de soluções padrões de proteína. O processo de 
ligação do reagente com as proteínas é bastante rápido, comple-
14
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 83
tando-se em aproximadamente dois minutos, e mantendo a cor 
estável por uma hora. Os resultados de análises, empregando-
se este método, apresentam boa reprodutibilidade, apresentan-
do pouca ou nenhuma interferência de cátions como Na+ ou K+, 
ou carboidratos tal como a sacarose. Uma pequena intensidade 
de cor é desenvolvida na presença de agentes tamponantes for-
temente alcalinos. No entanto, a análise pode ser efetuada acu-
radamente empregando-se controles tamponados apropriados. 
Os poucos componentes que apresentam excessiva interferên-
cia na cor, são grandes quantidades de detergentes tais como 
sulfato de dodecyl sódio, Triton X-100, e detergentes comerciais. 
A interferência por pequenas quantidades de detergentes tam-
bém pode ser eliminada pelo uso de controles apropriados.
ii. mArChA AnAlítiCA
Preparo do extrato: amostra pré-seca
1. Pesar 0,250 g de amostra pré-seca e transferir para um 
erlenmeyer de 125 mL;
2. Adicionar 20 mL de etanol* a 80 %;
3. Agitar por 30 minutos e em seguida filtrar em tecido de 
náilon de malha fina;
4. Completaro volume do filtrado para 50 mL com água 
destilada;
5. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
84 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
*OBS.: Este extrato também pode ser usado para a determina-
ção de sacarose e aminoácidos livres totais. Embora a água des-
tilada seja um bom solvente para a extração das proteínas solú-
veis, é recomendado usar etanol a 70 ou 80 % por duas razões: 
o etanol auxilia a quebrar a tensão superficial facilitando uma 
melhor interação do solvente com a amostra, além de propiciar 
uma melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvi-
mento de microorganismos.
Preparo do extrato: folhas frescas
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, 
com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura 
central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca de 
3 a 5 mm.
2. Pesar 200 mg das amostras de folhas e transferir para um tubo 
de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5 mL de etanol a 80 % e triturar em um homogenei-
zador de tecido vegetal.
4. Filtrar, transferindo quantitativamente para um balão volu-
métrico de 25 mL, usando uma tela de náilon de malha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5 mL do mesmo solvente e transferir, sob filtração, o ma-
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 85
terial para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em seguida com-
pletar o volume do balão volumétrico com o mesmo solvente.
7. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
Desenvolvimento da cor
9. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, 200 µL das so-
luções padrões de BSA e dos extratos das amostras. Fazer o 
“branco” usando água destilada em vez de BSA; 
 10. Acrescentar 4mL do reagente coomassie brilliant blue, agi-
tar suavemente e deixar em repouso por 5 minutos;
11. Fazer as leituras em espectrofotômetro, no comprimento de 
onda de 595 nm;
12. Calcular o conteúdo de proteína solúvel, expressando os re-
sultados em termos de mg de proteína solúvel por grama de 
tecido foliar fresco.
iii. prepAro dos reAgentes
Coomassie brilliant blue. Pesar 0,0100g de coomassie 
brilliant blue (G-250), dissolver em 5mL de etanol a 95%, adicio-
nar 10mL de ácido fosfórico concentrado e 85mL de água desti-
lada. Misturar bem, filtrar e manter em frasco escuro.
86 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Solução padrão de proteína solúvel.
Solução estoque de BSA a 1000 mg.L-1. Pesar exatamente 
0,1000g de albumina de soro bovino BSA (PA), dissolver em 
água destilada e completar o volume para 100 mL;
Padrões de trabalho. Pipetar para tubos de ensaio, separa-
damente, exatamente 1, 2, 4 e 10mL da solução estoque de BSA 
(1000 mg.L-1) e completar o volume precisamente para 20mL 
com água destilada, o que proporcionará soluções nas concen-
trações de 50, 100, 200 e 500 mg.L-1.
Observações:
1. Esta análise também pode ser realizada em amostra pré-seca 
de tecido vegetal. Neste caso, pode-se preparar um extrato 
aquoso, dispensando, portanto a Cromatografia de Partição 
com vistas à separação dos pigmentos fotossintéticos. Da 
mesma forma, também pode ser preparado o extrato etanóli-
co, conforme preparado para a determinação de carboidratos 
solúveis totais e sacarose;
2. No preparo do extrato vegetal empregando-se tecido vegetal 
fresco, a diluição da amostra pode ser feita com base no peso 
final do extrato em vez do volume. Neste caso minimiza-se o 
erro decorrente da volatilização do etanol durante o processo 
de extração. Para a conversão do peso do etanol a 80% em vo-
lume, recomenda-se utilizar a densidade de 0,8687 g.mL-1.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 87
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the determination 
of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-
dye binding. Analitical Biochemistry, v.72, p.248-254, 1976.
88 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de AminoáCidos 
liVres totAis
método espeCtrofotométriCo dA ninidrinA
i. introdução
Os α-aminoácidos são compostos orgânicos de baixo peso 
molecular, comumente encontrados nas proteínas. Todos os 
aminoácidos, com exceção da prolina, têm como denominador 
comum um grupamento carboxílico livre e um aminogrupo 
livre não-substituído, no átomo de carbono alfa. Eles diferem 
uns dos outros na estrutura de suas cadeias laterais distintas, 
denominadas grupamentos R.
Além dos aminoácidos-padrão comuns (que são vinte) e 
de vários aminoácidos raros das proteínas, mais de 150 outros 
aminoácidos são conhecidos como ocorrendo biologicamente 
em forma livre ou combinada, porém nunca em proteínas. Al-
guns destes são precursores importantes ou intermediários no 
metabolismo. As plantas superiores possuem uma variedade 
extraordinária de aminoácidos não-protéicos, sendo a maioria 
deles de função metabólica desconhecida.
Nesta determinação, ocorre uma reação amplamente utili-
zada do α-aminogrupo, a reação da ninidrina, a qual permite 
15
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 89
determinar quantitativamente os aminoácidos em quantidades 
muito reduzidas. Pelo aquecimento, um α-aminoácido reage 
com duas moléculas de ninidrina para produzir um composto 
intensamente colorido. Uma cor púrpura é obtida na reação da 
ninidrina por todos os aminoácidos e peptídeos que apresen-
tam um α-aminogrupo livre, enquanto que a prolina e a hidro-
xiprolina, em que o α-aminogrupo está substituído, produzem 
derivados com uma cor amarela característica.
Durante a reação, a ninidrina, que é um agente fortemente 
oxidante, ocasiona a oxidação descarboxilativa dos aminoáci-
dos. O amônio e a hidrindantina assim formados, reagem com 
uma segunda molécula de ninidrina para produzir um com-
posto corado de violáceo, no qual somente o átomo de nitrogê-
nio é proveniente do aminoácido (Lehninger, 2002).
ii. mArChA AnAlítiCA
Preparo do extrato: folhas frescas
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, 
com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura 
central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca de 
3 a 5 mm.
2. Pesar 500 mg das amostras de folhas e transferir para um 
tubo de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5 mL de etanol a 80 % e triturar em um homoge-
90 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
neizador de tecido vegetal.
4. Filtrar, transferindo quantitativamente para um balão volu-
métrico de 25 mL, usando uma tela de náilon de malha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5 mL do mesmo solvente e transferir, sob filtração, o ma-
terial para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em seguida 
completar o volume do balão volumétrico com o mesmo sol-
vente.
7. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
Preparo do extrato: amostra pré-seca
1. Pesar 0,250 g de amostra pré-seca e transferir para um erlen-
meyer de 125 mL;
2. Adicionar 20 mL de etanol* a 80 %;
3. Agitar por 30 minutos e em seguida filtrar em tecido de nái-
lon de malha fina;
4. Completar o volume do filtrado para 50 mL com água desti-
lada;
5. Homogeneizar,transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 91
*OBS.: Este extrato também pode ser usado para a determina-
ção de sacarose e proteínas solúveis. Embora a água destilada 
seja um bom solvente para a extração dos aminoácidos livres 
totais, é recomendado usar etanol a 70 ou 80 % por duas razões: 
o etanol auxilia a quebrar a tensão superficial facilitando uma 
melhor interação do solvente com a amostra, além de propiciar 
uma melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvi-
mento de microorganismos.
Desenvolvimento da cor.
1. Pipetar para um tubo de ensaio 0,5mL do tampão citrato 
200mM, 1,2mL do reagente revelador (ninidrina + KCN) e 
1,0mL do padrão de leucina ou amostra problema (deve-se 
respeitar a ordem de adição de cada reagente);
2. Tampar os tubos de ensaio, agitar suavemente e colocar para 
aquecer em banho-maria a 100°C por 15 minutos;
3. Esfriar os tubos em banho de gelo por 5 minutos e, em segui-
da, adicionar 3,0mL de etanol a 60% para fixar a cor desenvol-
vida (violeta), ficando estável por até 3 horas;
4. Agitar e ler a absorbância a 570nm em espectrofotômetro de 
emissão. A partir da curva padrão, obtém-se uma equação de 
regressão para o cálculo das concentrações de aminoácidos 
nas amostras.
Observações
1. Esta análise também pode ser realizada em amostra pré-seca 
92 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
de tecido vegetal. Neste caso, pode-se preparar um extrato 
aquoso, dispensando, portanto a cromatografia de partição 
com vistas à separação dos pigmentos fotossintéticos. Da 
mesma forma, também pode ser preparado o extrato etanóli-
co, conforme preparado para a determinação de carboidratos 
solúveis totais e sacarose;
2. No preparo do extrato vegetal empregando-se tecido vegetal 
fresco, a diluição da amostra pode ser feita com base no peso 
final do extrato em vez do volume. Neste caso minimiza-se o 
erro decorrente da volatilização do etanol durante o processo 
de extração. Para a conversão do peso do etanol a 80% em vo-
lume, recomenda-se utilizar a densidade de 0,8687g.mL-1.
iii. prepAro dos reAgentes
a. Tampão citrato 200mM (pH 5,0). Pesar 21,014g de ácido cítri-
co monohidratado (P.M. = 210,14), adicionar 200mL de NaOH 
1,0 M e uma gota de solução saturada de Timol (P.M. = 150,22). 
Ajustar o pH para 5,0 utilizando o NaOH 1,0 M e completar o 
volume para 500mL com água destilada.
b. Solução estoque de KCN (10 mM). Válida por 3 meses. Pesar 
0,1628g de KCN (P.M. = 65,12), dissolver em água destilada e 
completar o volume para 250 mL.
c. Solução de KCN 0,2 mM em Metilcelosolve. Válida por 
1 mês. Pipetar 5,0mL da solução estoque de KCN 10mM 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 93
para um balão volumétrico de 250mL e completar o volu-
me com metilcelosolve. Este reagente também é conhecido 
como etilenoglicol monometil éter, metoxietanol e metil-
glicol (C3H8O2, P.M. = 76,10).
d. Ninidrina a 5%. Válida por 6 meses. Pesar 12,5g de ninidri-
na (P.M. = 178,15), dissolver em metilcelosolve e completar o 
volume para 250mL, com este mesmo solvente.
e. Reagente revelador. Preparado no momento da análise. Mis-
turar a solução de KCN 0,2mM com a ninidrina a 5% na pro-
porção de 1:5 (v/v).
f. Preparo da curva padrão. Solução estoque de leucina 
(50mg.L-1). Pesar 50mg de leucina, dissolver em cerca de 
100mL de água deionizada e em seguida completar o volume 
para 1,0 L com água deionizada.
g. Padrões de trabalho. Pipetar para balões volumétricos de 
50mL alíquotas de 5, 10, 15, 20 e 25mL da solução estoque 
de leucina (50mg.L-1) e completar o volume com água deio-
nizada. Ao final desta etapa, resultarão os padrões 5, 10, 
15, 20 e 25µg de leucina por mL de solução. Utilizar água 
deionizada como padrão zero. Esta curva padrão apresenta 
boa linearidade.
94 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de bioquímica (Lehninger). 4. 
ed. São Paulo: Sarvier, 2002. 1232p. il.
YEMM, E.W.; COCKING, E.C. The determination of amino-acids 
with ninhydrin. Analyst, v.80, p.209-213, 1955.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 95
determinAção de prolinA liVre
em teCido foliAr fresCo
método espeCtrofotométriCo dA ninidrinA
i. introdução
A prolina é estudada conjuntamente com os aminoácidos 
protéicos devido a sua participação como componente das pro-
teínas. No entanto, como pode se constatar em sua fórmula es-
trutural, trata-se na verdade de um iminoácido heterocíclico de 
peso molecular igual a 115.
 
Fórmula estrutural da prolina
As pesquisas têm constatado que a prolina livre é acumula-
da em plantas cultivadas em condições de estresse hídrico, sen-
do considerada como um soluto compatível que desempenha 
papel osmorregulador em determinadas espécies vegetais. A 
quantificação da prolina livre em tecido vegetal fresco pode ser 
H
H H
H COOH
H
H
H
C
C
N
C
C
16
96 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
realizada por método colorimétrico, de boa precisão e pratica-
mente livre de interferentes dentre os componentes vegetais.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Pesar 250mg de tecido foliar fresco;
2. Triturar utilizando 5mL de solução de ácido sulfossalicílico a 
3% como solvente;
3. Centrifugar por 10 minutos a 2000g;
4. Transferir para um tubo de ensaio rosqueável: 
1mL do padrão ou do extrato centrifugado;
1mL de ninhidrina ácida;
1mL de ácido acético glacial;
5. Fechar o tubo de ensaio e aquecer por uma hora a 100°C;
6. Após uma hora de aquecimento, resfriar o tubo de ensaio em 
banho de gelo;
7. Adicionar 2mL de tolueno a cada tubo de ensaio e agitar vigo-
rosamente por aproximadamente 20 segundos;
8. Deixar em repouso por cerca de 5 a 10 minutos para que ocor-
ra a separação das fases;
9. Recolher a fase orgânica e ler a absorbância no comprimento 
de onda de 520nm, usando-se o tolueno como branco;
10. Calcular o teor de prolina livre do tecido foliar fresco, com-
parando com os valores da curva padrão e expressar os resul-
tados em µmol.g-1 de tecido foliar fresco.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 97
ii. prepAro dos reAgentes
1. Ácido sulfossalicílico: solução aquosa a 3% (p/v).
2. Solução Estoque de Prolina (50mg.L-1): pesar 50mg de proli-
na, dissolver em água destilada e completar o volume para 1 
litro.
3.Padrões de Trabalho de Prolina. Partindo da solução estoque 
e água destilada, preparar soluções padrões contendo 0, 5, 10, 
15, 20 e 25mg.L-1 de prolina.
4. Ninhidrina Ácida: Pesar 1,25g de ninhidrina e transferir para 
um béquer. Adicionar 30mL de ácido acético glacial e 20mL 
de ácido fosfórico 6 M. Colocar para aquecer brandamente 
(aprox. 70°C) sob agitação até dissolver. Esfriar rapidamente 
em banho de gelo. O reagente permanece estável por 24 ho-
ras, se guardado a 4°C.
iii. BiBliogrAfiA
BATES, L.S.; WALDREN, R.P.; TEARE, I.D. Rapid determination of 
free proline for water-stress studies. Plant and Soil, v.39, p205-207, 
1973.
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
98 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção 
de gliCinABetAinA
método espeCtrofotométriCo
i. introdução
A glicinabetaína é um derivado do aminoácido glicina com 
o N completamente metilado. Assim como a colina, é um com-
posto de amônio quaternário(QAC), encontrado em várias 
plantas submetidas às condições de estresse, particularmente 
as plantas da família das chenopodiáceas. A glicinabetaína ou 
simplesmente betaína, como também é conhecida, é um inter-
mediário na biossíntese da metionina (aminoácido sulfurado). 
As plantas quando submetidas às condições de estresse salino 
ou hídrico necessitam diminuir o potencial osmótico intrace-
lular, para tolerar tal condição. Para baixar o potencial osmóti-
co, as plantas podem absorver íons inorgânicos e ou sintetizar 
compostos orgânicos, os putativos solutos compatíveis, que 
funcionam como osmorreguladores ou osmoprotetores. Vários 
compostos têm sido citados como osmorreguladores ou solu-
tos compatíveis, entre eles, são mencionados: prolina, glicina-
betaina, manitol, carboidratos, aminoácidos, etc. A literatura 
tem mostrado que plantas de centeio contêm 3,2 e 15,8 mg.kg-1 
17
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 99
de betaína, respectivamente em baixa e elevada salinidade, en-
quanto que plantas de atriplex apresentam 17,7 e 24,6 mg.kg-1 de 
betaína, respectivamente em baixa e elevada salinidade.
A determinação da glicinabetaína pode ser feita em um ex-
trato aquoso, espectrofotometricamente, com periodeto de po-
tássio em presença de dicloroetano.
ii. mArChA AnAlítiCA
Preparo do extrato. Pesar 0,5g da amostra (m.s.), transferir 
para frascos de vidro, acrescentar 20mL de água deionizada, 
fechar os frascos e colocar para agitar por 24 horas.
Desenvolvimento da cor. 
1. Diluir o extrato, pipetando 1mL do mesmo e acrescentando 
1mL de H2SO4 (2N), mantendo em banho de gelo;
2. Homogeneizar e pipetar uma alíquota de 500µL para tubos 
de centrífuga com parede grossa e manter em banho de gelo 
por 1 hora;
CH3
CH3 H
CH3 H
N+ CC
O
O-
100 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
3. Adicionar 200µL de KI-I2 previamente resfriado e agitar sua-
vemente em agitador de tubos de ensaio, tipo vortex;
4. Manter os tubos de centrífuga em refrigerador (0 a 4°C) por 
16 horas, para formação do complexo cristalino de QAC-pe-
riodeto, em seguida centrifugar por 15 minutos (10.000 rpm 
a 0°C);
5. Manter em banho de gelo e cuidadosamente aspirar o sobre-
nadante e desprezar;
6. Dissolver os cristais do complexo QAC-periodeto em 9mL de 
1,2-dicloroetano;
7. Agitar vigorosamente em agitador tipo vortex até completa 
dissolução;
8. Aguardar de 2 a 2,5 horas e ler a absorbância a 365nm;
9. Comparar com padrões de glicinagetaína.
iii. reAgentes
Solução de periodeto de potássio (KI-I2). Pesar 20g de iodeto 
de potássio, transferir para um béquer contendo cerca de 50mL 
de água destilada, acrescentar 17,5g iodo, dissolver e completar 
o volume para 100mL com água destilada;
Ácido sulfúrico 2N. Pipetar 13,9mL de ácido sulfúrico con-
centrado (36N) para um balão volumétrico de 250mL, contendo 
cerca de 200mL de água destilada. Homogeneizar e completar 
o volume.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 101
Ácido sulfúrico 1N. Pipetar 6,94mL de ácido sulfúrico con-
centrado (36N) para um balão volumétrico de 250mL, contendo 
cerca de 200mL de água destilada. Homogeneizar e completar o 
volume, ou diluir parte do ácido sulfúrico 2 N em partes iguais, 
isto é, 1+1 (em volume). 
Solução estoque de glicinabetaína (padrão 2.500mg.L-1). 
Pesar exatamente 0,250g de glicinabetaína (anidra), dissolver e 
completar o volume para 100mL com ácido sulfúrico 1N. Tam-
bém encontrado nos catálogos como betaína (P.M. 117,15).
Padrões de trabalho de glicinabetaína. Pipetar para balões 
volumétricos de 100mL, 2, 4, 6 e 8mL da solução estoque de 
glicinabetaína (2.500mg.L-1), completar o volume com ácido sul-
fúrico 1N. Tal diluição proporcionará padrões de trabalho nas 
concentrações de 50, 100, 150 e 200mg.L-1. O padrão zero (branco) 
é o ácido sulfúrico 1N.
iV. BiBliogrAfiA 
FLOWERS, T.J.; TROKE, P.F.; YEO, A.R. The mechanism of salt 
tolerance in halophytes. Ann. Rev. Plant Physiol., v.28, p.89-121, 1977.
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v.70, p.303-307, 1983.
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102 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
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Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Unesp, Campus de 
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and biological environment. Berlin: Spring-Verlag, 1983. p.35-58. 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 103
determinAção de nitrAto 
em teCido VegetAl
método espeCtrofotométriCo 
do áCido sAliCíliCo
i. introdução
Nitrato é a principal forma de absorção de nitrogênio pela 
maioria das plantas. Após sua absorção, o mesmo é reduzido 
a amônio para em seguida ser incorporado aos compostos or-
gânicos, formando aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos e 
demais compostos nitrogenados. O acúmulo de nitrato em alta 
concentração no tecido vegetal pode causar distúrbio nutricio-
nal, quando ingerido em concentrações acima de 2.500mg.kg-1, 
o nitrato pode ser reduzido a nitrito, o qual na corrente sangü-
ínea pode causar a metahemoglobinemia ou resultar na forma-
ção de nitrosaminas, as quais são cancerígenas e mutagênicas.
Para a determinação de nitrato geralmente são utilizados 
métodos potenciométricos ou espectrofotométricos. O método 
do ácido fenoldissulfônico é versátil, porém tedioso. Já o méto-
do enzimático requer uma enzima de difícil preparo e conso-
me muito tempo. A baixa sensibilidade e a interferência de íons 
como Cl-, NH4
+ e NO2
- na análise são também responsáveis pelo 
18
104 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
desuso desses métodos. No entanto, o método do ácido salicí-
lico é rápido, livre de interferência de outros íons presentes em 
tecidos vegetais e apropriado para análise de uma ampla faixa 
de concentrações de nitrato.
Neste método, o ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzóico) ao 
reagir com o N-NO3
- tem o carbono 5 (que é para em relação ao 
grupamento hidroxílico) nitrificado. Os nitrocompostos forma-
dos são essencialmente o ácido 5-nitrossalicílico e uma peque-
na quantidade do isômero 3-nitrossalicílico.
A reação ocorre em pH alcalino (acima de 12) formando-se o 
nitro-composto de cor amarela. Na reação, a relação molar en-
tre o ácido salicílico e o nitrato é de 1:1, sugerindo que a nitrata-
ção ocorre primariamente em uma única posição, por molécula 
de ácido salicílico (Cataldo et al., 1975).
ii. mArChA AnAlítiCA
a. Preparo do extrato utilizando matéria fresca.Utilizar o mes-
mo extrato preparado na análise de aminoácidos livres totais. 
Apenas a diluição a ser feita deverá ser diferente. Usualmente 
o fator de diluição utilizado é de no máximo 5 vezes.
b. Preparo de extrato utilizando matéria seca. Pesar 0,25g de 
material vegetal seco e colocar em um tubo de ensaio ros-
queável em presença de 10mL de água deionizada, levando, 
em seguida, a suspensão para aquecer em banho-maria a 45°C 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 105
por uma hora; Após o aquecimento, agitar e filtrar a mistura 
em tecido de náilon de malha fina, recolhendo o filtrado em 
outro tubo de ensaio rosqueável, ou centrifugar a mistura a 
2000g por 15 minutos. Guardar o filtrado (ou sobrenadante) 
em geladeira até o momento da análise.
c. Análise do nitrato. 
1. Pipetar para um tubo de ensaio 0,2mL da solução pa-
drão ou extrato da amostra e 0,5mL do reagente revela-
dor (AS-H2SO4), agitando vigorosamente em seguida;
2. Deixar a mistura em repouso por 20 minutos à tempera-
tura ambiente;
3. Adicionar lentamente 10mL de NaOH 4 M, e logo depois 
agitar para deixar a mistura com uma coloração homo-
gênea (unifásica). Neste momento ocorre a formação de 
um composto de cor amarelada estável por menos de 48 
horas;
4. Deixar o tubo esfriar e proceder à leitura de absorbância 
a 410nm em espectrofotômetro de emissão. A partir da 
curva padrão, obter a equação de regressão para o cálcu-
lo da concentração de nitrato nas amostras.
iii. prepAro dos reAgentes
a. Solução de ácido salicílico a 5% em H2SO4 (AS-H2SO4). Pesar 
1,25g de ácido salicílico (P. M.= 138,12) e dissolver em H2SO4 
106 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
concentrado (P.A). Completar o volume para 25mL com o 
mesmo solvente. Guardar em frasco âmbar (validade de uma 
semana).
b. Solução estoque de nitrato (1.000mg.L-1). Pesar 1,3710g de 
NaNO3 (P.M.=85,00), dissolver em água deionizada e comple-
tar o volume para 1.000mL. Conservar em geladeira.
c. Padrão de trabalho. Pipetar para cinco balões volumétricos 
de 50mL, 1,25; 2,5; 5,0; 10,0 e 15mL de solução estoque de ni-
trato (1.000 mg.L-1) e completar o volume com água deioniza-
da. Ao final, resultarão soluções padrões nas concentrações 
de 25, 50, 100, 200 e 300mg.L-1 de NO3
-. O branco (padrão zero) 
corresponde à água deionizada.
d. Solução de NaOH 4 M. Pesar 40g de NaOH, dissolver em 
200mL de água destilada, deixar esfriar e completar o volume 
para 250mL.
iV. BiBliogrAfiA
CATALDO, D.A.; HAROON, M; SCHRADER, L.E.; YOUNHG, V.L. 
Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissue by nitration 
of salicylic acid. Commun. Soil Science and Plant Analysis, v.6, n.1, 
p.71-80, 1975.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 107
determinAção dA AtiVidAde de 
nitrAto redutAse (e.C.1.6.6.1) 
em teCido VegetAl
i. introdução
A nitrato redutase é uma enzima complexa, contendo 
vários grupos prostéticos, incluindo FAD, citocromo e mo-
libdênio. Em plantas superiores, seu peso molecular é da 
ordem de 200.000 Daltons, enquanto que em organismos in-
feriores, é cerca de 500.000 Daltons. A mesma desempenha 
um papel importante na assimilação (utilização) do nitro-
gênio pelas plantas. 
Depois que o nitrogênio é absorvido pelas raízes na 
forma de nitrato (NO3
-), o mesmo é translocado através do 
xilema para as folhas, onde é reduzido a nitrito (NO2
-) e 
posteriormente a amônio. Este processo de redução tam-
bém pode ocorrer, geralmente em menor escala, nas raízes, 
dependendo da espécie vegetal, até mesmo de forma apa-
rentemente exclusiva.
A redução do nitrato a nitrito é catalisada pela nitrato re-
dutase e não requer a participação direta de luz, porque o 
agente redutor primário é o NADH, que provém das reações 
19
108 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
oxidativas do citoplasma, onde está localizada a enzima. Em 
tecidos não clorofilados, como as raízes, o doador de elétrons 
poder ser o NADH ou o NADPH. As nitrato redutases encon-
tradas em vegetais superiores são constituídas por duas su-
bunidades idênticas contendo três grupos prostéticos cada: 
FAD, heme e um complexo formado entre o molibdênio e a 
pterina. Por outro lado, a redução do nitrito a amônio (NH4
+) 
ocorre nos cloroplastos, exigindo a transferência direta de 
elétrons via ferredoxina, estando portanto, associada às 
reações fotossintéticas (Taiz & Zeiger, 2009). As equações 
abaixo representam o processo de redução do nitrato a nitri-
to, e do nitrito a amônio:
 
 Fd-red = Ferredoxina reduzida; Fd-ox = Ferredoxina oxidada
As mais altas atividades da nitrato redutase são obtidas 
em folhas jovens, provenientes de plantas cultivadas com 
NO3-
NO2-
NO2-
NH4+
NADH NAD+
Fd-red Fd-ox
nitrato redutase
nitrito redutase
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 109
adequada provisão de nitrato e adequada iluminação. Ge-
ralmente a taxa máxima da atividade da nitrato redutase é 
atingida 3 a 4 horas após o início do dia, em plantas cultiva-
das em campo.
As determinações da atividade da nitrato redutase po-
dem ser sumarizadas em dois métodos: método in vitro e 
método in vivo. Para a análise pelo método in vitro, a enzima 
é extraída do tecido vegetal, através da maceração do tecido 
em solução tampão adequada, em seguida o extrato é pu-
rificado por centrifugação em gradiente ou cromatografia. 
Após a purificação, alíquotas do extrato enzimático são adi-
cionadas à mistura de reação e em seguida a atividade da 
mesma é medida por espectrofotometria.
O método in vivo é assim denominado porque a atividade 
da enzima é medida sem provocar o rompimento das cé-
lulas vegetais. Por este método, pequenos discos de folhas 
recém colhidas são incubadas no escuro, em solução tam-
pão contendo nitrato e outros componentes que facilitam a 
difusão do substrato através da membrana celular. Após de-
terminados intervalos de tempo, recolhem-se alíquotas do 
extrato incubado e determina-se por colorimetria ou espec-
trofotometria, a quantidade de nitrito formada. A atividade 
da enzima é então calculada em função da quantidade do 
produto da reação formado, durante um determinado inter-
valo de tempo, por grama de tecido analisado.
110 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. mArChA AnAlítiCA pArA determinAção In 
VIVo dA AtiVidAde dA nitrAto redutAse em 
teCido foliAr.
1. Preparar quatro cubetas de leitura espectrofotométrica de 
1mL e pipetar para cada uma, 400µL de água deionizada e 
500µL da mistura de reagentes reveladores;
2. Pipetar 5mL do meio de incubação para um tubo de ensaio;
3. Pesar cerca de 250mg de seções de folhas (desprezando as 
nervuras), com cerca de 5mm de diâmetro e transferir para o 
tubo de ensaio contendo o meio de incubação (item 2);
4. Colocar o tubo de ensaio contendo a amostra e meio de incu-
bação (item 3), em local escuro, à temperatura de 30°C;
5. Adaptar uma mangueira de borracha, conectada à uma 
bomba de vácuo, à boca do tubo de ensaio que contém o 
meio de incubação (item 4), e provocar uma leve sucção por 
60 segundos;
6. A cada 15 minutos, após o início da incubação, retirar uma 
alíquota de 100µL do extrato de incubação, e transferir para 
uma das cubetas de leitura espectrofotométrica, que contém 
as soluções de leitura (item 1);
7. Após a coleta da alíquota correspondente a 60 minutos da 
reação enzimática, aguardar 15 minutos para permitir o de-
senvolvimento da cor (violeta) e fazer a leitura em espectro-
fotômetro a 540nm;
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 111
8. Enquanto aguarda a reação enzimáticase processar (item 7), 
preparar a curva padrão. Para isto, pipetar para 6 cubetas, 
separadamente, 400µL de água deionizada, 500µL da mistura 
de reagentes reveladores e 100µL das soluções padrões con-
tendo 0, 10, 20, 30, 40 e 50µM de nitrito;
9. Aguardar 15 minutos e fazer a leitura da mesma forma como 
mencionado no item 7;
10. De posse dos valores das leituras espectrofotométricas da 
amostra e das soluções padrões, proceder aos cálculos da ati-
vidade enzimática e representar graficamente a atividade da 
enzima em função do tempo de reação. Adote como unidade 
da atividade enzimática, µmol de nitrito produzido por gra-
ma de tecido.
iii. prepAro dos reAgentes
Meio de incubação. Pipetar 20µL de espalhante adesivo para 
um béquer, adicionar 2mL de n-propanol e agitar suavemente 
até dissolver o espalhante adesivo. Adicionar cerca de 100mL 
de água deionizada, 2,022g de nitrato de potássio e 2,7218g de 
fosfato monobásico de potássio. Agitar até dissolver os sais, 
transferir para um balão volumétrico de 200mL e completar o 
volume com água deionizada.
Solução dos reagentes reveladores. A solução dos reagentes 
reveladores é preparada juntando-se partes iguais em volume, 
112 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
de solução 0,02% de N-(1-naftil) etilenodiaminocloridrato com 
a solução 1,0% de sulfanilamida (em HCl 1,5 M).
Solução Padrão de Nitrito de sódio 1,0 mM. Pesar 0,0069g 
de nitrito de sódio, dissolver em água deionizada e completar o 
volume para 100mL. A partir desta solução estoque, preparar 
uma curva padrão na faixa de 0 a 50µM de nitrito. Pipetar para 
balões volumétricos de 50mL, separadamente, 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 
e 2,5mL da solução estoque de nitrito, completando o volume 
com água deionizada. Ao final, resultarão soluções padrões 
nas concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50µM de nitrito. Como pa-
drão zero de nitrito, utiliza-se apenas água deionizada. Após o 
preparo das soluções, transferir as mesmas para frascos apro-
priados e conservar em geladeira.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 113
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
CARVALHO, P.G. de; AIDAR, M.P.M.; ZAIDAN, L.B.P.; CARVALHO, 
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114 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção dA AtiVidAde 
dA peroxidAse (eC 1.11.1.7)
i. introdução
As peroxidases (POD) são enzimas comuns em plantas e 
o aumento de sua atividade, como resposta ao ataque de pa-
tógenos, indica seu envolvimento em mecanismo de defesa, 
desempenhando importante papel no processo fisiológico, 
incluindo catabolismo das auxinas, modificações das pro-
priedades da parede celular e lignificação (Wyatt et al., 1991). 
No mecanismo de defesa das plantas, as peroxidases atuam 
no processo de lignificação da parede celular, participando 
na conversão do álcool cinâmico em formas de radicais livres 
com o consumo do peróxido de hidrogênio, caracterizando o 
último passo da formação da lignina, embora, alguns autores 
consideram que o mecanismo ainda não está totalmente es-
clarecido (Heldt, 1997).
Certas enzimas associadas ao estresse causado por excesso 
de oxidantes também são importantes nos mecanismos de de-
fesa. As superóxidos dismutases, por exemplo, ajudam a anular 
radicais livres. Como o peróxido de hidrogênio (H2O2) é alta-
mente tóxico para as células, os organismos aeróbicos criaram 
meios de proteção contra seus efeitos, usando enzimas (cata-
20
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 115
lases e peroxidases) para removê-lo. As catalases convertem o 
composto em O2 e H2O e as peroxidases em H2O.
A atividade da POD é estimada com base na diferença de ab-
sorbância produzida com a oxidação do guaiacol e concomitan-
te redução do peróxido de hidrogênio (Dann e Deverall, 2000).
Representação da reação entre o guaiacol e o peróxido de 
hidrogênio, catalisada pela peroxidase
 
ii. proCedimento AnAlítiCo
Preparo do extrato
a. Pesar 1,0g da amostra, colocar em almofariz e acrescentar 
50mg de PVP e cerca de 10mL de nitrogênio líquido;
b. Macerar a amostra com o auxílio de um pistilo e imediata-
mente acrescentar 3mL da solução tampão acetato de sódio 
(50mM, pH 5,0), contendo 1mM de EDTA;
c. Homogeneizar a mistura e em seguida centrifugar por 10 mi-
nutos a 10.000g* e 4°C;
d. Transferir o sobrenadante para tubos de Eppendorf e arma-
zenar a -80°C até o momento da avaliação da atividade enzi-
mática.
* Nas separações de compostos por centrifugação é im-
portante levar em consideração que o raio do rotor da 
4 guaiacol + 4 H2O2 tetraguaiacol + 8 H2O
peroxidase
116 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
centrífuga influencia diretamente na capacidade de pre-
cipitação das partículas em suspensão. Assim, de acordo 
com a equação a seguir, a força centrífuga relativa (FCR) 
ou força gravitacional (g) é proporcional ao quadrado da 
velocidade do rotor, expressa em rpm, multiplicado pelo 
raio do rotor da centrífuga, expresso em centímetro (Ro-
byt & White, 1990). 
Atividade enzimática
a. Pipetar para uma cubeta espectrofotométrica: 50µL de guaia-
col (0,2 M), 0,5mL de peróxido de hidrogênio (0,38M) e 2,0mL 
de tampão acetato de sódio (50mM, pH 5,0);
b. Agitar suavemente a mistura e iniciar a reação enzimática 
com a adição de 50µL do extrato enzimático;
c. Efetuar as leituras espectrofotométricas a 470nm, intercala-
das de 10 segundos, pelo prazo de um minuto;
d. Estimar a atividade enzimática com base na diferença de ab-
sorbância por minuto e por peso da amostra fresca.
OBS.: A prova em “branco” é preparada usando-se água desti-
lada em vez do extrato enzimático.
iii. prepAro dos reAgentes
a. Guaiacol (0,2 M). Pipetar para um frasco de cor âmbar, 230µL 
g = 1,119 x 10-5 x (rpm)2 x r
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 117
de guaiacol (C7H8O2) e em seguida acrescentar 10mL de água 
destilada.
b. Tampão acetato de sódio (50mM, pH 5,0). Misturar 14,8mL 
de solução 0,2 M de ácido acético com 35,2mL de solução 
0,2 M de acetato de sódio, ajustar o pH para 5,0, usando ácido 
acético ou acetato de sódio, em seguida completar o volume 
para 200mL. 
c. Ácido acético (0,2 M). Pipetar 2,31mL do ácido acético gla-
cial e completar o volume com água destilada para 200mL. 
d. Acetato de sódio (0,2 M). Dissolver 3,28g de acetato de sódio 
anidro (ou 5,44g de acetato de sódio tri-hidratado) e comple-
tar o volume para 200mL com água destilada.
118 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
DANN, E.K.; DEVERALL, B.J. Activation of systemic disease 
resistance in pea by an avirulent bacterium or benzothiadiazole, but 
not by a fungal leaf spot pathogen. Plant Pathology, n.49, p.324-333, 
2000.
HELDT, H.W. Plant biochemistry and molecular biology. Oxford: 
Oxford University Press, 1998. 552p.
ROBYT,J.F.; WHITE, B.J. Biochemical techniques: theory and 
practice. London: Academic Press. 1990. 407p.
WYATT, S.E.; PAN, S.Q.; KÚC, J. β-1,3-glucanase, chitinase and 
peroxidase activities in tabacco tissue ressistance and suceptible to 
blue mould as related to flowering, age and sucker development. 
Physiological and Molecular Plant Pathology, London, v.39. p.433-
440, 1991.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 119
AtiVidAde dA fenilAlAninA 
AmôniA liAse (eC. 4.3.1.5)
i. introdução
A fenilalanina amônia liase é a enzima que catalisa a con-
versão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico, participando, 
portanto da rota biossintética dos fenilpropanóides. Está envol-
vida na síntese de compostos antimicrobianos, de baixo peso 
molecular, como fitoalexinas, além de flavonóides e da lignina. 
A lignificação dos tecidos atua como uma barreira mecânica 
contra o avanço de patógenos. A indução de lignificação está re-
lacionada como resposta de defesa em várias interações patóge-
no/hospedeiro. A biossíntese da lignina envolve uma rota longa 
com várias etapas, iniciando com a conversão da fenilalanina 
em ácido trans-cinâmico (Figura 9.4).
A enzima fenilalanina amônia liase (PAL) catalisa a primeira 
de uma série de reações metabólicas que gera inúmeros produ-
tos naturais baseados em fenilpropanos, incluindo a lignina, cer-
tos pigmentos e protetores contra luz ultravioleta. A produção 
de tal enzima é regulada durante o crescimento vegetal, mas é 
também induzida em células vizinhas ao local de infecção por 
vários estímulos ambientais, como infecção, ferimentos, conta-
minação por metais pesados, luz e reguladores de crescimento.
21
120 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
A atividade da PAL é estimada com base na diferença de 
absorbância resultante da conversão da fenilalanina em ácido 
trans-cinâmico (Hyodo et al., 1978).
Figura 9.4 Representação da reação catalisada pela fenilalanina amônia liase.
ii. proCedimento AnAlítiCo
Preparo do extrato
a. Pesar 1,0g da amostra, colocar em almofariz e acrescentar 
50mg de polivinilpirrolidone e cerca de 10mL de nitrogênio 
líquido;
b. Macerar a amostra com o auxílio de um pistilo e imediata-
mente acrescentar 3mL da solução tampão TRIS (0,5 M, pH 
8,5), contendo 1mM de EDTA;
c. Homogeneizar a mistura e em seguida centrifugar por 10 
minutos a 10.000g e 4°C;
OH
NH2
H
H
H
C
C
C
O OH
H
H
+ NH3
C
C
C
O
fenialanina
ácido
trans-cinâmico
PAL
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 121
d. Transferir o sobrenadante para tubos de Eppendorf e ar-
mazenar a -80°C até o momento da avaliação da atividade 
enzimática.
Atividade enzimática
a. Pipetar 0,5mL do extrato enzimático para tubo de ensaio;
b. Acrescentar 2,0mL de tampão TRIS (0,5 M, pH 8,5) e 0,5mL 
de solução de fenilalanina (300µM);
c. Incubar por 30 minutos a 40°C;
d. Após a incubação, transferir imediatamente os tubos de 
ensaios para banho de gelo, com o objetivo de encerrar a 
reação;
e. Realizar as leituras espectrofotométricas a 290nm e expres-
sar os resultados em termos de mmol de ácido cinâmico 
produzido por hora e por grama da amostra fresca;
OBS.: A prova em “branco” é preparada usando-se água des-
tilada em vez da fenilalanina.
iii. prepAro dos reAgentes
a. TRIS (0,5 M, pH 8,0), contendo 1mM de EDTA. Pesar 4,44g 
de TRIS (básico), colocar em um béquer de 200mL, acrescen-
tar 0,075g de EDTA, dissolver com 150mL de água destilada, 
ajustar o pH para 8,0 e em seguida completar o volume para 
200mL.
122 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
b. Fenilalanina (30µM). Pesar 0,2478mg de fenilalanina 
(PM = 165,19), dissolver em água destilada e completar o vo-
lume para 50mL.
iV. BiBliogrAfiA
HYODO, H.; KUROOA, H.; YANG, S.F. Induction of phenilalanine 
ammonia lyase and increase in phenolics in lettyce leaves in relation 
to the development of russet spoting caused by ethylene. Plant 
Physiology, n.62, p.31-35, 1978.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 123
determinAção dA AtiVidAde 
dA BetA gluCAnAse (eC 3.2.1.39)
i. introdução
As quitinases e β-1,3-glucanase são enzimas que ocorrem 
nas plantas e hidrolisam a quitina (um polímero de N-acetil-
glucosamina) e a β-1,3-glucana respectivamente. Apresentam 
função de defesa, pela ação direta sobre o patógeno e como 
elicitores ativando outros mecanismos locais ou sistêmicos da 
defesa das plantas (Bol et al., 1990). O aumento da atividade 
da β-1,3-glucanase foi constatado em várias plantas, principal-
mente em Phaseolus vulgaris e Vigna unguiculata, após a indução 
com produtos químicos ou organismos não patogênicos, redu-
zindo a severidade de doenças causadas por vários patógenos 
(Dann et al., 1996). 
A β-1,3-glucanase, também conhecida como glucan endo 
1,3-glucosidase, pertence à família das PR-2 proteínas e apresen-
ta peso molecular de cerca de 33kDa (Lubner-Metzer e Meins, 
1999). Sua atividade pode ser avaliada mediante a dosagem da 
glucose produzida com a hidrólise da laminarina (Tuzun et al., 
1989). A laminarina é um polissacarídeo formado por unidades 
de β-1,3-glucose, encontrado em várias algas pardas, como por 
exemplo a Laminaria digitata.
22
124 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. proCedimento AnAlítiCo
Preparo do extrato
a. Pesar 1,0g do fruto, colocar em almofariz e acrescentar 
50mg de polivinilpirrolidone (PVP) e cerca de 10mL de ni-
trogênio líquido;
b. Macerar a amostra com o auxílio de um pistilo e imedia-
tamente acrescentar 5mL da solução tampão acetato (0,1 M, 
pH 5,0) e 1mL de EDTA (1mM);
c. Homogeneizar a mistura e em seguida centrifugar por 10 
minutos a 10.000g e 4°C;
d. Transferir o sobrenadante para tubos de Eppendorf e ar-
mazenar a -80°C até o momento da avaliação da atividade 
enzimática.
Atividade enzimática
a. Pipetar 25µL do extrato enzimático para tubo de ensaio;
b. Acrescentar 200µL de solução tampão acetato (0,1 M, pH 
5,0) e 200µL de laminarina (15mg.mL-1);
c. Incubar por 30 minutos a 37°C;
d. Após a incubação determinar o teor de glicose produzido 
com a hidrólise da laminarina. 
Determinação de glicose
a. Pipetar para tubos de ensaio rosqueáveis, em separado, 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 125
200µL dos padrões de glucose e do extrato enzimático após 
ter sido incubado;
b. Acrescentar 1,0mL do reagente de Somogyi, tampar os tubos 
e agitar suavemente;
c. Colocar para aquecer a 100°C por 15 minutos e em seguida 
resfriar em banho de gelo;
d. Acrescentar 1,0mL do reagente de Nelson e 5,0mL de água 
destilada;
e. Agitar suavemente e deixar em repouso por 20 minutos;
f. Realizar a leitura espectrofotométirca a 760nm.
g. Comparar os resultados com padrões de glicose
iii. prepAro dos reAgentes
a. Tampão acetato (0,1 M, pH 5,0). Transferir para um béquer 
14,8mL de ácido acético 0,2 M, acrescentar 35,2mL de acetato 
de sódio 0,2 M, conferir o pH e se necessário ajustar para 5,0 
usando uma das duas soluções componente da mistura tam-
pão. Completar o volume para 100mL com água destilada.
b. Ácido acético (0,2M). Pipetar 2,31mL de ácido acético glacial 
para um balão volumétrico de 200mL e completar o volume 
com água destilada.
c. Acetato de sódio (0,2 M). Dissolver 1,64g de acetato de sódio 
(anidro) ou 2,72g de acetato de sódio tri-hidratado em água 
destilada e completar o volume para 100mL.
126 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
d. EDTA (1mM). Pesar 0,2922g de EDTA (PM = 292,2), dissolver 
em água destilada e completar o volume para 1000mL. 
e. Laminarina (15mg.mL-1). Pesar 0,15g de laminarina edissol-
ver em 10mL de água destilada.
iV. BiBliogrAfiA
BOL, J.F.; LINTHORST, H.J.M.; CORNELISSEN, B.J.C. Plant 
pathogenesis-related proteins induced by virus infection. Annual 
Review of Phytopathology. Palo Alto, v.28, p.113-138, 1990.
DANN, E.K. MEUWLY, P.; MÉTRAUX, J.P.; DEVERAL, B.J. The effect 
of pathogen inoculation of salicylic in leaves of green bean, Phaseolus 
vulgaris L. Physiological and Molecular Plant Pathology, London, 
v.49, p.307-319, 1996.
LEUBNER-METZGER, G.; MEINS JUNIOR. Function and regulation 
of plant β-1,3-glucanase (PR-2). In: DATA, S.K.; MUTHUKRISHNAN, 
S. (eds..) Florida: CRC Press LLc., p.49-76. 1999.
TUZUN, S.; RAO, N.M.; VOGEL, J.U.; SCHARDL, C.L.; KÚC, J. Induced 
systemic resistance to blue mold: early induction and accumulation 
of β-1,3-glucanase, chitinase and other pathogenesis-ralated proteins 
(b-proteins) in immunized tabacco. Physiology and Biochemistry, 
v.79, 979-983, 1989.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 127
sepArAção de pigmentos 
fotossintétiCos 
por CromAtogrAfiA em pApel
i. introdução
As técnicas cromatográficas constituem um conjunto de mé-
todos utilizados na identificação, purificação e quantificação de 
compostos e íons orgânicos e inorgânicos. A separação dos com-
postos (ou íons) analisados cromatograficamente ocorre devido 
às diferenças de solubilidade destes, nos solventes utilizados, 
bem como, devido ao grau de afinidade entre os compostos ana-
lisados e a fase adsorvente.
Basicamente, um sistema cromatográfico é constituído de 
duas fases: uma estacionária, que pode ser um sólido ou um 
líquido, e uma fase móvel, a qual pode ser um líquido ou um 
gás. Na cromatografia, a fase móvel desloca-se através dos in-
terstícios ou sobre a superfície da fase estacionária, arrastando 
os compostos a serem separados, em diferentes velocidades.
A cromatografia em papel é um tipo de cromatografia de ad-
sorção. Adsorção é a capacidade de uma substância reter outra 
na sua superfície. Essa retenção se dá através de forças de Van 
der Waals (física) ou de forma mais intensa (adsorção química).
23
128 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Colocar em um almofariz cerca de dois a cinco gramas de 
folhas verdes de uma planta qualquer.
2. Adicionar 4mL de álcool etílico e em seguida macerar as fo-
lhas completamente.
3. Transferir o material macerado para um tecido de náilon de 
malha fina e espremer o mesmo filtrando para uma cápsula 
de porcelana.
4. Preparar uma tira de papel de filtro nas dimensões de 
20cm x 1,5cm e em seguida fazer uma marca com um lápis de 
grafite a 1,5cm de uma das extremidades (veja Figura 3-A).
5. Com o auxílio de uma pipeta de 0,1mL, transferir uma gota 
de extrato alcoólico de pigmentos para a tira de papel de fil-
tro, depositando-a na marca feita anteriormente (Fig.3-B).
6. Pipetar 1mL de éter de petróleo e em seguida mais 1mL de 
hexano para uma proveta de 50mL, depositando os solventes 
diretamente no fundo da proveta. Evite que os solventes to-
quem nas paredes laterais da proveta.
7. Cuidadosamente, coloque o papel de filtro dentro da proveta, 
com a marca onde foi colocado o extrato, voltada para baixo. 
Evite que a marca onde foi colocado o extrato mergulhe no 
solvente (Fig. 3-C)
8. Cubra a proveta com um vidro de relógio e observe a ascen-
ção dos solventes arrastando os pigmentos.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 129
9. Antes da frente do solvente atingir o topo do papel de filtro 
(a cerca de 2cm), retire o papel de filtro da proveta e observe 
o ocorrido.
10. Anote as observações e apresente as suas conclusões.
OBS.: Repetir o mesmo processo utilizando um dos solventes 
abaixo, ou a mistura de dois deles.
Solvente Constante Dielétrica
Hexano 1,89
Éter de petróleo 4,34
Clorofórmio 4,87
Etanol 24,3
Figura 3. Representação das etapas envolvidas na realização de uma 
cromatografia unidimensional em papel.
A B C
130 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E. ALBUQUERQUE, E.L.; BARRETO, L.P. 
Introdução às técnicas cromatográficas. Recife: UFRPE, 2000. 43p.
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introdução a métodos 
cromatográficos. Campinas-SP: Ed. da UNICAMP, 1995. 279p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 131
determinAção de ClorofilA 
em teCido foliAr 
método espeCtrofotométriCo
i. introdução
A fotossíntese é um processo metabólico realizado pelos vege-
tais, e essencial para a manutenção da vida no planeta Terra. Este 
processo se desenvolve em organelas celulares denominadas de 
cloroplastos que ocorrem predominantemente no mesófilo foliar.
A clorofila é um composto orgânico formado por carbono, 
oxigênio, hidrogênio, nitrogênio e contendo no centro de sua 
molécula um átomo de magnésio. Em todos os vegetais supe-
riores existem dois tipos de clorofila: a clorofila a e a clorofila 
b. A clorofila a possui cor verde-azulada, com pico de absor-
ção de luz em 420nm e 663nm, enquanto que a clorofila b tem 
cor verde-amarelada e apresenta absorção de luz máxima em 
453nm e 645nm. As clorofilas podem ser extraídas de estruturas 
fotossintéticas com solventes orgânicos como acetona, etanol, 
etc. Vale salientar que o éter não é um bom solvente para extra-
ção de clorofila. De um modo geral, as folhas apresentam teores 
de clorofila total, isto é, o somatório da clorofila a e clorofila b, 
entre 0,9 e 1,9mg.g-1 de tecido fresco.
24
132 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, 
com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura 
central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca de 
3 a 5mm.
2. Pesar 200mg das amostras de folhas e transferir para um tubo 
de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5mL de acetona a 80% e triturar em um homogenei-
zador de tecido vegetal.
4. Filtrar para um balão volumétrico de 25mL, usando uma tela 
de náilon de malha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5mL do mesmo solvente e transferir, quantitativamente, 
sob filtração, o material para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em seguida com-
pletar o volume do balão volumétrico com o mesmo solvente.
7. Agitar e recolher uma alíquota de cerca de 10mL do filtrado e 
centrifugar por 5 minutos a 2000g.
8. Zerar o espectrofotômetro com acetona a 80% e fazer as lei-
turas das amostras nos comprimentos de ondas de 645nm e 
663nm.
9. Com o auxílio das equações a seguir, calcular a concentração 
de clorofila a, clorofila b e o total das duas e expressar os re-
sultados em mg.g-1 de tecido fresco.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 133
 
Sendo A645 e A663 respectivamente as absorbâncias a 645nm 
e 663nm.
iii. BiBliogrAfiA 
ARNON, D.I. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphen-
oloxidases in Beta bulgaris. Plant Physiology, v.24, n.1, p.1-15, 1949.
LICHTENTHALER, H.K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of 
photosynthetic biomembranes. Methods Enzymology. v.148, p.350-
382, 1987.
MACKINNEY, G. Absorption of light by chlorophyll solutions. J. 
Biol. Chem. 140: 315-322, 1941.
clorofila a (mgL-1) = 12,72 A663 - 2,59 A645
clorofila b (mgL-1) = 22,88 A645 - 4,67 A663
134 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
derminAção dA ACidez 
em suCo de frutAs
i. introdução
Frutas e hortaliças, assim como outros produtosvegetais, 
têm a sua composição alterada ao longo do tempo, quando 
armazenadas ou transportadas por longo período, bem como 
por ação de agentes patológicos. Uma das alterações bastante 
comuns e que pode ser considerada indesejável diz respeito 
ao grau de acidez de certos frutos, o qual contribui de forma 
positiva como componente das características organolépticas. 
O sabor de certas frutas, como o da goiaba, por exemplo, no 
momento da colheita, quando a fruta é colhida próximo à ma-
turação (de vez) é bem diferenciado do seu sabor no estágio de 
maturação plena. Por conseguinte, é importante mencionar 
que a determinação da acidez auxilia na avaliação do estado 
de conservação do alimento. Um processo de decomposição, 
seja por hidrólise, respiração ou fermentação (oxidações) quase 
sempre altera a concentração dos íons hidrogênio no fruto.
A avaliação do sabor exige a participação de técnico trei-
nado ou de equipe de provadores, o que torna este processo 
até certo ponto lento e oneroso. Outra forma de se avaliar a 
acidez, mais precisa e rápida, é através da medição do pH e 
25
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 135
determinação da acidez titulável dos frutos. O pH de um suco 
de fruta, por exemplo, representa a concentração dos íons H+ 
livres no suco, enquanto que a acidez total titulável (ATT) es-
tima a participação dos ácidos, orgânicos ou não, presentes no 
meio. Em ambos os casos, as determinações potenciométricas 
apresentam a vantagem sobre as determinações colorimétri-
cas, devido a não interferência da cor do produto que está sen-
do analisado.
ii. mArChA AnAlítiCA pArA determinAção 
de Att em suCo de limão ou lArAnjA
1. Espremer a fruta e recolher o suco, filtrando-o para um bé-
quer ou erlenmeyer de 100 ou 200mL;
2. Pipetar 10mL do fitrado para um erlenmeyer de 125mL;
3. Acrescentar 20mL de água destilada e em seguida 2 gotas do 
indicador fenolftaleína;
4. Com o auxílio de uma bureta contendo hidróxido sódio 0,1 N, 
titular o conteúdo do erlenmeyer até a mudança da cor para 
rosa claro;
5. Anotar o volume do hidróxido de sódio gasto na titulação e 
proceder aos cálculos.
Observações
a. No caso de sucos muito ácidos, como o de limão por exem-
136 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
plo, recomenda-se usar na titulação um volume menor do 
suco, como 2mL, por exemplo.
b. No caso de um suco pouco ácido, uma alternativa é usar um 
volume maior do filtrado na titulação, como 20 ou 50mL e 
não diluir.
c. Outra alternativa, no caso de um suco pouco ácido, é empre-
gar na titulação uma solução de hidróxido de sódio 0,01 N, 
em vez de 0,1 N.
d. Empiricamente algumas pessoas preferem converter e ex-
pressar os resultados da acidez titulável para a massa de um 
dado ácido orgânico componente da fruta, como o ácido cí-
trico ou málico por exemplo. É importante ressaltar que as 
frutas possuem diversos ácidos orgânicos como componentes 
que contribuem para a acidez das mesmas, que a participa-
ção de cada um desses ácidos varia com uma série de fatores, 
até mesmo com o cultivar e com a massa molecular de cada 
ácido orgânico, além de que alguns ácidos são monohidroxi-
lados enquanto outros são dihidroxilados ou trihidroxilados. 
Tudo isto acarreta uma série de distorções que mascaram a 
interpretação dos resultados, notadamente quando se deseja 
compará-los. 
f. Alternativamente a dosagem da ATT pode ser feita potencio-
metricamente, empregando-se o peagâmetro. Neste caso, em 
vez de acrescentar o indicador ao suco contido no erlenmeyer, 
introduz-se o eletrodo de um peagâmetro previamente cali-
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 137
brado, e procede-se a titulação com o hidróxido de sódio 0,1 N 
até que o pH atinja o valor 8,1 (Instituto Adolfo Lutz, 2008).
iii. CálCulos
Admitindo o exemplo de pipetar 10,0mL do suco da fruta, 
gastar 5,0mL de NaOH 0,1 N na titulação, e que a referida base 
tem um fator de correção da sua normalidade igual a 1,05. 
 
ATT = acidez titulável total, expressa em mL de NaOH 1,0 N
Vb = volume em mililitros da base gastos na titulação
Fpb = fator da padronização da base
100 = constante da expressão dos resultados para 100mL do 
suco
Vs = volume em mililitros do suco empregado na titulação
C = correção da base para padronizar os resultados em NaOH 
1,0 N. 
Se usar uma base 0,1 N o valor de c será igual a 10.
Se usar uma base 0,01 N, o valor de c será igual a 100.
ATT = 
Vb x Fpb x 100
Vs x C
ATT = = 5,25mL / 100mL
5,0mL x 1,050 x 100
10,0ml x 10
138 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. prepAro dos reAgentes
Indicador fenolftaleína a 0,1%. Pesar 0,100g de fenolftaleína, 
dissolver em etanol e completar o volume com o mesmo solven-
te para 100mL.
Solução de hidróxido de sódio 0,1 N. Pesar 4,10g de NaOH, 
dissolver em água destilada e completar o volume para 1000mL. 
Padronizar a solução com ácido oxálico (veja anexo) e determi-
nar o fator da padronização (fpb).
Observações
a. No caso de se desejar analisar uma fruta oleaginosa, como 
coco ou abacate por exemplo, a acidez titulável é decorrente 
principalmente dos ácidos graxos livres, os quais são lipos-
solúveis, portanto a sua extração deve ser feita com etanol.
b. Embora a metodologia descrita anteriormente, refira-se a 
limão ou laranja, a mesma pode ser empregada para qual-
quer fruta. No entanto, quando se tratar de uma fruta menos 
suculenta do que o limão ou laranja, a exemplo do mamão, 
no preparo do suco são necessárias algumas modificações, 
conforme descritas a seguir.
1. Descascar a fruta e macerar a polpa em um almofariz;
2. Centrifugar uma alíquota de cerca de 100g da polpa, por 
meia hora a 3000rpm;
3. Recolher o sobrenadante e filtrar em papel de filtro, com 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 139
sistema a vácuo.
4. Recolher uma alíquota de 10mL do filtrado e titular con-
forme descrito anteriormente.
5. Padronização da solução de hidróxido de sódio. A de-
terminação da acidez titulável em suco de frutas é rea-
lizada usualmente com solução de hidróxido de sódio 
0,1 N. Neste caso, para se realizar a análise com preci-
são, é necessário que a solução de hidróxido de sódio 
seja padronizada previamente, haja vista que tal base 
não é um padrão primário. A padronização de solução 
de hidróxido de sódio é feita com solução padrão de áci-
do oxálico 0,1 N.
V. BiBliogrAfiA 
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Análises bioquímicas e fisico-
químicas em pós-colheita. In: OLIVEIRA, S.M.A. de et al (editores). 
Patologia pós-colheita: frutas, olerícolas e ornamentais tropicais. 
Brasília-DF: EMBRAPA, 2006, p. 443-472.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
140 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção do ph 
em suCo de frutAs
i. proCedimento AnAlítiCo 
1. Espremer a fruta e recolher o suco em um béquer, filtrando o 
mesmo em tecido de náilon de malha fina;
2. Pipetar 10mL do suco para um recipiente estreito, como um 
tubo de ensaio ou frasco com cerca de 2 a 2,5cm de diâmetro;
3. Introduzir no frasco, o eletrodo do peagâmetro previamente 
calibrado com soluções tampão 4,0 e 7,0;
4. Agitar suavemente, observar no mostrador do aparelho o va-
lor do pH e anotar o valor.
Observação
Alguns aparelhos já possuem dispositivo para a compensa-
ção automática da temperatura, a qual é convencionalmente ex-
pressa a 25°C. Caso o peagâmetro utilizado não disponha desse 
recurso, utilize uma tabela para proceder tal correção.
26
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto| 141
ii. BiBliogrAfiA 
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Análises bioquímicas e fisico-
químicas em pós-colheita. In: OLIVEIRA, S.M.A. de et al (editores). 
Patologia pós-colheita: frutas, olerícolas e ornamentais tropicais. 
Brasília-DF: EMBRAPA, 2006, p. 443-472.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
142 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de sst 
em suCo de frutAs
i. introdução
A determinação do teor de sólidos solúveis totais (SST) tem 
sido tradicionalmente realizada com o emprego de densímetros 
ou aerômetros, nas análises de caldo de cana-de-açúcar, álcool, 
vinagre, etc. Os resultados obtidos desta análise são expressos 
em graus Brix ou percentagem do soluto empregado na calibra-
ção. Para trabalhos de campo, em análise de caldo de cana-de-
açúcar, os refratômetros manuais têm sido bastante emprega-
dos, os quais também expressam os resultados em graus Brix 
e corresponde a percentagem da sacarose, soluto predominan-
te no caldo de cana, e portanto empregado na calibração dos 
mesmos. A tecnologia de fabricação dos refratômetros evoluiu 
bastante, de forma que já se encontram facilmente no comércio, 
refratômetros portáteis digitais. 
Os refratômetros têm sido amplamente empregados para 
determinar SST no suco de diversas frutas, como uma variá-
vel auxiliar na identificação do ponto de colheita das mesmas. 
A determinação refratométrica dos SST é bastante prática, haja 
vista que consta apenas em se colocar uma ou duas gotas do 
suco da fruta, ou caldo de cana, em um compartimento apro-
27
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 143
priado do instrumento, fechar o mesmo e fazer a leitura dire-
tamente no mostrador. Não se dispondo de tal equipamento, 
pode se determinar o teor de SST gravimetricamente.
ii. mArChA AnAlítiCA pArA determinAção 
de sst em suCo de limão ou lArAnjA por 
grAVimetriA
1. Espremer a fruta e filtrar o suco em papel de filtro;
2. Com o auxílio de uma pipeta volumétrica, pipetar 20mL do 
suco para um pesa-filtro previamente seco e tarado;
3. Colocar o pesa-filtro (aberto) em uma estufa com circulação 
de ar, regulada para 80°C, e manter por duas horas;
4. Após este período, regular a estufa para 105°C e manter o 
aquecimento por mais uma hora;
5. Ainda na estufa, tampar o pesa-filtro, transferir o mesmo 
para um dessecador, deixar esfriar por 20 minutos e pesá-lo;
6. Calcular a percentagem de SST conforme a equação 
seguinte:
 
SST = sólidos solúveis totais (em percentagem)
PPF + PSS = peso do pesa-filtro mais peso dos sólidos solúveis 
(em gramas)
TPF = tara do pesa-filtro (em gramas)
SST = (PPF + PSS) - TPFVa
x100
144 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Va = volume do suco (em mL)
100 = constante da percentagem
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Análises bioquímicas e fisico-
químicas em pós-colheita. In: OLIVEIRA, S.M.A. de et al (editores). 
Patologia pós-colheita: frutas, olerícolas e ornamentais tropicais. 
Brasília-DF: EMBRAPA, 2006, p. 443-472.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
OHLWEILER,O.A. Química analítica quantitativa. vol.2. Rio de 
Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1988. 226p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 145
determinAção 
de VitAminA C 
em suCo de frutAs
método de tillmAns
i. introdução
A vitamina C, além de sua conhecida propriedade de au-
mentar a resistência do organismo às infecções, ajuda ao cres-
cimento e é um fator de regeneração e formação do sangue. 
Também é importante para a saúde dos dentes e das gengivas. 
Encontra-se em verduras e legumes, mas principalmente nos 
frutos ácidos como o caju, uva, limão e laranja. Atualmente, 
sabe-se que a acerola é um fruto bastante rico nessa vitamina, 
contendo dezenas de vezes mais vitamina C do que qualquer 
das frutas citadas acima.
Quimicamente, a vitamina C é o ácido ascórbico, o qual se 
comporta como um composto bastante instável. Por oxidação, 
facilmente se converte em ácido desidroascórbico (Figura 4), 
propriedade esta que dificulta sua análise química. 
28
146 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
 
Figura 4. Fórmulas estruturais dos ácidos L-ascórbico e L-desidroascórbico.
A vitamina C pode ser analisada em suco de frutas pelo mé-
todo de Tillmans (Bezerra Neto e Barreto, 2004), o qual consta 
da titulação do ácido ascórbico presente no suco da fruta, utili-
zando uma solução de 2,6-diclorofenol-indofenol, previamente 
padronizada com uma solução de ácido ascórbico. O método 
de Tillmans está descrito a seguir, modificado no sentido de se 
usar solução de ácido oxálico como solvente e estabilizador da 
vitamina C, em substituição ao ácido metafosfórico, tradicio-
nalmente utilizado neste método (Instituto Adolfo Lutz, 2008).
ii. mArChA AnAlítiCA
a. Preparo do suco da fruta. Extrair o suco da fruta a ser ana-
lisada e filtrar em tecido de náilon de malha fina. Pipetar três 
alíquotas de 5mL da solução de ácido oxálico para erlenmeyers 
HO
OH OH
HO
HO HO
H H
O O
H H
H H
H H
C C
C C
C C
C C
C C
C C
- H2
O O
O
O
ácido
L-ascórbico
ácido
L-deidroascórbico
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 147
de 50mL, e em seguida, adicionar a cada erlenmeyer, 2mL do 
suco da fruta.
b. Padronização do diclorofenol indofenol. Encher uma bureta 
de cor âmbar com a solução de diclorofenol indofenol e, em 
seguida, zerá-la. Pipetar 5mL da solução de ácido oxálico para 
um erlenmeyer de 50mL, adicionar 2mL da solução de ácido 
ascórbico e titular com a solução de diclorofenol indofenol. 
O ponto final desta titulação é reconhecido com a mudança de 
cor para o rosa claro, e a persistência desta cor por um a dois 
segundos. Após padronizar o diclorofenol indofenol, proceder 
à prova em branco. Para isto, transferir 5mL da solução de áci-
do oxálico para erlenmeyer de 50mL, adicionar 2mL de água 
destilada e titular com a solução de diclorofenol indofenol. Esta 
operação deve ser efetuada com três repetições, e em seguida 
calcular a média aritmética dos valores gastos nas titulações. 
c. Titulação da amostra. Titular as amostras referidas no item a, 
com a solução de diclorofenol indofenol. O ponto final da titu-
lação da amostra é reconhecido com o surgimento da cor rosa 
claro e a persistência desta cor, não mais retornando para in-
color. Na análise de frutas como laranja e limão por exemplo, 
pode ser feita a titulação do suco da fruta sem necessitar de di-
luição. Já no caso da acerola, a qual contém bastante vitamina 
C, recomenda-se que seja feita uma diluição de 100 vezes.
148 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iii. prepAro dos reAgentes
a. Ácido Oxálico 1,6% em ácido acético. Pesar 8,0g de ácido oxá-
lico, dissolver em um béquer contendo 200mL de água desti-
lada e 40mL de ácido acético glacial. Completar o volume para 
500mL e guardar em frasco apropriado.
b. Solução padrão de indofenol. Dissolver 0,042g de bicarbo-
nato de sódio em 50mL de água destilada e adicionar 50mg 
de 2,6-diclorofenol indofenol (sal dissódico). Agitar vigorosa-
mente e, em seguida, completar o volume para 200mL com 
água destilada. Filtrar a solução, guardá-la em frasco escuro, 
hermeticamente fechado e sob refrigeração. Recomenda-se 
que antes do preparo desta solução, o diclorofenol indofenol 
na forma cristalizada seja mantido por pelo menos duas horas 
em um dessecador contendo um agente higroscópico bastante 
ativo.
c. Solução padrão de ácido ascórbico(1000mg.L-1). Pesar exata-
mente 100mg de ácido ascórbico (P.A.), transferir para um ba-
lão volumétrico de 100mL e completar o volume com a solução 
do ácido estabilizante (ácido oxálico) utilizado no preparo do 
suco da fruta a ser analisada. Imediatamente após o preparo 
desta solução, manter a mesma ao abrigo da luz e padronizar 
a solução de indofenol, conforme descrito acima.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 149
iV. CálCulos
Adotando-se as condições de trabalho acima descritas, isto 
é, utilizando o mesmo volume (2,0mL por exemplo) de áci-
do ascórbico na padronização do indofenol, e da amostra (suco 
da fruta por exemplo), o teor de vitamina C pode ser calculado 
pela seguinte fórmula:
 
Onde:
 C = mg de ácido ascórbico/100mL do suco da fruta.
Via = volume de indofenol gasto na titulação da amostra.
Vib = volume de indofenol gasto na prova em branco.
Vip = volume de indofenol gasto na padronização do mesmo.
V. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise 
de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
C = x 100Via - VibVip
150 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de fenÓis totAis
método do Azul dA prússiA
i. introdução
Taninos são compostos do metabolismo secundário dos 
vegetais, de natureza fenólica, e que precipitam ao interagir 
com proteínas. Como resultante desta propriedade, os tani-
nos proporcionam o sabor adstringente, e quando em eleva-
da concentração diminui a digestibilidade dos alimentos. Há 
muito tempo os taninos têm sido empregados no curtume de 
couro, atividade esta explorada industrialmente e que gera 
divisas para o Brasil. Os taninos também são empregados 
com fins medicinais, além do emprego como fixadores de co-
rantes e anticorrosivo na indústria naval. Existem dois tipos 
de taninos, os taninos condensados (proantocianidinas) e os 
taninos hidrolisáveis (galotaninos e elagitaninos). 
Do ponto de vista agronômico, as principais vantagens 
do tanino são: barreira para herbívoros (ex: ataques de pás-
saros em sorgo), resistência a fungos causadores da podridão 
no grão antes da colheita (ex.: sorgo) e resistência a insetos. 
A principal desvantagem do tanino na alimentação animal 
é o seu efeito antinutricional, causado pelo complexo tani-
no-proteína, que quando em elevada concentração diminui 
29
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 151
a digestibilidade das forragens. Existem diversos métodos 
para se quantificar taninos, no entanto, nenhum deles pode 
ser considerado completamente satisfatório. Segundo Ma-
galhães et al. (1997), o método de Folin-Denis superestima a 
quantidade de taninos, enquanto que o método do azul da 
Prússia é o que apresenta melhor correlação com o desem-
penho de aves que se alimentam com ração rica em taninos. 
Ambos quantificam fenóis totais e se usam o ácido tânico 
como padrão por tratar-se do tanino mais representativo 
do grupo. O método do azul da Prússia se baseia na reação 
de óxido-redução entre os compostos fenólicos e íons ferro. 
Grupos hidroxifenólicos reduzem íons Fe3+ a Fe2+, os quais 
são complexados com ferricianeto, produzindo pigmentos 
de coloração azul. 
ii. mArChA AnAlítiCA
Preparo do extrato: casca de madeira 
1. Pesar 0,5g da amostra e transferir para um erlenmeyer de 
125mL; 
2. Adicionar 10mL de HCl a 1% em metanol e tampar;
3. Agitar suavemente em mesa agitadora por 20 minutos; 
4. Centrifugar a 1.000rpm, durante dez minutos, ou filtrar em 
papel de filtro qualitativo;
5. Guardar em refrigerador até o momento da análise.
152 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Preparo do extrato: folhas frescas
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, 
com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura 
central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca de 
3 a 5 mm.
2. Pesar 500 mg das amostras de folhas e transferir para um 
tubo de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5 mL de etanol a 80 % e triturar em um homoge-
neizador de tecido vegetal.
4. Filtrar, transferindo quantitativamente para um balão volu-
métrico de 25 mL, usando uma tela de náilon de malha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5 mL do mesmo solvente e transferir, sob filtração, o ma-
terial para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em seguida 
completar o volume do balão volumétrico com o mesmo sol-
vente.
7. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
Preparo do extrato: amostra pré-seca
1. Pesar 0,250 g de amostra pré-seca e transferir para um erlen-
meyer de 125 mL;
2. Adicionar 20 mL de etanol* a 80 %;
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 153
3. Agitar por 30 minutos e em seguida filtrar em tecido de nái-
lon de malha fina;
4. Completar o volume do filtrado para 50 mL com água desti-
lada;
5. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
*OBS.: Este extrato também pode ser usado para a determina-
ção de sacarose, proteínas solúveis e aminoácidos livres totais. 
Embora a água destilada seja um bom solvente para a extração 
dos fenóis totais, é recomendado usar etanol a 70 ou 80 % por 
duas razões: o etanol auxilia a quebrar a tensão superficial faci-
litando uma melhor interação do solvente com a amostra, além 
de propiciar uma melhor conservação do extrato, evitando o 
desenvolvimento de microorganismos.
Desenvolvimento da cor. 
1. Pipetar 2mL de água destilada para tubos de ensaio devida-
mente identificados para receber os padrões e amostras;
2. Acrescentar 1mL de cloreto férrico (FeCl3) 50mM e agitar su-
avemente o tubo de ensaio por 10 segundos;
3. Imediatamente acrescentar 1mL de ferricianeto de potássio, 
agitar suavemente o tubo de ensaio e deixar em repouso por 
exatamente 20 minutos a partir da adição do cloreto férrico.
154 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
4. Efetuar a leitura espectrofotométrica a 720nm.
5. Calcular o teor de tanino nas amostras por comparação com 
as leituras de soluções padrões de ácido tânico.
OBS.: Exatamente 30 segundos após a adição do cloreto férrico 
ao primeiro tubo de ensaio, proceder da mesma forma com o se-
gundo tubo de ensaio, assim sucessivamente, de forma que an-
tes de atingir o tempo necessário para efetuar as leituras espec-
trofotométricas (20 minutos), é possível promover a reação em 
40 tubos de ensaio, incluindo padrões de trabalho e amostras.
iii. prepAro dos reAgentes
Ácido clorídrico a 1% em metanol. Pipetar para um balão 
volumétrico de 1.000mL, 27mL de HCl conc. (d = 1,19 g.mL-1) e 
completar o volume com metanol (P.A.).
Solução estoque de ácido tânico (1000mg.L-1). Pesar 100mg 
de ácido tânico, dissolver em HCl a 1% em metanol, e completar 
o volume para 100mL.
Padrões de trabalho de ácido tânico. Pipetar separadamen-
te 0,25; 0,50; 1,00 e 2,00mL da solução estoque de ácido tânico 
(1000mg.L-1) e completar o volume para 10mL com solução de 
HCl a 1% em metanol, obtendo-se respectivamente 25, 50, 100 
e 200mg.L-1 de ácido tânico. O branco (padrão zero) corresponde 
à solução de HCl a 1% em metanol.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 155
Cloreto férrico (FeCl3) 50 mM. Calcinar FeCl3.6H2O a 200°C, 
por 3 horas. Em seguida levar a um dessecador e após15 minu-
tos, pesar 0,6488g, dissolver com água destilada e completar o 
volume para 500mL.
Ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] 8mM. Pesar 1,3170g 
de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6], dissolver com água 
destilada e completar o volume para 500mL.
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
MAGALHÃES, P.C.; RODRIGUES, W. A.; DURÃES, F.O.M. Tanino 
no grão de sorgo: bases fisiológicas e métodos de determinação. Sete 
Lagoas: EMBRAPA-CNPMS, 1997. 26p. (EMBRAPA-CNPMS. Circular 
técnica, 27).
156 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de fenÓis 
totAis e tAninos
método de folin-denis
i. introdução
Os compostos fenólicos são enquadrados como compostos 
do metabolismo secundário, e podem ser subdivididos em três 
grupos: flavonóides, ácido salicílico e taninos. É importante res-
saltar que a lignina é um composto de natureza fenólica, porém 
não faz parte dos compostos do metabolismo secundário, haja 
vista sua participação como componente da parede celular, o 
que lhe confere a função estrutural. Os taninos são compostos 
do metabolismo secundário dos vegetais, de natureza fenólica, 
e que precipitam ao interagir com proteínas. Como resultante 
desta propriedade, os taninos proporcionam o sabor adstrin-
gente, característico de certos frutos verdosos, como caju, ta-
marindo, uva, banana, etc. Compostos fenólicos simples como 
ácido hidroxi-cinâmico, catequinas e antocianinas não causam 
o sabor adstringente, enquanto que dímeros de flavanas apre-
sentam esta característica (Van Buren, 1971).
Admite-se que os taninos são produzidos pelas plantas como 
um mecanismo de defesa, contra ataque de pragas e doenças. A 
30
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 157
síntese de fitoalexinas bem como a síntese de taninos também 
são consideradas como modalidades de RAS (Resistência Sistê-
mica Adquirida). O acúmulo de compostos fenólicos tem sido 
constatado, atuando diretamente na inibição de crescimento de 
fungo, criando ambiente fitotóxico, em raízes de tomateiro tra-
tado com quitosana (Benhamou et al., 1994). 
Quimicamente existem dois tipos de taninos: os taninos con-
densados (flavolanas) e os taninos hidrolisáveis (galotaninos e 
elagitaninos). Alguns autores consideram os taninos como poli-
fenóis, outros preferem considerá-los como compostos oligomé-
ricos com múltiplas unidades que apresentam grupos fenólicos 
livres e peso molecular variando entre 500 e 20.000 Daltons. São 
solúveis em água, com exceção de algumas estruturas de eleva-
do peso molecular. Os mesmos são componentes dos extrativos 
da madeira, que em algumas árvores podem ser extraídos e co-
mercializados como uma boa fonte de renda, destacando-se seu 
emprego na indústria de curtume de couro. Os taninos também 
têm aplicação medicinal, na produção de fitoterápicos. A seguir 
são citadas algumas espécies arbóreas que apresentam um con-
teúdo relativamente elevado de taninos: barbatimão (Stryphno-
dendro adestringens (Mart.) Coville), acácia negra (Acacia mearnsii 
De Wild.), angico verdadeiro (Piptadenia rigida Benth.), angico 
vermelho (Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan.), mangue 
branco (Laguncularia racemosa L.), canafístula (Senna ferruginea 
Schrad.), goiabeira (Psidium guajava L.), jurema preta (Mimosa 
158 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
hostilis Benth.), etc. A principal desvantagem do tanino na ali-
mentação animal é o seu efeito antinutricional, causado pelo 
complexo tanino-proteína, que quando em elevada concentra-
ção diminui a digestibilidade das forragens.
Existem vários métodos para a determinação de taninos e 
fenóis totais em tecidos vegetais, porém, todos eles têm suas 
limitações (Magalhães et al., 1997). O método de Folin-Denis é 
um método colorimétrico que determina fenóis totais (Horwitz, 
1980). Tal método baseia-se na redução em meio alcalino do fos-
fomolibdato-fosfotungstato pelos fenóis, a molibdênio, o que 
proporciona o desenvolvimento da coloração azul. O método de 
Folin-Denis também pode ser empregado para se determinar o 
teor de taninos em amostras vegetais. Para isto, determina-se 
primeiro o teor de fenóis totais no extrato vegetal, e em seguida 
procede-se à precipitação dos taninos com o uso de proteína ou 
PVP. Após a precipitação dos taninos presentes no extrato vege-
tal, determina-se no sobrenadante o teor de fenóis não tânicos, 
e por diferença calcula-se o teor de taninos.
ii. mArChA AnAlítiCA
 Preparo de extrato: casca de madeira
a. Cortar em placa de Petri uma amostra de casca de árvore 
(goiabeira, por exemplo) em fragmentos de cerca de 2mm;
b. Pesar 0,2g da amostra, transferir para um erlenmeyer de 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 159
50mL e acrescentar 20mL de etanol a 80%;
c. Fechar o erlenmeyer e colocar para agitar por 30 minutos;
d. Filtrar para um balão volumétrico de 50mL e lavar o resíduo 
com água destilada;
e. Completar o volume do balão volumétrico, homogeneizar o 
extrato e transferir para um frasco rosqueável;
f. Colocar uma identificação no frasco e manter sob refrigeração 
até o momento do desenvolvimento da cor.
Preparo do extrato: folhas frescas
1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, 
com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura 
central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca de 
3 a 5 mm.
2. Pesar 500 mg das amostras de folhas e transferir para um 
tubo de ensaio de tamanho grande e paredes grossas.
3. Adicionar 5 mL de etanol a 80 % e triturar em um homoge-
neizador de tecido vegetal.
4. Filtrar, transferindo quantitativamente para um balão volu-
métrico de 25 mL, usando uma tela de náilon de malha fina.
5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando 
mais 5 mL do mesmo solvente e transferir, sob filtração, o ma-
terial para o balão volumétrico.
6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em seguida com-
pletar o volume do balão volumétrico com o mesmo solvente.
160 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
7. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
Preparo do extrato: amostra pré-seca
1. Pesar 0,250 g de amostra pré-seca e transferir para um erlen-
meyer de 125 mL;
2. Adicionar 20 mL de etanol* a 80 %;
3. Agitar por 30 minutos e em seguida filtrar em tecido de nái-
lon de malha fina;
4. Completar o volume do filtrado para 50 mL com água des-
tilada;
5. Homogeneizar, transferir o extrato para um recipiente ade-
quado, identificar e guardar em refrigerador até o momento 
da análise química.
*OBS.: Este extrato também pode ser usado para a determina-
ção de sacarose, proteínas solúveis e aminoácidos livres totais. 
Embora a água destilada seja um bom solvente para a extração 
dos fenóis totais, é recomendado usar etanol a 70 ou 80 % por 
duas razões: o etanol auxilia a quebrar a tensão superficial faci-
litando uma melhor interação do solvente com a amostra, além 
de propiciar uma melhor conservação do extrato, evitando o 
desenvolvimento de microorganismos.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 161
Precipitação dos taninos 
a. Pipetar para um tubo de ensiao 1,0mL do extrato vegetal;
b. Acrescentar cerca de 50mg de caseína (ou PVP), fechar o tubo 
de ensaio e agitar vigorosamente por cerca de um minuto;
c. Deixar em repouso por 24 horas em refrigerador;
d. No dia seguinte, centrifugar por 10 minutos a 2000g e em 
seguida proceder o desenvolvimento da cor.
 Desenvolvimento dacor
a. Pipetar para tubos de ensaio 0,2mL do extrato ou solução pa-
drão de ácido tânico;
b. Acrescentar 5mL de água destilada;
c. Acrescentar 1,0mL da solução saturada de carbonato de 
sódio;
d. Acrescentar 0,5mL do reagente de Folin-Denis;
e. Agitar suavemente e deixar em repouso por 30 minutos;
f. Realizar a leitura espectrofotométrica a 760nm.
g. Realizar os cálculos, com base na curva padrão de ácido tâni-
co e expressar os resultados em termos de mg de taninos por 
grama de material analisado.
iii. prepAro dos reAgentes
Reagente de Folin-Denis. Transferir 380mL de água des-
tilada para um béquer, acrescentar 50g de tungstato de sódio 
162 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
(Na2WO4.2H2O), 10g de ácido fosfomolíbdico e 25mL de ácido 
fosfórico. Colocar para refluxar por duas horas e completar o 
volume para 500mL com água destilada. Esta solução tem vali-
dade de um mês.
Solução saturada de carbonato de sódio. Pesar 35g de car-
bonato de sódio (Na2CO3), dissolver em 100mL de água destila-
da a quente. Deixar esfriar, provocar precipitação com cristais 
de carbonato de sódio e em seguida filtrar.
Solução padrão de ácido tânico (solução estoque 2,5g.L-1). 
Pesar 0,500g de ácido tânico, dissolver em água destilada e 
completar o volume para 200mL. Preparar soluções padrões 
novas a cada determinação.
Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétri-
cos de 100mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de ácido tânico 
(2,5g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este 
procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de ácido 
tânico nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L-1. 
O padrão zero corresponde à água deionizada.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 163
iV. BiBliogrAfiA
HORWITZ, W. Official methods of analysis of the association 
of official analytical chemists. Association of Official Analytical 
Chemists. 13ª ed. Washinton, 1980. 1018p.
MAGALHÃES, P.C.; RODRIGUES, W. A.; DURÃES, F.O.M. Tanino 
no grão de sorgo: bases fisiológicas e métodos de determinação. Sete 
Lagoas: EMBRAPA-CNPMS, 1997. 26p. (EMBRAPA-CNPMS. Circular 
técnica, 27).
VAN BUREN, J. Fruit Phenolics. In: HULME, A.C. The biochemistry 
of fruits and their products. v. 1, p. 269-304. London: Academic 
Press. 1971. 
164 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de CArBono 
orgâniCo totAl
em teCido VegetAl
i. introdução
Em estudos de ciclagem do carbono na natureza é neces-
sário se conhecer uma metodologia para determinação do 
carbono em tecidos vegetais. Em algumas situações, por li-
mitação dos laboratórios, o teor de carbono é estimado por 
meio do uso de fatores de conversão, que são multiplicados 
pelo teor de matéria orgânica. No entanto, é importante sa-
lientar que o teor de carbono na matéria orgânica varia com 
a natureza da mesma, isto é, de sua composição química. A 
depender da predominância de um determinado composto 
ou outro na matéria orgânica, um dado fator de conversão 
pode se tornar inviável. Por exemplo, o fator de conversão 
com base na fórmula molecular da glucose, celulose e ácido 
oxálico é respectivamente 2,25; 2,50 e 3,75.
O método descrito a seguir baseia-se na oxidação da ma-
téria orgânica em presença de ácido sulfúrico e dicromato de 
potássio, e posterior dosagem, por titulação, do excesso de 
dicromato, com solução padrão de sulfato ferroso amoniacal. 
31
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 165
O carbono da matéria orgânica é oxidado a CO2 enquanto que 
o cromo é reduzido de Cr+6 para Cr+3.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Pesar 0,1g da amostra vegetal pré-seca e transferir para um 
erlenmeyer de 500mL;
2. Adicionar 20mL* de dicromato de potássio 1 N e em seguida 
40mL de ácido sulfúrico concentrado;
3. Tampar o erlenmeyer com vidro de relógio, aquecer por cinco 
minutos em fervura branda, em seguida agitar suavemente 
por um minuto e deixar em repouso por 30 minutos;
4. Adicionar 200mL de água destilada, em seguida 10mL de áci-
do fosfórico concentrado e 1mL de difenilamina;
5. Titular o excesso do oxidante com solução de sulfato ferroso 
amoniacal 0,5 N, até viragem da cor púrpura para verde.
* OBS.: Usar pipeta de alta precisão, tipo volumétrica.
iii. CálCulos
Cada mililitro de dicromato de potássio 1 N reduzido equi-
vale a 3mg de carbono oxidado. Com base nesta estequiometria 
e na quantidade de amostra pesada, calcula-se a percentagem 
de carbono na amostra pré-seca que deve posteriormente ser 
corrigida para a matéria seca absoluta.
166 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
EXEMPLO: Admitindo que se pesou 200mg de uma amostra 
pré-seca, com 10% de umidade, e que esta foi oxidada em um 
erlenmeyer com 20mL de dicromato de potássio 1 N. Após a 
oxidação da matéria orgânica, titulou-se o excesso de dicro-
mato gastando-se 5,2mL de sulfato ferroso amoniacal 0,5 N. 
Calcular a percentagem de carbono total na matéria seca da 
amostra referida.
Como o excesso de dicromato foi titulado com sulfato fer-
roso amoniacal a 0,5 N e não a 1,0 N, deve-se primeiramente 
dividir por 2 o volume desse reagente gasto na titulação, assim 
5,6mL/2 é igual a 2,6mL.
Dicromato de potássio consumido na oxidação: 
20,0 mL - 2,6 mL = 17,4 mL
Quantidade total de carbono na amostra: 
3mg x 17,4mL = 52,2mg
Percentagem de C na amostra pré-seca: 
200mg (amostra) ------- 52,2mg de C
100 (de % ) -------------- X
X = =26,1% de C na amostra pré-seca.100x52,2
200
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 167
Percentagem de matéria seca da amostra: 
100% - % de umidade
100% - 10% = 90 %
Percentagem de C na matéria seca:
90% de MS ------------ 26,1% de C
100% de MS ----------- Y
 
Y = = 29,00% de C na matéria seca.
iV. reAgentes
Dicromato de potássio 1 N. Pesar 49,04g de dicromato de 
potássio (K2Cr2O7), previamente seco em estufa regulada a 
120°C por 2 horas, dissolver em água destilada e completar o 
volume para um litro. Este reagente deve ser P.A.
Ácido fosfórico a 85%. Corresponde ao ácido ortofosfóri-
co concentrado (H3PO4);
Difenilamina. Pesar 0,5g de difenilamina e dissolver em 
20mL de água destilada, em seguida acrescentar 100mL de 
ácido sulfúrico concentrado;
Sulfato ferroso amoniacal 0,5 N. Dissolver 196,05g de sul-
fato ferroso amoniacal [Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O] em 500mL de 
água destilada, acrescentar 7,5mL de ácido sulfúrico concen-
trado e completar o volume para um litro. Este reagente deve 
ser recém preparado. Recomenda-se padronizar previamente 
100x26,1
90
168 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
esta solução com a solução de dicromato de potássio de mes-
ma normalidade.
V. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
MENDONÇA, E.S.; MATOS, E. da S. Matéria orgânica do solo: 
métodos de análises. Ponte Nova-MG: D&M Gráfica e Editora Ltda, 
2005. 107p.
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p. 
TEDESCO, M.J. Análises de solo, plantas e outros materiais. Porto 
Alegre: UFRS, 1995. 174p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 169
digestão nitro-perClÓriCA 
pArA Análise 
de elementos minerAis
i. introdução
A digestão nitro-perclórica é utilizada quando se deseja re-
alizar determinações analíticas da maioria dos nutrientes mi-
nerais presentes nas plantas (P, K, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn, etc.), 
excetuando os elementos N e Cl. Durante a digestão a matéria 
orgânica da amostra vegetal é oxidada com ácidosminerais 
concentrados sob aquecimento. As misturas de ácidos mine-
rais mais utilizadas são as seguintes: HNO3 + HClO4 (3:1 ou 5:1), 
HNO3 + HClO4 + H2SO4 (3:1:1) e HCl + HNO3 (3:1). A desvan-
tagem do uso do ácido sulfúrico refere-se à inviabilidade de 
se analisar Ca e S, pois o primeiro precipita como CaSO4 e o 
segundo é constituinte do H2SO4.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Pesar 0,5g da amostra pré-seca e transferir para um tubo 
digestor;
2. Adicionar ao tubo digestor 5mL de ácido nítrico concentrado 
32
170 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
e 1mL de ácido perclórico concentrado e deixar em repouso 
de um dia para o outro;
3. Colocar para aquecer em bloco digestor localizado em uma 
capela, obedecendo a seguinte seqüência de tempo e tempera-
tura: 1h a 80°C, 1h a 120°C, 1h a 150°C e 1h a 180°C;
4. Aguardar esfriar e transferir quantitativamente o digerido 
para um balão volumétrico de 50mL: com o auxílio de água 
deionizada e um bastão policial, lavar o tubo digestor pelo me-
nos três vezes, transferindo o líquido de lavagem para o balão 
volumétrico e em seguida completar o volume;
5. Transferir o extrato para frascos, proceder às análises recomen-
dadas ou guardar sob refrigeração para posterior análise.
OBSERVAÇÕES
1. Se ao final das três horas de aquecimento e posterior esfriamen-
to do material, se constatar que a amostra não foi perfeitamente 
digerida, isto é, não estiver de cor clara, esbranquiçada ou trans-
lúcida, adicionar cerca de 3mL de ácido nítrico e colocar para 
aquecer novamente por 1 hora a 180°C.
2. Alternativamente, pode se obter o volume final do extrato, 
com base na massa, isto é, por pesagem. Neste caso, transfere-
se quantitativamente o digerido para um frasco de polietileno 
previamente tarado. Com o auxílio de água deionizada e um 
bastão policial, lavar o tubo digestor pelo menos três vezes, 
transferindo o líquido de lavagem para o frasco até conseguir 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 171
cerca de 50mL de extrato. Em seguida pesar o frasco de plástico 
contendo o extrato vegetal, proceder às análises recomendadas 
ou guardar sob refrigeração para posterior análise. O fator de 
diluição da amostra será igual ao quociente entre o peso do ex-
trato (frasco + extrato - tara do frasco) e o peso da amostra.
iii. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do 
estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. Piracicaba: 
POTAFOS, 1989. 201p. 
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Avaliação de 
métodos com e sem digestão para extração de elementos em tecidos 
de plantas. Ciência e Cultura, v.36, n.11, p.1953-1958, 1984.
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química 
de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 
17p. (IAPAR. Circular, 74).
SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas. 
Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p.
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.
172 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção 
de fÓsforo
método ColorimétriCo 
do moliBdo-VAnAdAto
i. introdução
O fósforo é um macronutriente vegetal cuja concentração 
total em tecidos vegetais pode variar de 1 a 15g kg-1 da matéria 
seca. Sua determinação pode ser feita colorimetricamente pelo 
método do molibdo-vanadato, o qual apresenta uma sensibili-
dade relativamente boa na faixa de 0,1 a 20ppm. Este método 
sofre interferência do Fe2+ e Cl- quando em concentrações supe-
riores a 100ppm e 75ppm, respectivamente. 
A colorimetria baseia-se na comparação da intensidade de 
cor de soluções de concentrações desconhecidas (amostras), 
com a intensidade de cor de soluções padrões de um dado ele-
mento ou composto, responsável pela cor destas soluções. A 
intensidade de cor das soluções é medida em aparelhos deno-
minados colorímetros, cujos resultados das leituras (absorbân-
cia) são correlacionados com as concentrações do elemento ou 
composto em estudo, possibilitando o cálculo de sua concen-
tração nas soluções problemas.
33
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 173
A primeira etapa da análise de fósforo em tecido vegetal é 
a digestão da amostra, a qual pode ser feita por via úmida ou 
por via seca. Por via úmida, usa-se uma mistura de ácido ní-
trico com ácido perclórico e põe-se a amostra para aquecer por 
quatro horas. Por via seca, procede-se a calcinação da amostra, 
conforme descrito na determinação de cinzas (R.M.).
O extrato vegetal devidamente preparado apresenta-se 
como uma solução incolor. Para a sua análise por um método 
colorimétrico, faz-se necessário adicionar um reagente especí-
fico (molibdato de amônio mais vanadato de amônio), o qual 
reage com o fósforo formando um complexo de cor amarelada. 
A intensidade de cor formada é proporcional à concentração 
de fósforo e pode ser medida em um colorímetro e em seguida 
correlacionada com soluções padrões de fósforo.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, 1mL dos pa-
drões de fósforo (0; 25; 50; 75; 100 e 200mg.L-1) ou do extrato 
vegetal (nitro-perclórico ou das cinzas);
2. Acrescentar a cada tubo de ensaio, 5mL de água deioniza-
da e 2mL do reagente específico, formado pela mistura de 
volumes iguais de molibdato de amônio a 5% e vanadato de 
amônio a 0,25%;
3. Deixar em repouso por 5 minutos, fazer a leitura em colorí-
174 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
metro com filtro azul ou em espectrofotômetro a 470nm; 
4. Elaborar um gráfico, colocando no eixo x os valores dos pa-
drões de fósforo e no eixo y as leituras obtidas com os mes-
mos, e em seguida calcular a equação de regressão linear;
5. Calcular a concentração de fósforo na amostra vegetal e ex-
pressar os resultados em g kg-1. 
Observação: O colorímetro tipo Klett-Summerson fornece as 
leituras em unidades Kletts (u.k.), as quais equivalem a absor-
bância multiplicada pelo fator 500. 
iii. reAgentes
Molibdato de amônio ((NH4)6Mo7O24). Solução aquosa a 
5%. Pesar 26,55g do sal tetra hidratado, dissolver em água des-
tilada e completar o volume para 500mL.
Vanadato de amônio (NH4VO3). Solução a 0,25%. Pesar 
1,25g do sal e dissolver em cerca de 250mL de água destilada 
quente. Deixar esfriar e em seguida adicionar 175mL de ácido 
nítrico concentrado. Completar o volume para 500mL e guar-
dar em frasco escuro.
Solução padrão de fósforo. Preparar uma solução estoque 
contendo 1.000mg.L-1 de fósforo. Pesar 2,195g de fosfato mo-
nobásico de potássio (KH2PO4) seco em estufa, dissolver em 
150mL de água destilada e em seguida adicionar 5mL de ácido 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 175
sulfúrico 10 N. Completar o volume para 500mL com água des-
tilada e guardar em frasco escuro.
Padrões de trabalho (curva padrão). Pipetar para balões 
volumétricos, de 100mL, separadamente, 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 
20,0mL da solução estoque de fósforo (1.000mg.L-1). Adicionar 
cerca de 50mL de água destilada e em seguida 4,0mL de ácido 
sulfúrico 10 N. Completar o volume e transferir para frascos 
apropriados. As soluções preparadas conforme descritas acima 
contêm respectivamente 25, 50, 75, 100 e 200mg.L-1 de fósforo. 
O padrão zero é preparado de forma semelhante aos demais, 
porém sem a adição da solução estoque de fósforo.
176 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife:Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do 
estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. Piracicaba: 
POTAFOS, 1989. 201p.
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química 
de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 
17p. (IAPAR. Circular, 74).
SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas. 
Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p.
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 177
determinAção 
de enxofre
método turBidimétriCo 
do sulfAto de Bário
i. introdução
O enxofre é um macronutriente vegetal constituinte dos 
aminoácidos cisteína, cistina e metionina e portanto das pro-
teínas. Desse modo, em condições de deficiência de enxofre a 
síntese de proteína é inibida, levando à queda na produtivi-
dade das culturas.
O teor de enxofre nas plantas varia de 1 a 15g kg-1 da ma-
téria seca. Para cafeeiro, cana-de-açúcar e pessegueiro, teores 
da ordem de 2g kg-1 na matéria seca são considerados adequa-
dos. Por outro lado, o milho, a soja e tomateiro exigem 3g kg-1 
de S na matéria seca.
A determinação turbidimétrica do enxofre fundamenta-se 
na turbidez produzida pela reação do enxofre com o cloreto 
de bário, formando sulfato de bário. Esta turbidez pode ser 
medida em colorímetro ou espectrofotômetro na forma de 
transmitância ou absorbância.
34
178 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. mArChA AnAlítiCA
a. Obtenção da curva-padrão
1. Em tubo de ensaio de 10mL adicionar 2mL das soluções-pa-
drão de enxofre (0, 10, 15, 20, 25, 30, 40 e 50mg.L-1 de S).
2. Adicionar 0,2mL da solução de HCl 6N contendo 20mg.L-1 
de S.
3. Juntar cerca de 100mg de cristais de BaCl2.2H2O finamente 
moído e deixar em repouso por 1 minuto.
4. Agitar durante 30 segundos, dissolvendo os cristais, e fazer a 
leitura em até 8 minutos após a adição do cloreto de bário, em 
espectrofotômetro a 420nm.
b. No extrato vegetal 
1. Transferir 2mL do extrato nítrico-perclórico para tubo de en-
saio de 10mL e em seguida proceder conforme descrito para 
a obtenção da curva-padrão.
2. Calcular a concentração de enxofre na amostra preparada, 
expressando o resultado em grama por quilograma.
iii. prepAro dos reAgentes
Solução-estoque de enxofre (contendo 1.000mg.L-1 de S). 
Pesar 5,434g de K2SO4 P.A , seco em estufa, dissolver em água 
deionizada e completar o volume para 1.000mL.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 179
Soluções-padrão de enxofre. Pipetar para balões volumé-
tricos de 100mL, separadamente, 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0 ; 4,0 e 
5,0mL da solução-estoque de enxofre (1.000mg.L-1), e em segui-
da completar o volume com água deionizada. O branco (padrão 
zero) corresponde à água deionizada.
Solução de HCl 6N contendo 20mg.L-1 de S. Adicionar em 
um béquer de 1.000mL, 200mL de água destilada, 500mL de 
HCl P.A (d= 1,19g.L-1) e 0,1087g de K2SO4 P.A., previamente seco 
em estufa. Agitar até dissolver o sulfato de potássio, transferir 
para um balão volumétrico de 1000mL e completar o volume 
com água destilada.
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do 
estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. Piracicaba: 
POTAFOS, 1989. 201p. 
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.
180 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção 
de Cloreto
método de mohr
i. introdução
O cloro é um micronutriente dos vegetais superiores en-
contrado em abundância nas águas dos oceanos e mares, as-
sim como em solos salinos. É componente fundamental dos 
fertilizantes cloreto de potássio e cloreto de amônio. Nas 
plantas, esse micronutriente participa da fotossíntese atu-
ando sobre a fotólise da água, e também do processo de os-
morregulação. Seu conteúdo nos vegetais varia em função de 
diversos fatores, principalmente do meio onde as plantas são 
cultivadas. De um modo geral, pode se considerar como 
teores adequados para a maioria das culturas, de 340 a 
1200mg.kg-1 de matéria seca. Vários são os métodos empre-
gados para se analisar o íon cloreto. O método descrito neste 
capítulo consta de uma extração com água quente, partindo 
de uma amostra pré-seca, e posterior quantificação pelo méto-
do volumétrico de Mohr.
35
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 181
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Pesar 1,0g da amostra pré-seca;
2. Transferir para um erlenmeyer de 50mL;
3. Adicionar 25mL de água deionizada e tampar o mesmo;
4. Colocar para aquecer a 90°C por 20 minutos;
5. Deixar esfriar e filtrar em tecido de náilon de malha fina;
6. Pipetar uma alíquota de 10mL do extrato obtido acima, para 
um erlenmeyer de 50mL;
7. Adicionar 1mL de cromato de potássio a 5%;
8. Titular com solução padronizada de nitrato de prata 0,025 N.
Observações
1. Estequiometricamente, 1,0mL de nitrato de prata 0,025 N 
equivale a 0,8863mg de cloreto.
2. Veja exercício proposto no ANEXO IV. 
iii. reAgentes
Solução de nitrato de prata 0,025 N. Pesar 4,2468g de nitrato 
de prata (P.A.), dissolver em água destilada, completar o volu-
me para um litro e em seguida padronizar a mesma, titulando 
com uma solução padrão de cloreto de sódio 0,05 N. Guardar 
em frasco escuro.
Solução de cromato de potássio a 5%. Pesar 50,0g de cro-
182 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
mato de potássio (K2CrO4) dissolver em água destilada e com-
pletar o volume para um litro.
Observações 
Alguns detalhes envolvendo a análise de cloreto pelo método 
de Mohr
Prova em branco:
• Encher a bureta com AgNO3 0,025 N e em seguida zerá-la;
• Pipetar 10mL de água deionizada para um erlenmeyer de 
50mL;
• Adicionar 1,0mL de cromato de potássio a 5%;
• Titular e anotar o volume gasto.
Padronização do nitrato de prata:
Realizar esta operação com três repetições.
• Pipetar 5,0mL de solução padrão de NaCl 0,05 N, para um 
erlenmeyer de 50mL;
• Adicionar 5,0mL de água deionizada;
• Acrescentar 1,0mL de cromato de potássio;
• Titular e anotar o volume.
Titulação dos extratos das amostras:
• Pipetar 10mL do extrato para um erlenmeyer de 50mL; 
• Acrescentar 1,0mL de cromato de potássio;
• Titular com AgNO3 0,025 N padronizado, e em seguida ano-
tar o volume gasto para os devidos cálculos.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 183
iV. BiBliogrAfiA
MALAVOLTA, E. Elementos de nutrição mineral de plantas. São 
Paulo: Editora Agronômica Ceres, 1980. 251p.: il.
MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. (2nd edition). 
London: Elsevier Ltd., 1995. 674p.
OHLWEILER, O.A. Química analítica quantitativa. 2. ed. Rio de 
Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1988. v.2, 226p.: il.
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.
184 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção 
de Boro
Método Espectrofotométrico 
da Azometina-H
i. introdução
O boro é um micronutriente essencial às plantas. É absor-
vido na forma de ácido bórico (H3BO3). Na planta se comporta 
como pouco móvel ou imóvel. Sua deficiência ocorre em tecidos 
de crescimento, enquanto que os sintomas de toxidez aparecem 
em tecidos mais velhos. O boro possui papel na formação da pa-
rede celular, divisão celular, crescimento celular e transporte de 
carboidratos.O teor considerado como tóxico varia com a espé-
cie vegetal, assim para o cafeeiro 200mg.kg-1 nas folhas, estão as-
sociados com os sintomas de clorose malhada (Malavolta, 2006). 
Fageria (1999) estudando arroz, feijão, milho, soja e trigo con-
cluiu que os níveis adequados na planta variaram de 10 a 75mg.
kg-1 e os tóxicos de 20 a 153mg.kg-1, dependendo da cultura.
A análise de boro em tecidos vegetais é importante para o 
diagnóstico de deficiência ou toxicidade. A determinação de 
boro pode ser feita por vários métodos colorimétricos, baseados 
em reações com corantes orgânicos como azometina-H, curcu-
36
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 185
mina, carmina e quinalizarina (Sah & Brown, 1997). Dentre os 
métodos colorimétricos o mais utilizado é o da azometina-H, 
por ser menos susceptível a interferências, mais rápido e mais 
sensível, o único inconveniente é o preço do reagente que é um 
pouco elevado (Bataglia et al., 1983). 
A metodologia com azometina-H baseia-se na formação de 
um complexo de coloração amarelada, resultante da reação do 
ácido bórico, com o reagente azometina-H. Os possíveis interfe-
rentes para o método são partículas em suspensão, que possam 
aumentar a turbidez, ou interferir na coloração, a presença de 
Fe e a contaminação de borossilicatos devido à utilização de vi-
drarias. Deve ser efetuada a digestão seca por calcinação, uma 
vez que a digestão por via úmida provoca perda de ácido bórico 
por volatilização (Malavolta et al., 1997).
ii. proCedimento AnAlítiCo
1. Pesar em cadinho de porcelana 0,250g da amostra vegetal 
(m.s.);
2. Colocar para calcinar a 650°C por 2 horas; 
3. Deixar esfriar e em seguida dissolver as cinzas com 10mL* 
de HCl 0,1 N.
4. Transferir 1,0mL* do extrato ou solução padrão de boro, para 
tubo de ensaio (material plástico); 
5. Adicionar 2,0mL* da solução tampão acetato e homogeneizar;
186 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
6. Adicionar 2,0mL* da solução de azometina-H, agitar e aguar-
dar 30 minutos para o desenvolvimento da cor (amarela);
6. Efetuar a leitura em espectrofotômetro a 420nm, ajustando o 
zero com solução de HCl 0,1 N. 
7. Proceder os cálculos com base na equação de regressão gera-
da a partir da correlação entre a absorbância e concentração 
de boro na curva padrão. Expressar os resultados em mg.kg-1 
de matéria seca da amostra vegetal.
*OBS:. Usar pipetas de alta precisão.
iii. reAgentes
Solução de ácido L-ascórbico a 1%. Dissolver 1g de ácido 
ascórbico em 100mL de água deionizada;
Solução tampão acetato. Dissolver 125g de acetato de amô-
nio e 7,5g de EDTA (sal dissódico) em 200mL de água destilada, 
adicionar 62,5mL de ácido acético glacial e completar o volume 
para 250mL com água deionizada;
Solução de azometina-H 0,45%. Dissolver 0,45g de azo-
metina-H em 100mL de uma solução de ácido ascórbico a 1%. 
Guardar em frasco escuro, no refrigerador, conservando por no 
máximo uma semana;
Solução de ácido clorídrico 0,1 N. Pipetar 8,3mL de HCl con-
centrado (12 N) para um balão volumétrico de 1000mL contendo 
cerca de 500mL de água destilada, homogeneizar, completar o 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 187
volume com água destilada e acondicionar em frasco plástico;
Solução padrão de boro (solução estoque 50mg.L-1). Dissol-
ver 0,286g de ácido bórico P.A. (H3BO3) em HCl 0,1 N, completar 
o volume para 1L e acondicionar em frasco plástico.
Soluções padrões de trabalho. Pipetar para balões volumé-
tricos de 100mL 2,0; 4,0; 8,0; 12,0 e 16,0mL da solução estoque 
e completar o volume com HCl 0,1 N, guardando em frascos 
plásticos. Essas soluções contêm respectivamente 1,0; 2,0; 4,0; 
6,0 e 8,0mg.L-1 de B. O branco (padrão zero) corresponde à solu-
ção de HCl 0,1 N.
iV. BiBliogrAfiA
BATAGLIA, O.C; et al. Métodos de análises químicas de plantas. 
Campinas: Instituto Agronômico, 1983. 48p. (Boletim Técnico, 78).
BROWN, J.C.; HU, H. Phloem boron mobility is species dependent: 
evidence for phloem mobility in sorbitol-rich species. Ann. Bot., v.77, 
p.459-505, 1996.
FAGERIA, N.K. Níveis adequados e tóxicos de boro na produção 
de arroz, feijão, milho, soja e trigo. R. Bras. Eng. Agríc. Ambiental, 
Campina Grande, v.3, n.1, p.30-33, 1999.
LIU, L.; SHELP, B.J.; SPIERS., G.A. Boron distribuition and 
retranslocation in field-grown broccoli (Brassica oleracea var. Italica). 
Can. J. Plant Sci., v.73, p.587-600, 1993.
188 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
MALAVOLTA, E. Manual de nutrição mineral de plantas. São Paulo: 
Ed. Agr. Ceres, 2006. 631p. 
MALAVOLTA, E.; VITTI. G.C.; OLIVEIRA, S.A.; Avaliação do estado 
nutricional das plantas: princípios e aplicações. 2a Edição. Associação 
Brasileira para Pesquisa da Potassa e do Fosfato, 1997. 319p.
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química 
de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 
17p. (IAPAR. Circular, 74).
RAIJ, B.van; BATAGLIA, O.C. Análise química de solo. In: FERREIRA, 
M.E.; CRUZ, M.C.P. eds. Micronutrientes na agricultura. Piracicaba: 
POTAFOS/CNPq, 1991. p.333-356.
SAH, R.H.; BROWN, P.H. Techiniques for boron determination and 
their application to the analysis of plant and soil samples. Plant and 
Soil, v.193, p.15-33, 1997.
SRIVASTAVA, P.C.; GUPTA, U.C. Trace elements in crop production. 
Lebanon: Science Publishers, 1996. 356p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 189
determinAção 
de silíCio
método espeCtrofotométriCo 
do Azul de moliBdênio
i. introdução
O silício (Si) é o segundo elemento em abundância na crosta 
terrestre, depois do oxigênio. Embora o silício seja encontrado 
em todas as plantas em quantidades variáveis, sua essenciali-
dade não foi ainda demonstrada, mesmo com a utilização de 
refinadas técnicas de cultivo por hidroponia. Entretanto, as 
pesquisas efetuadas por diversos autores mostram que princi-
palmente para gramíneas, o Si exerce alguns efeitos benéficos 
como: melhora na arquitetura da planta, impedimento à toxi-
dez devido ao excesso de Mn, diminui a taxa de transpiração, 
confere maior atividade fotossintética e aumenta a resistência 
das plantas às pragas e moléstias. 
O Si é absorvido pelas plantas na forma de ácido monossilí-
cico não dissociado. A maior proporção do Si na planta está na 
forma de sílica amorfa hidratada, SiO2nH2O. O ácido monossilí-
cico é móvel nas plantas, mas quando o Si se solidifica na forma 
de sílica, se torna imóvel. 
37
190 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Em geral, são consideradas plantas acumuladoras de silício, 
aquelas que possuem teor foliar acima de 1%, e não acumula-
doras plantas com teor de silício menor que 0,5%. Na planta, o 
silício concentra-se nos tecidos de suporte, do caule e nas folhas, 
podendo ser encontrado em pequenas quantidades nos grãos. 
Em geral, o conteúdo médio de silício das raízes é menor se com-
parado com o caule e folhas, em alguns casos, como por exemplo, 
a soja, o teor de Si na raiz é maior do que nas folhas. O silício apa-
rece naturalmente em altas concentrações nas folhas de certas 
culturas. Na cana-de-açúcar, por exemplo, as concentrações po-
dem variar desde valores muito baixos em folhas jovens (0,14% 
de Si) até valores muito altos em folhas velhas (6,7% de Si).
O método espectrofotométrico, baseado na formação do 
complexo molibdo-silícico reduzido, tem sido o mais utilizado 
para a determinação de silício em plantas. O composto azul 
de molibdênio resulta da redução do ácido molíbdico-silícico 
obtido pela condensação, em meio ácido, dos ânions silicato 
e molibdato. O sucesso desse método está condicionado 
à dissoluçãoda sílica presente nos materiais vegetais, 
utilizando-se comumente NaOH. Devido à contaminação 
através da sílica contida nos vidros, toda vidraria deve ser 
evitada. Dos elementos contidos em cinzas de material 
vegetal, somente o fósforo tem sido considerado interferente 
na determinação de silício pelo método colorimétrico do azul 
de molibdênio. Dentre os complexantes recomendados para 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 191
a eliminação da possível interferência, o ácido tartárico e o 
oxálico são os mais empregados. 
ii. proCedimento AnAlítiCo 
Preparo do extrato
1. Tarar um cadinho previamente seco e pesar no mesmo 1,0g 
da amostra pré-seca;
2. Carbonizar em fogareiro elétrico e em seguida calcinar por 
4 horas a 600°C;
3. Deixar esfriar, acrescentar 5mL de NaOH a 1%, e como auxí-
lio de um bastão de vidro, dissolver a cinza; 
4. Transferir quantitativamente filtrando para um balão volu-
métrico de 25mL;
5. Acrescentar ao cadinho, mais 5mL de NaOH a 1% para lavar 
o mesmo, e transferir o líquido (quantitativamente e filtran-
do) para o mesmo balão volumétrico mencionado no item an-
terior; 
6. Repetir por mais três vezes a operação anterior, e em seguida 
remover o funil e completar o volume para 25mL;
7. Homogeneizar o extrato e em seguida transferir para um 
frasco de plástico devidamente limpo, seco e identificado.
Desenvolvimento da cor
1. Pipetar para tubos de ensaio de plástico, separadamente, 5mL 
192 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
da solução padrão de silício e dos extratos das amostras; 
2. Acrescentar 1,0mL de ácido sulfúrico (0,5 M) a cada tubo de 
ensaio;
3. Acrescentar 1,0mL de molibdato de amônio a 2%;
4. Agitar suavemente e esperar 5 minutos;
5. Acrescentar 1,0mL de acido oxálico a 2%;
6. Acrescentar 1,0mL de ácido sulfúrico (1,5 M);
7. Acrescentar 1,0mL de ácido ascórbico a 2%;
8. Agitar suavemente, aguardar 20 minutos e fazer a leitura es-
pectrofotométrica a 660nm.
9. Proceder os cálculos com base na equação de regressão gera-
da a partir da correlação entre a absorbância e concentração 
de silício na curva padrão. Expressar os resultados em mg.kg-1 
de matéria seca da amostra vegetal.
iii. reAgentes
Solução de ácido sulfúrico 1,5 M. Pipetar 21mL de H2SO4 
concentrado (18 M) para um balão volumétrico de 250mL con-
tendo cerca de 200mL de água destilada, homogeneizar e com-
pletar o volume;
Solução de ácido sulfúrico 0,5 M. Pipetar 7mL de H2SO4 
concentrado (18 M) para um balão volumétrico de 250mL con-
tendo cerca de 200mL de água destilada, homogeneizar e com-
pletar o volume;
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 193
Solução de ácido L-ascórbico a 2%. Pesar 2,0g de ácido as-
córbico, dissolver em água destilada e completar o volume para 
100mL;
Solução de molibdato de amônio a 2%. Pesar 2,0g de 
(NH4)6.Mo7O24.4H2O, dissolver solução de H2SO4 0,5 M e 
completar o volume para 100mL com o H2SO4 0,5 M;
Solução de hidróxido de sódio 1%. Pesar 2,5g de NaOH, dis-
solver em água destilada e completar o volume para 250mL;
Solução padrão de Si (1000mg.L-1). Pesar 0,4345g de silica-
to de sódio P.A. (Na2SiO3), dissolver em 10mL de hidróxido de 
sódio a 1% e em seguida completar o volume para 100mL com 
água destilada;
Soluções padrões de trabalho. Pipetar para balões volumé-
tricos de 100mL, 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução padrão de si-
lício (1000 mg.L-1) e completar o volume com água destilada. Es-
sas soluções contêm respectivamente 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 e 10mg.L-1 
de Si. O padrão zero corresponde a água destilada.
OBS.: Todas as soluções devem ser guardadas em recipientes 
de polietileno.
194 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
EPSTEIN E.; BLOOM, A.J. Nutrição mineral de plantas; princípios e 
perspectivas. 2.ed. Londrina: Editora Planta, 2006. 403p.
MALAVOLTA, E.; VITTI. G.C.; OLIVEIRA, S.A.; Avaliação do estado 
nutricional das plantas: princípios e aplicações. 2a Edição. Associação 
Brasileira para Pesquisa da Potassa e do Fosfato, 1997. 319p.
MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. (2nd edition). 
London: Elsevier Ltd., 1995. 674p.
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química 
de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 
17p. (IAPAR. Circular, 74).
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 195
determinAção de sÓdio 
e potássio em teCidos VegetAis 
por fotometriA de ChAmA
i. introdução
O potássio é um macronutriente absorvido pelas plantas 
sob a forma de K+, o qual se encontra nos tecidos vegetais na 
concentração de 2 a 110g kg-1 da matéria seca. Embora o sódio 
não seja considerado um elemento essencial para as plantas de 
metabolsimo fotossintético do tipo C3, ele é elemento essencial 
(micronutriente) para as plantas C4 e também para as plantas 
CAM, tendo em vista a sua participação na regeneração do fos-
foenolpiruvato. No caso das halófitas, plantas nativas de habi-
tats salinos, esse elemento é exigido em grandes quantidades 
sendo, portanto um macronutriente para as mesmas (Epstein e 
Bloom, 2006; Larcher, 2006).
A fotometria de chama é uma técnica espectroscópica de 
emissão em que a amostra em solução é introduzida na chama 
em forma de aerosol (nebulizada). A função da chama neste 
caso é excitar eletronicamente os constituintes da amostra. Os 
metais alcalinos e alcalinos terrosos são os elementos mais fa-
cilmente excitados à temperatura das chamas. A excitação de 
38
196 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
um átomo resulta da modificação temporária na posição dos 
elétrons. Quando um elétron absorve energia, ele salta do seu 
nível para outro de maior energia (mais distante do núcleo). Ao 
voltar para seu estado original, quando o átomo (cátion) alcan-
ça uma região menos quente na chama, ele devolve a energia 
absorvida em forma de ondas luminosas monocromáticas. A 
radiação emitida é então quantificada através de uma célula 
fotoelétrica, a qual conectada a um galvanômetro, provoca o 
desvio de um ponteiro, permitindo a avaliação da concentração 
do elemento que fora excitado, por comparação com soluções 
padrões.
Para que a radiação originária de um determinado elemento 
seja tanto quanto possível a única a sensibilizar a célula fotoe-
létrica, ela deverá atravessar um filtro que, idealmente, absorva 
todas as radiações, com exceção, da que interessa. Este tipo de 
filtro é denominado de filtro de interferência. Os fotômetros, no 
geral, são providos de um filtro para sódio, outro para potássio, 
outro para cálcio, outro para magnésio, etc.
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Ligar o fotômetro de chama dez minutos antes de realizar as 
leituras;
2. Zerar e ajustar o fotômetro para a faixa de leitura e em segui-
da proceder à leitura das soluções padrões com o aparelho 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 197
ajustado para Na+ e K+. Anotar os valores das leituras referen-
tes às soluções padrões;
3. Proceder à leitura com o extrato da amostra usado para a 
determinação de fósforo, ou extrato nitro-perclórico. Se ne-
cessário, isto é, se a leitura for superior ao ponto máximo da 
curva padrão, proceder à diluição do extrato, tomando 2mL 
do mesmo e completando o volume para 25mL com água 
deionizada;
4. Anotar o valor da leitura referente a Na+ e K+ no extrato da 
amostra.
5. Proceder aos cálculos para encontrar a concentração de po-
tássio e sódio na amostra preparada (pré-seca).
iii. prepAro dos reAgentes
Solução padrão (estoque) de sódio epotássio 1000mg.L-1. 
Pesar 0,1907g de cloreto de potássio e 0,2541g de cloreto de só-
dio (ambos P.A.), dissolver em água deionizada e completar o 
volume para 100mL.
Curva padrão. Preparar uma curva padrão de sódio e po-
tássio contendo 0, 5, 10, 15, 20 e 25mg.kg-1 de cada um destes ele-
mentos, partindo de uma solução estoque de 1.000mg.L-1. Para 
isto, pipetar para balões volumétricos de 200mL (separadamen-
te) as quantidades de 0, 1, 2, 3, 4 e 5 mL da solução estoque e em 
seguida completar o volume com água deionizada.
198 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
EPSTEIN, E.; BLOOM, A.J. Nutrição mineral de plantas; princípios e 
perspectivas. 2.ed. Londrina: Editora Planta, 2006. 403p.
LARCHER, Walter. Ecofisiologia vegetal. São Carlos: Rima, 2006. 531 p.
MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do 
estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. Piracicaba: 
POTAFOS, 1989. 201p. 
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Avaliação de 
métodos com e sem digestão para extração de elementos em tecidos 
de plantas. Ciência e Cultura, v.36, n.11, p.1953-1958, 1984.
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química 
de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 
17p. (IAPAR. Circular, 74).
SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas. 
Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p.
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 199
determinAção 
de nutrientes minerAis 
por espeCtrofotometriA 
de ABsorção AtômiCA
i. introdução
A determinação analítica de grande parte dos nutrientes 
minerais essencias às plantas tais como cálcio, magnésio, cobre, 
ferro, manganês e zinco, é realizada através da espectrofotome-
tria de absorção atômica. Esta técnica analítica foi desenvolvida 
pelo australiano Alan Walsh, em meados da década de 1950, 
para superar o problema de que grande quantidade dos ele-
mentos químicos não era excitada pela temperatura das cha-
mas (exceção feita para os metais alcalinos) e se encontravam 
no estado fundamental e portanto, e não poderiam ser determi-
nados pela técnica de espectroscopia de emissão de chama.
A espectroscopia de absorção atômica fundamenta-se na 
absorção de energia radiante (e consequente excitação) por ele-
mentos químicos em estado fundamental. Na absorção atômi-
ca, o elemento a determinar é levado à condição de uma disper-
são atômica gasosa, através da qual se faz passar um feixe de 
39
200 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
radiação com comprimento de onda que possa ser absorvido. 
Sabe-se que uma certa espécie atômica neutra e no estado fun-
damental é capaz de absorver radiações em comprimentos de 
onda iguais aos que ela, quando excitada, é capaz de emitir.
Descrição do Espectrofotômetro de Absorção Atômica
Os componentes do equipamento incluem uma fonte pri-
mária, a qual emite o espectro do elemento a determinar, um 
dispositivo para a vaporização da amostra, um monocromador 
para isolar a raia analítica, um detector de radiação e um siste-
ma adequado para medir o sinal.
Fontes de Radiação
As fontes de radiação mais empregadas são as lâmpadas de 
vapor e as de cátodo oco. As lâmpadas de vapor são tubos de 
descarga de baixa pressão, que contêm vapor ao menos par-
cialmente composto do elemento de interesse. Por outro lado, 
as lâmpadas de cátodo oco são tubos de descarga de neônio ou 
argônio a baixa pressão, em que o vapor do elemento a excitar 
é produzido por volatilização catódica durante a descarga. Este 
tipo de dispositivo consiste em um tubo de vidro com paredes 
grossas, contendo o gás nobre sob pressão (1-2atm), provido de 
um cátodo, em uma das extremidades, confeccionado ou reco-
berto com o elemento de interesse, comumente sob a forma de 
um cilindro fechado, e um ânodo na forma de um fio de tungs-
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 201
tênio. Existem lâmpadas de cátodo oco para um único elemen-
to, e também lâmpadas multielementos, as quais contêm vários 
elementos em uma única estrutura de cátodo oco (ex.: Ca e Mg; 
Cu e Mn, Cu e Zn; e Cr, Co, Cu, Fe, Mn e Ni).
Dispositivo de Vaporização da Amostra 
(Atomizador de Chama)
Serve para dispersar a amostra em forma de partículas 
atômicas neutras no feixe de emissão do cátodo oco, para 
que isso ocorra é necessária a remoção do solvente e as mo-
léculas convertidas em átomos simples, isto pode ser feito 
por uma chama, em forno de grafite (aquecimento sem cha-
ma) ou por forno de plasma.
O atomizador de chama é formado por:
Nebulizador: do tipo pneumático em que o fluxo dos 
gases através de um orifício cria um vácuo que arrasta a 
amostra através de um tubo capilar. A mistura ar-amostra 
emerge do nebulizador para o interior de uma câmara (câ-
mara de nebulização) em forma de aerossol, que se mistura 
com o combustível, em geral acetileno. A mistura torna-se 
turbulenta devido à ação de deflectores e finalmente, chega 
ao combustor. As gotículas maiores são coletadas na câma-
ra de mistura e removidas por um dreno, e assim apenas 
as partículas menores e homogêneas chegam à chama em 
fluxo constante.
202 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
 Queimador: em geral é do tipo pré-mistura, com uma câ-
mara especial onde a amostra é misturada com os gases antes 
da queima. Possuem fenda longa e são fabricados com titânio 
para conferir maior resistência às soluções ácidas, estabilidade 
e inércia. Os combustíveis utilizados para produzir a chama 
são acetileno e hidrogênio, enquanto os oxidantes são ar, oxigê-
nio e óxido nitroso (Quadro 39.1). 
Quadro39.1. Temperatura (°C) de combustão no queimador em função do 
combustível e oxidantes empregados em espectroscopia de absorção atômica.
COMBUSTÍVEIS
O X I D A N T E S (°C)
Ar Oxigênio
Óxido 
Nitroso
Acetileno 2200 3050 2955
Hidrogênio 2100 2780 -
Monocromador
A função primordial do monocromador é isolar a raia ana-
lítica do elemento de interesse das raias emitidas pela lâmpada 
de cátodo oco que não são absorvidas (raias vizinhas), assim 
como a radiação de fundo da chama.
Detectores e Indicadores
Em geral são empregados tubos fotomultiplicadores para 
detectar a energia radiante e converter em sinal elétrico, e são 
idênticos aos utilizados em espectrofotômetros UV-visível.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 203
Tipos de Instrumentos
Existem dois tipos de espectrofotômetros, os de feixe sim-
ples e os de duplo feixe. No sistema de feixe simples, a modu-
lação da fonte produz uma corrente alternada no detector. O 
sistema fica submetido aos efeitos da variabilidade na emissão 
da fonte e na sensibilidade do detector. É necessário um cer-
to tempo de espera para a estabilidade da emissão. Por outro 
lado, no sistema de feixe duplo com corrente alternada, o mo-
dulador divide a luz da fonte em dois feixes, o feixe da amos-
tra que passa através da chama e o de referência que circunda 
a chama, e ao final os feixes são recombinados.
Particularmente para as análises de cálcio e magnésio há a 
necessidade da adição de solução de cloreto de estrôncio ou de 
cloreto de lantânio (que contenha de 2,0 a 5,0g de Sr ou La por 
litro de solução) para evitar interferências provocadas pela 
presença de fosfatos e aluminatos. Tanto o estrôncio como o 
lantânio têm a capacidade de impedir a formação de compos-
tos termicamente estáveis (óxidos refratários)entre magnésio 
ou cálcio com fosfatos e aluminatos, os quais não são decom-
postos pela chama ar/acetileno. Desse modo, o estrôncio e o 
lantânio exercem o papel de agente liberador do cálcio e do 
magnésio, pois formam compostos quimicamente mais está-
veis com os interferentes.
204 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ii. mArChA AnAlítiCA
1. Conectar a lâmpada de catodo oco, correspondente ao ele-
mento a ser analisado, ao espectrofotômetro de absorção atô-
mica (EAA). Marca CGB, modelo AA7000; 
2. Ligar o EAA e deixar aquecendo por cerca de 15 minutos;
3. Ajustar o comprimento de onda (ajuste grosso) de acordo com 
o elemento a ser analisado. Para isto, consulte o quadro 39.2;
4. Selecionar a lâmpada a ser utilizada (bocal nº 1 ou nº 2) e 
entrar com o valor da corrente em mA;
5. Ajustar o tempo de integração para três segundos, e também 
a abertura da fenda conforme o quadro 39.2;
6. Fazer os ajustes horizontal e vertical do feixe luminoso e pos-
teriormente efetuar o ajuste fino do comprimento de onda;
7. Regular a pressão de saída do ar comprimido para 3,4 bar;
8. Ligar o sistema de exaustão dos gases e em seguida acender 
a chama;
9. Fazer a calibração do aparelho, utilizando os padrões de tra-
balho relativos ao elemento em análise. Esta calibração é rea-
lizada em absorbância;
10. Aspirar o branco e depois zerar o aparelho;
11. Passar o EAA para o modo de concentração e proceder à 
leitura dos padrões de trabalho e logo em seguida a leitura 
das amostras;
12. Após ler todas as amostras, apagar a chama, desligar o 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 205
aparelho, fechar as saídas dos gases e desligar o sistema de 
exaustão.
OBS.: A amostra para o caso de tecidos vegetais é o extrato 
nitro-perclórico
Quadro 39.2. Corrente a ser empregada na lâmpada, abertura da fenda e com-
primento de onda para calibração do EAA correspondente a cada elemento 
químico a analisar.
Elemento 
Químico
Corrente da 
Lâmpada*
Abertura 
da Fenda
Comprimento 
de Onda
Ca 4,0 0,5 422,7
Mg 4,0 0,5 285,2
Cu 4,0 0,5 324,7
Fe 6,0 0,2 248,3
Mn 5,0 0,2 279,5
Zn 5,0 0,5 213,9
OBS.: Estes valores podem ser alterados em função do modelo de aparelho e 
do tempo de uso (idade) da lâmpada.
iii. reAgentes
a. Soluções padrões de cálcio
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Ca. Pesar 2,4970g de 
CaCO3 seco, dissolver em 25mL de ácido clorídrico (d=1,18 ≡ 
12N) e completar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (0; 2; 4; 6; 8 e 10mg.L-1 Ca). Transfe-
rir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0,2; 0,4; 
0,6; 0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000mg.L-1 Ca) e com-
206 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
pletar o volume com solução de cloreto de estrôncio 1,52%. 
O branco (padrão zero) corresponde à solução de cloreto de 
estrôncio 1,52%.
b. Soluções padrões de magnésio
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Mg. Pesar 1,0000g de 
magnésio metálico, dissolver em 50mL de ácido clorídrico 5 
N e completar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (2; 4; 6; 8 e 10 mg.L-1 Mg). Transferir 
para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 
e 1,0mL da solução estoque (1.000 mg.L-1 Mg) e completar o vo-
lume com solução de cloreto de estrôncio 1,52%. O branco (pa-
drão zero) corresponde à solução de cloreto de estrôncio 1,52%.
OBS.: Recomenda-se que os extratos vegetais obtidos por di-
gestão nitro-perclórica sejam diluídos (0,5+10) com solução de 
cloreto de estrôncio 1,52%.
c. Soluções padrões de cobre
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Cu. Pesar 1,0000g de co-
bre metálico, dissolver em 50mL de ácido nítrico 6 N e com-
pletar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (1; 2; 3; 4 e 5mg.L-1 Cu). Transferir 
para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0,1; 0,2; 0,3; 
0,4 e 0,5mL da solução estoque (1.000mg.L-1 Cu) e completar o 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 207
volume com água deionizada. O branco (padrão zero) corres-
ponde à água deionizada.
d. Soluções padrões de ferro
Solução estoque 1.000mg.L-1 de Fe. Pesar 1,0000g de ferro 
metálico, dissolver em 20mL de ácido clorídrico 5N e 5mL de 
ácido nítrico 6 N, e completar para um litro com água deio-
nizada.
Padrões de trabalho (0; 2; 4; 6; 8 e 10mg.L-1 Fe). Transferir 
para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 
0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000 mg.L-1 Fe) e completar o 
volume com água deionizada
e. Soluções padrões de manganês
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Mn. Pesar 1,0000g de 
manganês metálico, dissolver em 50mL de ácido nítrico 6 N e 
completar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (0; 1; 2; 3; 4 e 5mg.L-1 Mn). Transferir 
para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0; 0,1; 0,2; 0,3; 
0,4 e 0,5mL da solução estoque (1.000 mg.L-1 Mn) e completar 
o volume com água deionizada.
f. Soluções padrões de zinco
Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Zn. Pesar 1,0000g de zinco 
metálico, dissolver em 40mL de ácido clorídrico 5 N e comple-
208 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
tar para um litro com água deionizada.
Padrões de trabalho (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5mg.L-1 Zn). 
Transferir para balões volumétricos de 200 mL alíquotas de 0; 
0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5mL da solução estoque (1.000mg.L-1 Zn) e 
completar o volume com água deionizada.
g. Solução de Cloreto de Estrôncio 1,52%. Pesar 15,2g de clo-
reto de estrôncio hexahidratado P.A. (SrCl2.6H2O), dissolver em 
água deionizada e completar a um litro.
iV. BiBliogrAfiA
BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas 
em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.
EWING, G. W. Métodos Instrumentais de Análise Química. 5ª 
reimpressão. Vol.1, São Paulo: Editora Edgard Blucher L.T.D.A. 1989. 
296p.
MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do 
estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. Piracicaba: 
POTAFOS, 1989. 201p. 
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Avaliação de 
métodos com e sem digestão para extração de elementos em tecidos 
de plantas. Ciência e Cultura, v.36, n.11, p.1953-1958, 1984.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 209
MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química 
de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 
17p. (IAPAR. Circular, 74).
OHLWEILER, O.A. Fundamentos de Análise Instrumental. Rio de 
Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1988. 486 p.
SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas. 
Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p.
SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e 
fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370 p.
210 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Conselhos úteis 
pArA trABAlhos 
em lABorAtÓrio 
1. Tenha em mente que o laboratório é um lugar de trabalho e 
que sempre envolve riscos. Preserve o silêncio, o respeito aos 
colegas e evite brincadeiras. Se necessário, lembre este item 
ao companheiro;
2. Prepare-se para qualquer experiência, lendo as orientações e 
a metodologia do manual antes de vir para o laboratório;
3. Siga rigorosamente as instruções do professor e realize so-
mente experiências prescritas pelo mesmo;
4. Evite fumar no laboratório, bem como sentar nas bancadas;
5. Procure usar bata ou avental apropriado;
6. Evite contato de qualquer substância com a pele, e se isto 
ocorrer, procure imediatamente lavar a pele com bastante 
água e em seguida comunique ao professor, informando tam-
bém sobre qualquer acidente que ocorra;
7. Caso seja necessário testar o odor de algum produto químico, 
não coloque ofrasco sob o nariz. Abane lentamente com a 
mão os vapores desprendidos pelo frasco, até suas narinas;
8. Observe cuidadosamente o rótulo dos frascos que contêm o 
dado reagente, e antes de retirar qualquer porção do conte-
An
ex
o 
1
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 211
údo, leia o rótulo duas vezes, certificando-se de que tem o 
frasco certo;
9. Zele pela organização do laboratório e evite trocar as tampas 
dos frascos, bem como trocar pipetas em uso;
10. Mantenha sempre a aparelhagem e bancadas limpas. Evite 
derramamentos, mas se cair alguma coisa, limpe-a imediata-
mente com água e detergente ou pano úmido.
Observação: Se estes conselhos forem seguidos rigorosamente 
por todos os alunos, entre outros benefícios que podem ser pro-
porcionados, podemos enumerar os seguintes: segurança, efici-
ência, economia, maior aprendizagem e gratidão do professor.
212 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
instruções pArA elABorAção 
de relAtÓrios 
de Análises QuímiCAs
Introdução. Faça uma breve introdução descrevendo sobre o 
material analisado, sua importância agrícola, industrial, etc. 
Ainda neste item, descreva, brevemente, acerca da análise em 
foco, enfatizando sua importância e/ou objetivo, bem como o 
fundamento ou princípio em que a mesma é baseada.
Material E Métodos. Descreva neste item a marcha analítica, 
isto é, o roteiro utilizado na execução da análise. Faça cons-
tar neste item todo o material de laboratório utilizado para 
a realização da análise (vidrarias, equipamentos, reagentes 
químicos, etc.).
Resultados e Discussão. Nas análises quantitativas, realize 
os cálculos necessários, apresentando os resultados em per-
centagem, g.kg-1, ppm, mg.kg-1, ou na unidade convencional-
mente mais adequada para cada caso. Compare os resultados 
obtidos pelo seu grupo com o que há na literatura especiali-
zada (livros, revistas científicas, etc.). 
Conclusão. Neste item, procure dar uma interpretação aos 
seus resultados.
An
ex
o 
2
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 213
Observações
a. Se consultar alguma literatura, acrescente ao relatório mais 
um item denominado Referências Bibliográficas, onde 
deverá constar a literatura consultada. Procure seguir as nor-
mas da ABNT ao referenciar a bibliografia.
b. Ao escrever cada relatório, use os verbos na 3ª pessoa do 
singular ou plural, de forma impessoal, utilizando a voz 
passiva.
214 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
trAnsformAções de resultAdos 
de Análises QuímiCAs
 A composição química dos vegetais varia com o teor de 
umidade dos mesmos. A quantidade absoluta de um deter-
minado constituinte como proteína, carboidrato, etc., presen-
te em uma amostra, não depende diretamente do seu teor 
de umidade. Porém, o conteúdo relativo (concentração) de 
qualquer componente de uma amostra, varia com o teor de 
umidade da mesma. Por isto, é de fundamental importância, 
quando se expressar a composição de qualquer constituinte 
vegetal, indicar qual o teor de umidade do mesmo.
No geral, a composição química dos vegetais é expressa em 
relação à matéria seca, isto é, à condição de umidade zero. A 
matéria seca é, portanto, um referencial bastante útil para se 
comparar a concentração de qualquer constituinte vegetal.
Conhecendo-se a composição química de uma amostra em 
relação à matéria seca, é possível converter os valores para 
outras condições, como as condições de campo (matéria fres-
ca), por exemplo. Para tal, basta saber o teor de umidade que a 
referida amostra apresenta nas condições de campo. Esse tipo 
de conversão, ou transformação de resultados, baseia-se no 
fato de que, retirada a umidade de qualquer amostra vegetal, 
o que resta é a matéria seca. Desta forma, todos os demais 
An
ex
o 
3
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 215
constituintes de qualquer amostra vegetal são os que formam 
a matéria seca e, portanto, estão contidos nela.
216 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
exerCíCios propostos
determinAção de umidAde
1. Calcule a percentagem de umidade de uma amostra saben-
do que:
a. Tara do pesa-filtro ..................................... 26,4300g
b. Peso do pesa-filtro + amostra úmida......... 31,4300g
c. Peso do pesa-filtro + amostra seca............ 27,6300g
2. Calcule a percentagem de umidade de uma amostra vegetal 
que apresentou os seguintes dados de análise:
a. Tara do pesa-filtro .................................... 41,1340g
b. Peso do pesa-filtro + amostra úmida ........ 45,1340g
c. Peso do pesa-filtro + amostra seca ...........42,1340g
3. Em uma determinação de umidade de uma amostra vegetal, 
obteve-se os seguintes dados:
a. Tara do pesa-filtro ................................. 44,2560g
b. Peso do pesa-filtro + amostra úmida ..... 48,2560g
c. Peso do pesa-filtro + amostra seca ....... 44,7560g
Calcular a percentagem de umidade da amostra acima.
4. Em uma análise vegetal, colocou-se 6,0000g de uma amostra 
em um pesa-filtro de tara igual a 42,3890g e em seguida foi 
levada à estufa até completa desidratação. Sabendo-se que ao 
An
ex
o 
4
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 217
sair da estufa o conjunto pesa-filtro mais amostra seca pesava 
47,5490g, calcule a percentagem de umidade que continha a 
amostra.
 
trAnsformAções de resultAdos de Análises 
QuímiCAs
1. Uma amostra preparada de mandioca apresenta 12,00% de 
umidade e 40,00% de amido. Calcule a percentagem de ami-
do que a referida amostra tem nas condições de campo, sa-
bendo-se que a umidade de campo da mesma é 70,00%.
2. Consideremos duas amostras preparadas de uma plan-
ta forrageira. A amostra A contendo 17,60% de proteína 
e 20,00% de umidade (Uap), enquanto que a amostra B 
contendo 18,70% de proteína e 15,00% de umidade (Uap). 
Calcule:
a. Qual das duas amostras contém mais proteína em re-
lação à matéria seca?
b. Qual das duas amostras contém mais proteína nas 
condições de campo, sabendo-se que nas condições 
de campo a amostra A contém 70,00% de umidade e a 
amostra B contém 80,00% de umidade?
c. Quantos quilos de cada uma das forragens acima, nas 
condições de campo, um animal precisaria comer para 
218 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
ingerir um quilo de proteína? Admitir que o animal se 
alimentaria somente com um tipo de forragem (A ou B).
3. Sabendo-se que uma amostra preparada contém 27,00% de 
proteína e 10,00% de umidade, pede-se para calcular:
a. A percentagem de proteína desta amostra nas condições 
de campo, sabendo-se que a umidade de campo da referida 
amostra é 90,00 %;
b. A percentagem de proteína da referida amostra em relação à 
matéria seca.
4. Uma amostra vegetal contém 45,00% de fibra em relação à 
matéria seca. Calcule a percentagem de fibra que contém esta 
amostra nas condições de campo e na amostra preparada, 
sabendo-se que a mesma apresenta 82,00% de umidade de 
campo e 12,00% de umidade na amostra preparada.
5. Uma amostra vegetal nas condições de campo, com 83,00% 
de umidade, contém 2,55% de carboidratos. Calcule qual a 
percentagem de carboidratos que contém esta amostra em re-
lação à matéria seca e em relação à amostra preparada com 
11,00% de umidade.
6. A análise de uma amostra preparada de uma forragem apre-
sentou os seguintes resultados:
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 219
Uap = 16,00% RM = 9,00%
ENN = 44,00% PB = 15,00%
EE = 5,00% FB = 11,00%
Pede-se para calcular a composição da amostra acima, em 
relação à matéria seca e nas condições de campo, sabendo-se 
que a umidade de campo é 79,00%.
7. Os valoresabaixo representam a composição química de uma 
amostra vegetal em relação à matéria seca:
ENN = 25,00% PB = 26,00%
EE = 10,00% FB = 34,00%
RM = 5,00%
Pede-se para expressar a composição desta amostra nas con-
dições de campo com 74,00% de umidade e na amostra prepa-
rada, com 13,00'% de umidade.
8. Abaixo temos a composição química de uma amostra vege-
tal, nas condições de campo. Pede-se para transformar estes 
resultados de análise para a matéria seca e para amostra pre-
parada com 20,00% de umidade.
Uc = 75,00% RM = 1,00%
ENN = 5,00% FB = 9,00%
EE = 4,00% PB = 6,00%
9. Uma amostra vegetal com a composição química abaixo, é 
220 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
colocada em uma estufa até completa desidratação. Pede-se 
para expressar a sua composição quando a mesma sair da 
estufa.
Uc = 60,00% RM = 2,00%
ENN = 8,00% FB = 14,00%
EE = 6,00% PB = 10,00%
determinAção de resíduo minerAl
1. Na análise do resíduo mineral de uma amostra vegetal, fo-
ram obtidos os seguintes resultados:
• Tara do cadinho 21,3690g
• Peso do cadinho mais amostra 23,8690g
• Peso do cadinho mais RM 21,5690g
Calcule a percentagem de cinzas da amostra acima.
2. Em uma determinação de cinzas de uma amostra vegetal, 
pesou-se 1,8000g da amostra em um cadinho de tara igual a 
26,4830g e em seguida foi colocada na mufla até completar a 
calcinação. Calcule a percentagem de cinzas da amostra ana-
lisada, sabendo-se que o conjunto, cadinho mais cinzas, ao 
sair da mufla pesava 26,5730g.
3. Uma amostra preparada de uma forragem foi analisada e ob-
tidos os seguintes resultados:
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 221
• Tara do cadinho 23,9140 g
• Peso do cadinho mais amostra 26,1140 g
• Peso do cadinho mais cinzas 24,0020 g
Calcule a percentagem de cinzas na amostra analisada, de-
termine ainda quantos quilos de cinzas são produzidos por 
hectare com a queima completa da referida forragem, saben-
do-se que a umidade da amostra preparada é de 20,00%, a 
umidade de campo é 87,00% e a produtividade da forragem é 
de 13 toneladas por hectare.
determinAção de AçúCAres redutores 
pelo método de eynon-lAne
1. Em uma dosagem de açúcar invertido, pesou-se 20,0g de cal-
do de cana e transferiu-se para um balão de 200mL. Depois 
de clarificado, completado o volume e filtrado, foi feita a titu-
lação, sendo gasto no ensaio definitivo 45mL do filtrado para 
reduzir 10mL da solução de Soxhlet, volume este que corres-
ponde a 50,9mg de açúcar invertido. Calcule a percentagem 
de açúcar invertido no caldo analisado.
2. Para uma análise de caldo de cana foi pesado 25,0g do caldo, 
sendo o mesmo transferido para uma balão volumétrico de 
250mL, clarificado, completado o volume e em seguida filtra-
do. Com o filtrado, foi titulado 10mL da solução de Soxhlet, 
222 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
gastando-se 30mL do mesmo. Calcule a percentagem de açú-
car invertido existente no caldo analisado, sabendo-se que de 
acordo com a tabela de Eynon-Lane, 30mL de solução anali-
sada corresponde a 50,5mg de açúcar invertido.
3. Em uma análise de caldo de cana, pesou-se 20,0g do mesmo, 
transferiu-se para um balão volumétrico de 200mL, clarifi-
cou-se, completou o volume e em seguida filtrou-se. Com o 
filtrado foi feita uma titulação da solução de Soxhlet, sendo 
gasto menos que 15mL do filtrado para reduzir 10mL da so-
lução de Soxhlet. Então foi feita uma diluição da solução fil-
trada, tomando-se 50mL da mesma e completando o volume 
para 100mL com água destilada. Desta solução diluída foi 
feita uma nova titulação, sendo gastos 25mL da mesma para 
reduzir 10mL da solução de Soxhlet. Calcule a percentagem 
de açúcar invertido do caldo analisado, sabendo-se que se-
gundo a tabela de Eynon-Lane, 25mL de solução analisada 
coresponde a 50,4mg de açúcar invertido.
determinAção de sACArose pelo método 
de eynon-lAne
1. Para determinar o teor de sacarose de uma amostra de caldo-
de-cana, foi pesado 20,0g do mesmo, transferido para um ba-
lão volumétrico de 200mL, clarificado, filtrado e completado o 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 223
volume. Do filtrado foi feita a titulação de 10mL da solução de 
Soxhlet, para determinar o açúcar invertido previamente exis-
tente no caldo, gastando-se 35mL, o que na tabela de Eynon-
Lane corresponde a 50,7mg de açúcar invertido. Do filtrado 
tomou-se 50mL para determinação de açúcar invertido total, 
transferindo-se para um balão de 500mL, sendo usada esta 
solução diluída para titulação da solução de Soxhlet, e gastan-
do-se 25mL, o que corresponde a 51,2mg de açúcar invertido. 
Calcule a percentagem de sacarose no caldo analisado.
2. Em uma determinação de sacarose pelo método de Eynon-
Lane, foi pesado 30,0g de caldo de cana, transferido para 
um balão volumétrico de 250mL, clarificado, completado o 
volume e filtrado. Na determinação do açúcar invertido pre-
viamente existente no caldo, gastou-se 40mL do filtrado para 
reduzir 10 mL da solução de Soxhlet, o que corresponde a 
50,8mg de açúcar invertido. Para provocar a hidrólise da sa-
carose foi usado 100mL do filtrado e diluído para um balão 
de um litro, sendo gasto na titulação do açúcar invertido total 
21mL, volume este que corresponde a 51mg de açúcar inver-
tido. Calcule:
a. A percentagem de sacarose no caldo analisado;
b. Quantas toneladas de caldo de cana são necessárias para se 
obter 450kg de sacarose, admitindo o rendimento industrial 
de 100%.
224 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
3. Em uma dosagem de sacarose pelo método de Eynon-Lane, 
pesou-se 20,0g de caldo de cana, transferiu-se para um balão 
de 200mL, clarificou-se, completou-se o volume e filtrou-se. 
Com o filtrado encheu-se uma bureta para a dosagem do açú-
car invertido previamente existente no caldo. Enquanto isto, 
tomou-se 25mL do filtrado e provocou-se a hidrólise da saca-
rose, completou-se o volume para 250mL e dosou-se o açúcar 
invertido total. Na dosagem do açúcar invertido previamente 
existente no caldo, gastou-se 40mL da solução, o que corres-
ponde a 50,8mg do açúcar invertido; na dosagem do açúcar 
invertido total gastou-se 28mL do hidrolisado, o que corres-
ponde a 51,4mg de açúcar invertido. Calcule:
a. A percentagem de sacarose no caldo analisado;
b. Quantas toneladas do caldo acima são necessárias para se 
obter 500kg de sacarose;
c. Quantos quilos de sacarose poderia se obter com 2 toneladas 
do caldo de cana acima.
4. Em uma determinação de sacarose pelo método de Eynon-
Lane, obteve-se os seguintes resultados de análise:
• Peso da amostra 25,0g;
• Volume para o qual foi diluído a amostra: 250mL;
• Volume do filtrado usado para a hidrólise da sacarose: 25mL;
• Volume para o qual foi completado o hidrolisado: 200mL;
• Volume gasto do filtrado para dosagem do açúcar inverti-
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 225
do previamente existente no caldo: 42mL (correspondente a 
50,8mg de açúcar invertido);
• Volume gasto do hidrolisado para dosagem do açúcar inverti-
do total: 24mL (correspondente a 51,2mg de açúcar invertido).
De posse destes dados, calcule:
a. A percentagem de sacarose do caldo;
b. Quantas toneladas de caldo de cana são necessárias para pro-
duzir 450kg de sacarose;
c. Quantos quilos de sacarose são obtidos a partir de 4,5 tonela-
das de caldo de cana.
determinAção de Amido pelo método 
de eynon-lAne
1. Em uma determinação de amido, pesou-se 4,0g de uma 
amostra, provocou-se a hidrólise da mesma, transferiu-se 
para um balão volumétrico de 500mL e completou-se o volu-
me com água. Em seguida, filtrou-se e como filtrado foi titu-
lado 10mL da solução de Soxhlet, gastando-se 25mL, quan-
tidade esta que equivale a 49,8mg de glicose. Pede-se para 
determinar a percentagem de amido na amostra analisada.
2. Em uma determinação de amido, foi pesado 5,0g da 
amostra, procedida a hidrólise e transferida para um ba-
lão de 500mL. Em seguida foi clarificado, completado o 
226 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
volume e filtrado. com o filtrado foi titulada a solução 
de Soxhlet, gastando-se menos de 15mL. Então foi feita 
uma diluição tomando-se 100mL do filtrado e comple-
tando para um volume de 200mL com água destilada, e 
em seguida feita uma nova titulação, gastando-se 40mL 
da solução diluída, o que na tabela de Eynon-Lane cor-
responde a 50,6mg de glicose. Calcule a percentagem de 
amido no material analisado.
3. Em uma determinação de amido, pesou-se 5,0g de 
uma amostra preparada de mandioca, procedeu-se 
a hidrólise, em seguida transferiu-se para um ba-
lão de 500mL e completou-se o volume com água des-
tilada. Em seguida filtrou-se e com o filtrado foi ti-
tulada a solução de Soxhlet, gastando-se 30mL do 
filtrado, volume este que equivale a 50,1mg de glicose. 
Calcule:
a. A percentagem de amido na amostra analisada;
b. Quantas toneladas são necessárias da amostra acima para 
se obter 300kg de amido;
c. Quantas toneladas de amido poderá se obter a partir de 
um hectare de mandioca, sabendo-se que sua produtivi-
dade é de 20 toneladas por hectare, a umidade da amostra 
preparada é 10,00% e a umidade de campo da amostra é 
60,00%.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 227
determinAção de extrAto etéreo
1. Em um trabalho de pesquisa foram pesados 4,0g de semente 
de soja e colocados para extrair o óleo, obtendo-se os seguin-
tes resultados:
• Tara do balão coletor = 39,1250g
• Peso do balão coletor + E.E. = 39,8450g
De posse desses resultados pede-se para calcular:
a. A percentagem de óleo na semente de soja;
b. Quantos quilogramas de óleo se obtém a partir de uma tone-
lada de semente;
c. Quantas toneladas de semente são necessárias para se obter 
270kg de óleo.
2. Em uma análise de semente de amendoim foram pesados 
15,0g do fruto (vagem), descascados e separadas as amên-
doas (sementes) das cascas, obtendo-se 6,75g de cascas. Das 
amêndoas foram pesados 2,5g e colocadas para extrair o óleo, 
obtendo-se os seguintes resultados:
• Tara do balão coletor = 54,0420g
• Peso do balão coletor + E.E. = 55,2170g
Com base nos resultados acima, pede-se para calcular:
a. Percentagem de cascas e de amêndoas nos frutos;
b. Percentagem de óleo nas amêndoas e nos frutos, admitindo-
se que as cascas não contêm óleo.
228 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
3. Em uma análise de semente de milho, pesou-se 3,0 g da mes-
ma e colocou-se para extrair o óleo, sendo o mesmo recebido 
em um balão coletor de tara igual a 45,2860g. Após a extração 
completa de óleo, o balão foi pesado com o óleo, obtendo-se 
45,4360g. Calcule:
a. A percentagem de óleo na semente analisada;
b. Quantas toneladas de semente são necessárias para se obter 
800kg do óleo.
4. Em uma análise de semente de arroz foram pesados 12,0g 
da semente, descascada e separadas as cascas dos grãos, ob-
tendo-se 4,80g do grão descascado. Sabendo-se que a percen-
tagem de óleo no grão (descascado) é de 3,00%, pede-se para 
calcular:
a. A percentagem de casca na semente;
b. A percentagem de grão na semente;
c. A percentagem de óleo na semente (com casca), admitindo 
que as cascas não contêm óleo.
determinAção de fiBrA BrutA
1. Na análise de uma forragem, pesou-se 5,0g da amostra pre-
parada e colocou-se para extrair o óleo, encontrando-se 8,00% 
de óleo neste material. Em seguida o resíduo da determina-
ção de óleo (torta), foi tratado para a determinação da fibra 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 229
bruta (F.B.), obtendo-se os seguintes resultados:
• Tara do pesa-filtro + papel de filtro = 27,4523g
• Peso do pesa-filtro + papel de filtro + F.B. = 31,2243g
Pede-se para calcular:
a. A percentagem de fibra bruta na amostra preparada.
b. A percentagem de fibra bruta na amostra desengordurada
c. Quantos quilogramas desta forragem precisam-se colher no 
campo para se obter 300kg de fibra bruta, sabendo-se que a 
umidade da amostra preparada é de 12,00% e a umidade de 
campo é de 84,00%.
determinAção de proteínA BrutA
1. Calcule a porcentagem de proteína bruta determinada pelo 
método de Kjeldahl, sabendo-se que foi pesado 0,1g de uma 
amostra vegetal, e que após a digestão, o destilado foi titu-
lado com 1,8ml de ácido sulfúrico 0,05 N.
2. Numa análise de proteína bruta (PB) pelo método de Kjel-
dahl, utilizou-se 100mg de uma amostra vegetal e gastou-se 
0,5ml de ácido sulfúrico 0,2 N na titulação da amônia. Cal-
cule a percentagem de proteína bruta na amostra.
3. Na determinação de proteína bruta de uma leguminosa, 
foi pesado 0,1g da amostra preparada, digerida e, em se-
230 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
guida, destilada. Após a destilação, foi efetuada a titula-
ção, gastando-se 1,5ml de ácido sulfúrico 0,1 N para titular 
a amônia. Calcule a percentagem de proteína na amostra 
analisada.
4. Admita que a amostra referente ao problema anterior trata-
se de uma amostra preparada com 10,00% de umidade, e 
que a mesma foi obtida de uma planta leguminosa a ser 
utilizada como adubo verde, e que nas condições de campo 
ela contém 70,00% de umidade. Com base nestas conside-
rações e nos dados do problema anterior, calcule quantos 
quilogramas de nitrogênio se adiciona ao solo em 5,0 hecta-
res de área plantada, com a incorporação total da biomassa, 
sabendo-se que a referida cultura apresenta uma produtivi-
dade de 6 toneladas por hectare.
5. Deduza a equação para se calcular diretamente a percenta-
gem de proteína bruta (PB), em função do volume do ácido 
gasto na titulação, conhecendo-se as condições padrões de 
trabalho, as quais são fornecidas abaixo:
Usar 100mg da amostra e titular a amônia destilada 
com H2SO4 0,05 N.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 231
determinAção de proteínA solúVel pelo 
método de BrAdford
1. Pesou-se 200mg de uma amostra vegetal e procedeu-se a 
extração utilizando-se um total de 20mL do solvente (etanol 
a 80%). Após a centrifugação do extrato bruto, procedeu-se 
a cromatografia de partição para remover os pigmentos fo-
tossintéticos e em seguida recolheu-se 200µL da fase aquosa 
para um tubo de ensaio. Acrescentaram-se 4mL do reagente 
coomassie brilliant blue e procedeu-se a leitura espectrofotomé-
trica, da mesma forma que foi realizado com as soluções pa-
drões. Calcule o teor de proteína solúvel da amostra (mg.g-1 de 
matéria fresca), sabendo-se que a leitura espectrofotométrica 
referente a amostra foi 0,125, e que as leituras com soluções 
de BSA nas concentrações de 0 e 200µg.mL-1 foram respecti-
vamente 0 e 0,250.
2. Para determinar a concentração de proteína solúvel em bra-
quiária (Brachiaria humidicula), pesou-se 250mg de folhas 
frescas, desprezando-se a nervura principal e triturou-se em 
presença de 20mL de etanol a 80%. Posteriormente, centrifu-
gou-se e recolheu-se 2mL do sobrenadante. Procedeu-se a 
cromatografia de partição para remoção dos pigmentos fo-
tossintéticos, desprezando-se a fase orgânica e transferindo 
a fase aquosa para tubo de Eppendorf. Após o desenvolvi-
232 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
mento da cor devido a reação do coomassie brilliant blue com 
as proteínas, obteve-se uma leitura espectrofotométrica de 
0,139. Tendo em vista queas leituras dos padrões de BSA (0 
a 500µg.mL-1) proporcionaram uma equação cujo coeficiente 
angular foi 0,1 e o coeficiente linear 0,2, calcule o teor de pro-
teína solúvel na braquiária em questão, expressando o resul-
tado em mg.g-1 de matéria fresca.
determinAção de AminoáCidos liVres totAis
1. Na determinação de aminoácidos livres totais, pesou-se 
500mg de tecido vegetal fresco e triturou-se utilizando 10mL 
de etanol 80%. Procedeu-se a filtração e depois adicionou-se 
mais 10mL de etanol a 80% para lavar o resíduo da filtração. 
Posteriormente, fez-se a cromatografia de partição para re-
moção dos pigmentos, e com o extrato aquoso procedeu-se 
o desenvolvimento da cor com auxílio do revelador. A leitu-
ra espectrofotométrica correspondente à amostra foi 0,230. 
As soluções padrões de leucina, nas concentrações de 0 e 
25mg.L-1, após o desenvolvimento da cor, proporcionaram 
respectivamente as leituras de 0 e 0,500. Calcule o teor de 
aminoácidos livres na amostra, expressando o resultado em 
mg.g-1 de material fresco.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 233
determinAção de nitrAto
1. Com o objetivo de determinar o teor de nitrato em folhas de 
alface (Lactuca sativa L.), pesou-se 500mg de folhas frescas e 
triturou-se em homogeneizador de tecidos na presença de 
10mL de etanol a 80%. Em seguida, o macerado foi filtrado 
utilizando-se mais 10mL de etanol a 80%. Adicionou-se 20mL 
de clorofórmio e agitou-se, desprezando a fração mais densa 
e recolhendo a menos densa em tubo rosqueável. Pipetou-se 
para um tubo de ensaio: 0,2mL do extrato aquoso e 0,8mL de 
ácido salicílico a 5% em H2SO4. Agitou-se e mediu-se a absor-
bância encontrando-se uma leitura igual a 0,200. Sabendo-se 
que as leituras efetuadas com as soluções padrões de nitrato 
produziram a equação y = 0,01x – 0,1, calcule a concentração 
de nitrato nas folhas de alface analisadas.
determinAção dA AtiVidAde 
dA nitrAto redutAse
1. Utilizando os dados fornecidos abaixo, referentes a um en-
saio com a nitrato redutase, represente graficamente, a ativi-
dade da enzima em função do tempo de reação. Expresse a 
atividade em termos de µmol do produto da reação por gra-
ma de tecido.
234 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Dados referentes às soluções 
padrões
Dados referentes 
à amostra
Curva Padrão 
(µM de nitrito)
L. E.
(abs. x 103)
T.R. 
(minuto)
L.E.
 (abs. x 103)
0 0 10 200
10 200 20 350
20 400 30 450
30 600 40 530
40 800 50 580
50 1000 60 600
L.E.: leitura espectrofotométrica; T.R.: tempo de reação
Para o exemplo acima, foram pesados 250mg da amostra (fo-
lha) e incubada em 5,0mL do meio de incubação.
2. Utilizando os métodos de Michaelis-Menten, Lineweaver-
Burk e Eadie-Hofstee, represente graficamente e determine 
os valores de KM e Vmax da enzima cujos resultados de sua 
atividade são representados na tabela abaixo. Identifique que 
tipo de inibidores são os que atuam sobre a enzima do exem-
plo abaixo.
Concentração do Produto da Reação Enzimática 
Expressa em mM, Aos 5 E 10 Segundos após o Início da 
Reação, na Ausência e na Presença de Inibidores.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 235
C.S. 
(mM)
Sem Inibidor Com Inibidor A Com Inibidor B
5 seg. 10 seg. 5 seg. 10 seg. 5 seg. 10 seg.
1 0,223 0,445 0,167 0,333 0,185 0,370
2 0,363 0,727 0,286 0,572 0,303 0,607
4 0,533 1,067 0,444 0,888 0,444 0,888
6 0,632 1,263 0,546 1,092 0,527 1,053
10 0,741 1,482 0,667 1,333 0,618 1,235
15 0,811 1,622 0,750 1,500 0,676 1,352
C.S.: concentração do substrato; 5 e 10 seg. significam 
respectivamente 5 segundos e 10 segundos após o iní-
cio da reação.
determinAção de ClorofilA 
pelo método espeCtrofotométriCo
1. Com o objetivo de quantificar o teor de clorofila em folhas de 
tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill), pesou-se 200mg de 
folhas frescas, transferiu-se para um tubo de ensaio apropria-
do e adicionou-se 10mL de acetona a 80%. Posteriormente este 
material foi triturado e filtrado para um balão volumétrico de 
25mL, completando-se o volume com o mesmo solvente uti-
lizado na etapa de trituração. Calcule a concentração de clo-
rofila A e clorofila B nas folhas de tomateiro, expressando os 
resultados em mg de clorofila por grama de folhas frescas.
236 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
determinAção de VitAminA C
1. Calcule o teor de vitamina C no suco de um limão, sabendo-
se que 2,0mL do mesmo foi titulado gastando-se 4,1mL de in-
dofenol. Para a padronização do indofenol, usou-se 2,0mL de 
solução de ácido ascórbico (1000 mg.L-1), gastando-se 16,0mL 
do indofenol. Na realização da prova em branco, gastou-se 
0,1mL do indofenol.
2. Para a determinação de vitamina C em suco de acerola, três 
frutas foram espremidas e em seguida filtradas em tecido de 
náilon de malha fina. O suco foi diluído, tomando-se 1,0mL 
do mesmo e completando-se o volume para 100mL com água 
destilada. Em seguida, 2,0mL do suco diluído foi titulado, 
gastando-se 3,2mL de indofenol. Calcule o teor de vitamina C 
no suco da acerola acima, sabendo-se que na prova em bran-
co gastou-se 0,1mL de indofenol e que na padronização do 
indofenol foi gasto 15,5mL do mesmo. Para a padronização 
do indofenol, foram usados 2,0mL de ácido ascórbico na con-
centração de 1,0mg.mL-1.
determinAção de fÓsforo
1. Para a análise do teor de fósforo de uma amostra vegetal, 
pesou-se 200mg da amostra preparada, procedeu-se a calci-
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 237
nação da mesma e em seguida o resíduo mineral foi diluído 
para 50mL. Calcule a percentagem de fósforo desta amostra, 
sabendo-se que a leitura colorimétrica do extrato da amostra 
foi igual a 100 (Absorbância x 103). As soluções padrões de 20 
e 60mg.L-1 de P apresentaram respectivamente as leituras 50 
e 150 (A x 103).
2. Em uma determinação de cinzas pesou-se 2,5000g de uma 
amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 375mg 
de R.M. Desta cinza foi feita uma diluição para um volume 
de 100mL e em seguida os procedimentos necessários para a 
análise do teor de fósforo. A leitura colorimétrica do extrato 
foi igual a 96 (Absorbância x 103). Calcule a percentagem de 
fósforo na amostra acima, bem como nas cinzas, sabendo-se 
que a equação referente às leituras com as soluções padrões 
foi y = a.x, o coeficiente angular foi igual a 3,5. Considere que 
as leituras colorimétricas com as soluções padrões foram ob-
tidas com unidades de concentração em partes por milhão.
3. Em uma determinação de fósforo pesou-se 1,6000g de uma 
amostra preparada, procedeu-se a digestão da mesma e em 
seguida o extrato foi diluído, completando-se o volume para 
200mL. A leitura colorimétrica com o extrato da amostra foi 
igual a 50 (Absorbância x 103) e as leituras colorimétricas com 
soluções padrões em concentrações expressas em ppm, pro-
238 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
duziram a equação y = 2,5x. Calcule:
a. Quantos ppm de fósforo tem a amostra preparada.
b. Qual a percentagem de fósforo na amostra preparada.
c. Quantos gramas de fósforo contém 1,4 quilogramas de 
amostra preparada.
d. Quantos miligramas de fósforo contém em 8 gramas de 
matéria seca, sabendo-se que a umidade da amostra pre-
parada é de 20,00%.
4. Em uma determinação de fósforo pesou-se 2,0000g de uma 
amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 0,2000g 
de R.M. As cinzas foram solubilizadas e diluídas para um 
volume de 50mL. Com este extrato, procedeu-se as opera-
ções necessárias à análise de fósforo, obtendo-se uma leitura 
colorimétrica de 144 (Absorbância x 103). Sabendo-se que as 
soluçõespadrões de 10 e 50mg.L-1 produziram uma leitura 
colorimétrica de 30 e 150 (A x 103), respectivamente, pede-se 
para calcular:
a. A percentagem de P e de P2O5 na amostra acima;
b. A percentagem de P e de P2O5 nas cinzas.
05. Admitindo-se que a amostra referente ao problema anterior 
(nº 4) trata-se de uma amostra preparada que contém 16,00% 
de umidade, e que a umidade de campo da mesma é de 
79,00%, calcule quantas toneladas de P2O5 são “incorporadas” 
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 239
ao solo em uma área de 5,0 hectares com a queima da cultura 
em apreço, nas condições naturais. Considere que no período 
da queima, a produtividade da biomassa (matéria fresca) é de 
60 toneladas por hectare.
6. Para a análise do teor de fósforo de uma amostra vegetal, 
pesou-se 300mg da amostra preparada, procedeu-se a calci-
nação da mesma e em seguida o resíduo mineral foi diluído 
para 50mL. Calcule a percentagem de fósforo desta amostra, 
sabendo-se que a leitura colorimétrica do extrato da amostra 
foi igual a 120 (Ax103). As soluções padrões de 30 e 50mg.L-1 de 
P apresentaram respectivamente as leituras 60 e 140 (Ax103).
7. Em uma determinação de resíduo mineral pesou-se 3,7000g 
de uma amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 
436mg de R.M. Desta cinza foi feita uma diluição para um vo-
lume de 100mL e em seguida os procedimentos necessários 
para a análise do teor de fósforo. A leitura colorimétrica do 
extrato foi igual a 72 (Absorbância x 103). Calcule a percenta-
gem de fósforo na amostra acima, bem como nas cinzas, sa-
bendo-se que a equação referente às leituras com as soluções 
padrões foi y = ax. O coeficiente angular foi igual a 2,5. Con-
sidere que as leituras colorimétricas com as soluções padrões 
foram obtidas com unidades de concentração em mg.L-1.
240 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
8. Na determinação de fósforo pesou-se 1,5000g de uma amostra 
preparada de folhas de goiabeira (Psidium guajava), prodeceu-
se a digestão da mesma e em seguida o extrato foi diluído, 
completando-se o volume para 200mL. A leitura colorimétri-
ca com o extrato da amostra foi igual a 80 (Ax103) e as leituras 
colorimétricas com soluções padrões em concentrações ex-
pressas em mg.L-1, produziram a equação y = 2,5x. Calcule:
a) Quantos mg.kg-1 de fósforo tem a amostra preparada.
b) Qual a percentagem de fósforo na amostra preparada.
c) Quantos gramas de fósforo contém 3,7 quilogramas de 
amostra preparada.
d) Quantos miligramas de fósforo contém em 6 quilo-
gramas de matéria seca, sabendo-se que a umidade da 
amostra preparada é de 18,00%.
9. Em uma determinação de fósforo pesou-se 2,2000g de uma 
amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 0,2000g 
de R.M. As cinzas foram solubilizadas e diluídas para um vo-
lume de 50mL. Com este extrato, procedeu-se as operações 
necessárias à análise de fósforo, obtendo-se uma leitura colo-
rimétrica de 144 (Ax103). Sabendo-se que as soluções padrões 
de 10 a 50mg.L-1 produziram uma leitura colorimétrica de 30 
e 150 (Ax103), respectivamente, pede-se para calcular:
a) A percentagem de P e de P2O5 na amostra acima;
b) A percentagem de P e de P2O5 nas cinzas.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 241
10. Considerando que a amostra referente ao problema anterior 
(nº 9) trata-se de uma amostra preparada contendo 13,00% de 
umidade e que a umidade de campo da mesma é de 82,00%, 
calcule quantos megagramas de P2O5 são “incorporados” ao 
solo em uma área de 8,0 hectares com a queima total da cul-
tura em questão, nas condições naturais. Considere que no 
período da queima, a produtividade da biomassa (matéria 
fresca) é de 70 toneladas por hectare.
determinAção de enxofre
1. Para a determinação de enxofre em uma amostra vegetal, 
pesou-se 0,5g de uma amostra pré-seca, procedeu-se a diges-
tão e em seguida a diluição do extrato nitro-perclórico para 
um volume final de 50mL. No extrato nitro-perclórico pro-
cedeu-se as etapas necessárias à leitura espectrofotométrica, 
cuja absorbância foi 0,250. Calcule o teor (g kg-1) de enxofre na 
amostra analisada, sabendo-se que as leituras obtidas com as 
soluções padrões de enxofre foram 0,100; 0,200; 0,300; 0,400 e 
0,500 respectivamente para as concentrações de 10, 20, 30, 40 
e 50mg.L-1.
2. Na determinação do teor de enxofre de uma amostra prepa-
rada de folhas de sorgo forrageiro (Sorghum bicolor (L.) Moen-
ch) encontrou-se os seguintes resultados:
242 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
• Peso da amostra preparada que foi digerida quimica-
mente: 2,0g;
• Peso final do extrato, após a adição de água destilada: 
100g;
• Equação de regressão linear obtida a partir das leituras 
dos padrões de S: y = 0,01x;
• Leitura do extrato da amostra (em absorbância): 0,200.
Calcule a concentração de enxofre na amostra preparada, ex-
pressando os resultados em g kg-1. 
Qual o teor de S nas condições de campo, sabendo que a umida-
de da amostra preparada foi de 10% e nas condições de cam-
po a umidade foi de 55%.
determinAção de Cloreto
Calcule o teor de cloreto na amostra (m.s.), admitindo que para 
a sua determinação, pesou-se 500mg da mesma (m.s.), proce-
deu-se a extração e o volume final do extrato foi completado 
para 25mL com água deionizada. Na titulação de 10mL do 
extrato, gastou-se 4mL de nitrato de prata 0,025 N. Expressar 
o resultado em mg.g-1 (m.s.).
OBS.: Estequiometricamente, 1,0mL de nitrato de prata 0,025 
N equivale a 0,8863mg de cloreto.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 243
determinAção de sÓdio e potássio
1. Calcule o teor de sódio e de potássio em uma amostra vegetal 
que apresentou os seguintes resultados de análise:
a. Quantidade da amostra analisada: 2,00g;
b. Diluição das cinzas (volume total do extrato): 100mL;
c. Leitura referente a sódio no extrato concentrado (antes 
da diluição): 2;
d. Leitura referente a potássio no extrato diluído (após a 
diluição de 1:50): 15;
e. Valores das leituras da curva padrão de sódio e potássio:
0mg.L-1 = 0 4mg.L-1 = 8 8mg.L-1 = 16
2mg.L-1 = 4 6mg.L-1 = 12 10mg.L-1 = 20
2. Para a análise dos elementos minerais, foi pesado 2,5000g de 
uma amostra, feita a calcinação e em seguida o resíduo mine-
ral foi diluído e completado o volume para 200mL. Com este 
extrato foi realizada a leitura fotométrica para sódio, obtendo 
7,5. Para obter a leitura fotométrica referente ao potássio, foi 
necessário proceder uma diluição no extrato, na proporção de 
1:100. Após esta diluição, a leitura fotométrica para potássio 
foi igual a 4,5. Calcule o teor destes dois elementos minerais 
na amostra analisada, sabendo-se que a leitura fotométrica 
com as soluções padrões de Na+ e K+ na faixa de 0 a 10mg.L-1 
produziram a equação y = 1,5 x.
244 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
3. Considere que a amostra do problema anterior trata-se de 
uma amostra preparada de batata inglesa (Solanum tubero-
sum) contendo 12,00% de umidade, e que a mesma amostra 
nas condições de campo apresentou 47,20% de umidade. 
Com base nestes dados e resultados do problema anterior, 
calcule quantos quilogramas de potássio são exportados do 
solo pela colheita da batata inglesa, em uma área de 2 hec-
tares, admitindo que a produtividade desta cultura é de 25 
toneladas por hectare.
determinAção de nutrientes minerAis por eAA
1. Em uma determinação de cálcio em folhas de mangueira 
(Mangifera indica L.), pesou-se 0,5g da amostra foliar pré-seca 
e promoveu-se a digestão nitro-perclórica. Após a digestão, o 
material digerido foi transferido quantitativamente para um 
frasco de plástico de tara iguala 10,0000g. Em seguida o con-
junto frasco de plástico mais extrato foi pesado resultando 
em 60,0000g. As leituras (em concentração) dos padrões de 
cálcio no espectrofotômetro de absorção atômica produziram 
uma equação de regressão linear igual a y = 0,9637x – 0,02214 
(r = 0,9988). O extrato nitro-perclórico foi diluído (1:25) em clo-
reto de estrôncio. A leitura do extrato nitro-perclórico diluído 
foi igual a 0,2336. Calcule o teor de cálcio nas folhas da man-
gueira, expresse o resultado em g kg-1.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 245
2. Na análise da concentração de magnésio em folhas de goia-
beira (Psidium guajava L.), pesou-se 0,5g da amostra foliar 
pré-seca e promoveu-se a digestão nitro-perclórica. Poste-
riormente, o material digerido foi transferido quantitativa-
mente para um frasco de plástico de tara igual a 9,6090g. Em 
seguida o conjunto frasco de plástico mais extrato foi pesado 
resultando em 58,8245g. As leituras (em concentração) dos 
padrões de magnésio no espectrofotômetro de absorção atô-
mica produziram uma equação de regressão linear igual a 
y = 0,9985x – 0,03362 (r = 0,9998). A leitura do extrato nitro-
perclórico diluído 21 vezes em cloreto de estrôncio 1,52% foi 
igual a 0,2336. Calcule o teor de magnésio nas folhas da goia-
beira, expresse o resultado em g kg-1.
3. Para analisar o teor de micronutrientes metálicos em amos-
tra de palma forrageira (Opuntia ficus-indica, Mill) pesou-se 
400mg da amostra pré-seca e procedeu-se a digestão nitro-
perclórica. Com o digerido preparou-se 52g de extrato. As 
leituras efetuadas no espectrofotômetro de absorção atômica 
(em modo concentração) revelaram os seguintes resultados:
246 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Micro-
Nutriente
Equação de Regressão Leitura do Extrato 
Nitro-Perclórico
Cobre Y = 1,0189 X – 0,003792 0,1248
Ferro Y = 0,70048 X – 0,03567 0,3847
Manganês Y = 1,1970 X + 0,03696 0,2458
Zinco Y = 0,9897 X + 0,01259 0,6348
Com base nestes resultados calcule o teor de cada nu-
triente analisado, expressando os resultados em mg.kg-1 
de matéria seca.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 247
pAdronizAção 
de soluções
i. introdução
Solução padrão é considerada aquela cuja concentração é 
rigorosamente precisa, de forma que a mesma possa ser em-
pregada como referencial para a análise quantitativa de deter-
minados compostos ou íons. Nem todos os reagentes quími-
cos devem ser usados para se preparar, a priori, uma solução 
padrão. Para se preparar uma solução padrão, deve-se partir 
de um composto (reagente químico) considerado como padrão 
primário. Para que uma substância possa servir como padrão 
primário, são necessários alguns requisitos, como: o reagente 
deve ser bastante estável, isto é, que não seja higroscópico, não 
se oxide e nem se decomponha com facilidade, deve ser bastan-
te solúvel, além de outras qualidades desejáveis.
ii. solução pAdrão de CArBonAto 
de sÓdio (nA2Co3) 0,05n
1. Pegar uma cápsula de porcelana* e acrescentar cerca de 5 gra-
mas de carbonato de sódio anidro (Na2CO3, Eq.: 52,995) e P.A.;
2. Colocar em estufa regulada a 105°C por duas horas;
An
ex
o 
5
248 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
3. Transferir para um dessecador contendo sílica-gel bem ativa-
da e deixar esfriar por cerca de 30 minutos;
4. Pesar exatamente 2,6500 gramas do carbonato de sódio ani-
dro, transferir para um béquer de 250mL e dissolver com 
água deionizada;
5. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 
1000mL e completar o volume com água deionizada;
6. Homogeneizar e transferir para um frasco de vidro âmbar 
devidamente etiquetado;
* Toda vidraria utilizada nas operações de preparo de solução 
padrão deve ser rigorosamente lavada e seca. Também é reco-
mendado o máximo de rigor e precisão possível em todas as 
operações envolvendo o preparo de uma solução padrão.
iii. prepAro dA solução pAdrão 
de h2so4 0,05n
Cálculo:
Volume total a preparar: 2 litros;
Fonte: ácido sulfúrico (P.A.) concentrado (36N)
Cálculo do volume de ácido concentrado: 
N . V = N’ . V’
36N . V = 0,05N . 2000mL
V = 2,777mL
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 249
Procedimento
1. Pegar um balão volumétrico 2000mL, adicionar cerca de 
1000mL de água deionizada e em seguida acrescentar 2,8mL 
de H2SO4 (36N). Neste caso pode ser empregada uma pipeta 
graduada, mas não deve ser pipetado com a boca;
2. Completar o volume do balão volumétrico com água deioni-
zada, homogeneizar bastante e em seguida padronizar.
iV. pAdronizAção do áCido sulfúriCo 
Com CArBonAto de sÓdio
1. Enxaguar uma bureta devidamente limpa, com uma solução 
padrão de carbonato de sódio (0,05 N);
2. Encher e zerar a bureta com o carbonato de sódio menciona-
do no item anterior;
3. Pipetar para um erlenmeyer de 50mL, 10,0mL da solução do 
ácido sulfúrico a ser padronizada (0,05N). Neste caso é reco-
mendado usar uma pipeta volumétrica;
4. Acrescentar duas ou três gotas do indicador vermelho de me-
tila ou alaranjado de metila;
5. Titular a solução de ácido sulfúrico com o carbonato de sódio 
(padrão) até a mudança de cor;
6. Anotar o volume gasto e repetir a titulação mais duas vezes;
7. Tirar a média do volume de carbonato de sódio gasto e proce-
der com o cálculo da normalidade empregando a equação de 
250 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
volumetria: N.V = N’.V’. Se necessário corrigir a concentração 
do ácido. Do contrário, anotar a normalidade exata e guardar 
o ácido padronizado em frasco escuro ou utilizar conforme a 
necessidade.
V. prepAro de solução pAdrão 
de áCido oxáliCo 0,05 n.
1. Preparar 1000mL. Pesar 3,1525g de ácido oxálico dihidratado;
2. Transferir para um béquer de 500mL, acrescentar cerca de 
200mL de água deionizada e dissolver com o auxílio de bas-
tão de vidro;
3. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 
1000mL, completar o volume do balão volumétrico com água 
deionizada;
4. Homogeneizar e transferir para um frasco de vidro limpo e 
devidamente etiquetado.
OBS.: Ácido oxálico dihidratado (C2H2O4.2H2O), PM=126,1 e 
Eq=63,05
Vi. prepAro e pAdronizAção 
de hidrÓxido de sÓdio 0,05n
Preparo de 1000 mL de hidróxido de sódio 0,05N
1. Pesar 0,21g de hidróxido de sódio (P.A.);
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 251
2. Transferir para um béquer de 500mL;
3. Dissolver em cerca de 200mL de água deionizada;
4. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 
1000mL e completar o volume com água deionizada. 
Padronização do hidróxido de sódio.
 1. Encher uma bureta com ácido oxálico 0,05 N (padrão) e em 
seguida zerar a mesma; 
2. Pipetar para um erlenmeyer de 50mL, exatamente 10mL da 
base a ser padronizada. Neste caso é recomendado usar uma 
pipeta volumétrica;
3. Acrescentar duas ou três gotas do indicador fenoftaleína;
4. Titular a até a mudança de cor (vermelho para incolor);
5. Anotar o volume gasto e repetir a titulação mais duas vezes;
7. Tirar a média do volume gasto e proceder com o cálculo da 
normalidade empregando a fórmula N.V = N’.V’. Se neces-
sário corrigir a concentração da base. Do contrário, anotar a 
normalidade exata e guardar a base padronizada em frasco 
escuro ou utilizar conforme a necessidade. Esta solução não 
tem muita durabilidade, portanto deve ser usada em menos 
de uma semana.
OBS.: Alternativamente pode-se titular potenciometricamente 
até pH 8,0.
Solução de fenolftaleína. Dissolver 1,0g de fenolftaleína em 
60mL de etanol e em seguida completar o volume para 100mL. 
252 | Análises Químicas e Bioquímicas em PlantasEste indicador é incolor em pH abaixo de 8,3 e vermelho em pH 
acima de 9,8.
Vii. BiBliogrAfiA
ASSUMPÇÃO, R.M.V.; MORITA, T. Manual de soluções, reagentes e 
solventes. São Paulo: Edgard Blücher, 1969. 627p. 
OHLWEILER, Otto Alcides. Química analítica quantitativa. 2. ed. 
Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1988. v. 2, 226p.: il.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 253
Composição BromAtolÓgiCA 
AproximAdA de AlgumAs 
hortAliçAs, frutAs e CulturAs 
de lArgA esCAlA
Cultura U 
(%)
RM 
(%)
PB 
(%)
CHO 
(%)
EE 
(%)
FB 
(%)
Abóbora 96,10 n.a. 1,20 9,80 0,30 1,30
Alface 95,00 n.a. 1,20 2,30 0,20 1,10
Batata ingl. 83,00 n.a. 1,80 17,60 0,10 0,40
Beterraba 87,00 n.a. 3,00 9,00 0,10 1,10
Cenoura 88,00 n.a. 1,20 10,70 0,30 1,80
Chuchu 97,00 n.a. 0,90 7,70 0,20 1,70
Pepino 96,00 n.a. 0,07 2,70 0,07 0,70
Melancia 95,00 n.a. n.a. n.a. n.a. 0,50
Rabanete 94,00 n.a. traços 2,80 n.a. n.a.
Repolho 92,00 n.a. 1,40 4,30 n.a. n.a.
Tomate 94,00 n.a. 1,00 3,40 0,30 1,00
Abacate n.a. n.a. 2,15 5,63 n.a. n.a.
Abacaxi n.a. n.a. 0,40 13,70 0,20 n.a.
Banana n.a. n.a. 1,40 26,00 0,25 n.a.
Coco 12,00 n.a. 5,70 27,90 50,60 n.a.
An
ex
o 
6
254 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Cultura 
(Cont.)
U 
(%)
RM 
(%)
PB 
(%)
CHO 
(%)
EE 
(%)
FB 
(%)
Goiaba n.a. n.a. 0,75 7,98 n.a. n.a.
Mamão n.a. n.a. 0,20 14,50 n.a. n.a.
Manga n.a. n.a. 1,00 27,6 n.a. n.a.
Arroz 12,00 1,20 7,50 76,00 1,90 0,60
Batata doce 70,00 1,30 1,92 32,00 0,50 1,30
Feijão 13,00 3,50 22,89 61,93 1,49 3,00
Mandioca 60,00 0,50 2,00 33,00 0,20 n.a.
Milho 10,00 1,60 11,80 70,00 4,50 2,00
OBS.: Valores expressos em relação à matéria fresca.
Compilado de diversos autores. n.a. = não apresentado
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 255
prinCípios BásiCos de Análise 
espeCtrofotométriCA
A espectrofotometria é uma técnica de análise química em 
que se determina a concentração de espécies químicas (íons, 
átomos, moléculas) pela absorção de energia radiante (energia 
luminosa ou luz).
A energia luminosa tem propriedades ondulatórias e 
corpusculares e se propaga no espaço a grandes velocida-
des, em geral em linha reta. As características ondulatórias 
são definidas entre outros parâmetros pelos diversos com-
primentos de onda (representados pela letra grega lambda 
(λ), e geralmente expresso em termos de nanômetro (nm = 
10-9 m). Por outro lado, as propriedades corpusculares refe-
rem-se ao fato da radiação ser constituída por partículas de 
energia, denominada de fótons, cuja energia é denominada 
de energia quântica e é calculada pela expressão: E = hν, em 
que E representa a energia (expressa em Joules), a letra gre-
ga ni (ν) a freqüência de onda (em Hertz, Hz) e h a constante 
de Planck, cujo valor é 6,6256 x 10-34 Js. Sabe-se também que 
ν = c/λ, onde o valor de c corresponde a velocidade de uma 
onda eletromagnética no vácuo, conhecido também como a 
velocidade da luz, que possui o valor de 3 x 1010 cm.s-1. Daí, 
percebe-se que um fóton de alta freqüência (baixo compri-
An
ex
o 
7
256 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
mento de onda) é mais energético do que um fóton de baixa 
freqüência (alto comprimento de onda). 
A faixa de comprimento de onda das várias regiões do es-
pectro eletromagnético encontra-se no quadro a seguir.
Comprimento de Onda (nm) Região do Espectro Luminoso
0,1 - 100 Raios X
100 - 400 Ultravioleta
400 - 800 Visível
800 - 5000 Infravermelho
5000 - 30000 Microonda
A luz tem a propriedade de interagir com a matéria e quando 
isso ocorre uma parte de sua energia é absorvida por elétrons 
dos átomos que compõem as moléculas e a outra parte não é 
absorvida e simplesmente atravessa a matéria e é transmitida. 
O estudo quantitativo da absorção da energia radiante por 
soluções coloridas fundamenta-se no princípio geral conhecido 
como Lei de Lambert-Beer, segundo a qual a absorvância (tam-
bém chamada de absorbância) é proporcional à concentração 
da espécie química absorvente, mantendo-se constantes o com-
primento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso 
e demais fatores. A lei de Lambert-Beer é expressa por:
A = D.O. = a.b.c = log I0/I
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 257
Onde A = absorvância
D.O. = densidade ótica
I0 = intensidade de radiação incidente na solução
I = intensidade de radiação emergente (ou transmitida)
a = coeficiente de absorção (ou índice de absortividade), carac-
terístico do soluto
b = espessura da camada de solução atravessada pelo feixe lu-
minoso
c = concentração do soluto na solução.
A escala de transmitância (T%) é dada por:
T = 100 I / I0 
Nota-se, portanto que quando a absorbância é igual a zero, 
não há absorção da luz devido à substância ser totalmente inco-
lor (na sensibilidade do aparelho), apresentando cem por cento 
de transmitância. O oposto ocorre quando o valor da absorbân-
cia tende ao infinito, com absorção completa, no caso de solução 
preta, tendo-se então valor zero de transmitância. Uma solução 
de uma dada cor absorverá preferencialmente, a radiação lu-
minosa da cor complementar, conforme o quadro de escala de 
cores a seguir. 
258 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Tabela 1. Comprimentos de ondas referentes às cores da radia-
ção visível
Comprimento 
de Onda (nm)
Cor Complemento
400 - 465 Violeta Verde-amarelo
465 - 482 Azul Amarelo
482 - 487 Azul-esverdeado Alaranjado
487 - 493 Turquesa Vermelho alaranjado
493 - 498 Verde-azulado Vermelho
498 - 530 Verde Vermelho púrpura
530 - 559 Verde-amarelado Púrpura-avermelhado
559 - 571 Amarelo-verde Púrpura
571 - 576 Amarelo-esverdeado Violeta
576 - 580 Amarelo Azul
580 - 587 Laranja-amarelado Azul
587 - 597 Alaranjado Azul-esverdeado
597 - 617 Laranja-avermelhado Turquesa
617 - 780 Vermelho Turquesa
FONTE: EWING. Gelen Wood. Métodos instrumentais de análise química. 
v.1. Ed. Edgard Blücher, Sao Paulo. 296 p. 1972.
Assim, da expressão anterior pode-se deduzir: 
I / I0 = T / 100
I0 /I = 100 / T
Desse modo, log (I0 / I) = log (100 /T)
Então A = log 100 – log T
E finalmente, A = 2 – log T.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 259
O equipamento utiliado para medir a intensidade de ra-
diação transmitida por uma solução é chamado de espec-
trofotômetro, ou simplesmente fotômetro (Figura 1), o qual 
é constituído pelos seguintes componentes:
•Uma fonte luminosa, que pode ser uma lâmpada de tungs-
tênio ou de hidrogênio (deutério);
•Um seletor de comprimento de onda, que pode ser um fil-
tro ótico ou monocromador à base de prisma ou de rede 
de difração. Quando o aparelho é provido de filtro ótico 
ele é chamado de fotocolorímetro ou fotômetro, por outro 
lado, quando é provido de monocromador de prisma ou 
de rede de difração é denominado de espectrofotômetro. 
•Um compartimento para a amostra, onde se coloca a cube-
ta, de quartzo para leituras na região do ultravioleta abai-
xo de 350nm, ou de vidro para leituras em comprimentos 
de onda de 350nm a 2µm;
• Uma célula fotoelétrica (detectores de radiação visível e 
ultravioleta, são transdutores que convertem a energia ra-
diante em sinal elétrico);
• Um sistema de amplificação, constituído de tubos foto-
multiplicadores de medida do sinal elétrico (potenciôme-
tro, medidor de potencial elétrico);
• Um mostrador com a finalidade de expor as leituras es-
pectrofotométricas (absorbância ou transmitância). Ge-
260 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas 255�
�
 
 
Figura 1. Esquema dos componentes de um 
espectrofotômetro ou colorímetro.FM = fotomultiplicador ou fototubo. 
 
 
 
BIBLIOGRAFIA 
HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa. 7ª Ed. 
São Paulo: LTC, 2008. 886p. 
KOBAL JÚNIOR, J.; SARTORIO, L. Manual de Análise 
Instrumental. 1ª Ed. São Paulo: Moderna, 1978. 68p. 
MENDHAM, J., DENNEY, R.C.; BARNES, J.D. Vogel – 
Análise Química Quantitativa. 6ª Ed.. São Paulo: LTC, 
2002. 464p. 
OHLWEILER, Otto Alcides. Fundamentos de Análise 
Instrumental. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e 
Científicos, 1988. 486p. 
ralmente estes aparelhos podem ser acoplados à um re-
gistrador, impressora ou computador.
 
Figura 1. Esquema dos componentes de um espectrofotômetro ou colo-
rímetro. 
FM = fotomultiplicador ou fototubo.
BiBliogrAfiA
HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa. 7ª Ed. São Paulo: 
LTC, 2008. 886p.
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1ª Ed. São Paulo: Moderna, 1978. 68p.
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Química Quantitativa. 6ª Ed.. São Paulo: LTC, 2002. 464p.
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Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1988. 486p.
ROBYT, J.F.; WHITE, B.J. Biochemical techniques: theory and 
practice. London: Academic Press. 1990. 407p.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 261
tABelA de eynon-lAne pArA 
Análise de AçúCAres, titulAndo 
10 ml dA solução de soxhlet
V.S.A. 
(mL)
Sacarose contida em 100 mL da solução Glicose
(mg)0 g 1 g 5 g 10 g 25 g
mg de açúcar invertido
15 50,5 49,9 47,6 46,1 43,4 49,1
16 50,6 50,0 47,6 46,1 43,4 49,2
17 50,7 50,1 47,6 46,1 43,4 49,3
18 50,8 50,1 47,6 46,1 43,3 49,3
19 50,8 50,2 47,6 46,1 43,2 49,4
20 50,9 50,2 47,6 46,1 43,2 49,5
21 51,0 50,3 47,6 46,1 43,2 49,5
22 51,0 50,3 47,6 46,1 43,1 49,6
23 51,1 50,3 47,6 46,1 43,0 49,6
24 51,2 50,3 47,6 46,1 42,9 49,8
25 51,2 50,4 47,6 46,0 42,8 49,8
26 51,3 50,4 47,6 46,0 42,8 49,9
27 51,4 50,4 47,6 46,0 42,7 49,9
28 51,4 50,5 47,7 46,0 42,7 50,0
29 51,5 50,5 47,7 46,0 42,6 50,0
30 51,5 50,5 47,7 46,0 42,5 50,1
31 51,6 50,6 47,7 45,9 42,5 50,2
32 51,6 50,6 47,7 45,9 42,4 50,2
33 51,7 50,6 47,7 45,9 42,3 50,3
An
ex
o 
8
262 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
V.S.A. 
(mL)
Sacarose contida em 100 mL da solução Glicose
(mg)0 g 1 g 5 g 10 g 25 g
mg de açúcar invertido
34 51,7 50,6 47,7 45,8 42,2 50,3
35 51,8 50,7 47,7 45,8 42,2 50,4
36 51,8 50,7 47,7 45,8 42,1 50,4
37 51,9 50,7 47,7 45,7 42,0 50,5
38 51,9 50,7 47,7 45,7 42,0 50,5
39 52,0 50,8 47,7 45,7 41,9 50,6
40 52,0 50,8 47,7 45,6 41,8 50,6
41 52,1 50,8 47,7 45,6 41,8 50,7
42 52,1 50,8 47,7 45,6 41,7 50,7
43 52,2 50,8 47,7 45,5 41,6 50,8
44 52,2 50,9 47,7 45,5 41,5 50,8
45 52,3 50,9 47,7 45,4 41,4 50,9
46 52,3 50,9 47,7 45,4 41,4 50,9
47 52,4 50,9 47,7 45,3 41,3 51,0
48 52,4 50,9 47,7 45,3 41,2 51,0
49 52,5 51,0 47,7 45,2 41,1 51,1
50 52,5 51,0 47,7 45,2 41,0 51,1
V.S.A.: volume da solução analisada. 
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de ali-
mentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.
Cont.
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 263
ConCentrAção de Alguns áCidos 
Comuns em lABorAtÓrios
Ácidos %em peso
D
(g/mL)
° Be N
Ácido acético glacial DAB. 6 96 1,06 8 17
Ácido acético glacial 99-100% 99-100 1,06 8 18
Ácido acético diluídoDAB. 6 30 1,04 5,4 5
Ácido clorídrico DAB. 6 25 1,12 16 8
Ácido clorídrico conc. 32 1,16 20 10
Ácido clorídrico conc. 36 1,18 22 12
Ácido clorídrico fumegante 38 1,19 23 12,5
Ácido fórmico 98-100 1,22 26 26
Ácido fosfórico DAB. 6 25 1,15 19 9
Ácido fosfórico conc. 85 1,69 59 45
Ácido fosfórico conc. 89 1,75 62 48
Acido nítrico DAB. 6 25 1,15 18,6 5
Acido nítrico concentrado 65 1,40 41 14
Ácido nítrico fumegante 99* 1,51 49 21
Ácido sulfúrico concentrado 95-96 1,84 66 36
Ácido sulfúrico diluído DAB. 6 16 1,11 14 4
Ácido sulfúrico fumegante ** - 1,99 72 -
 Anidrido acético 90 1,07 10 -
 * valores aproximados. ** ≈ 65 % SO3
-
 Fonte: E. MERCK AG. Tabelas Auxiliares. Darmstad: E. Merck, s.d. 22 p.
 
An
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9
264 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
An
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10 teores AdeQuAdos de nutrientes 
minerAis nAs folhAs 
pArA diVersAs CulturAs
Cultura
N P K Ca Mg S
g Kg-1
Abacate 17,5-18,5 0,8-2,5 7,5-20,0 10,0-30,0 2,5-8,0 2,0-6,0
Abacaxi 20,0-22,0 2,1-2,3 25,0-27,0 3,0-4,0 4,0-5,0 2,0-3,0
Abóbora(a) 30,0-35,0 6,0-7,0 24,0-26,0 48,0-49,0 9,0-10,5 -
Alface 34,0-40,0 4,0-6,0 50,0-80,0 14,0-20,0 3,0-7,0 -
Algodão 32,0 1,7 15,0 20,0 5,0 4,0
Alho 30,0-0,0 3,0 20,0-0,0 1,0-6,0 1,5-3,0 3,0-15,0
Amendoim 40,0 2,0 15,0 20,0 3,0 2,5
Arroz 30,0-40,0 1,4-2,7 14,0-28,0 1,6-3,9 1,2-2,1 1,7-2,0
Aspargo 29,5-49,0 1,8-3,5 11,6-26,4 8,6-17,6 2,7-7,0 -
Banana 26,0 2,2 28,0 6,0 3,0 2,0
Batata 55,0-65,0 3,5-5,5 45,0-65,0 10,0-20,0 3,0-5,0 -
Cacau 28,0 2,0 33,0 3,0 4,0 3,0
Café 28,0 1,2 18,0 10,0 3,5 2,0
Cana de açúcar 16,0 1,2 12,0 4,0 2,0 2,0
Cebola 25,0-35,0 2,5-4,0 25,0-50,0 15,0-35,0 3,0-5,0 -
Cenoura 26,0 3,1 29,0-33,0 14,0-30,0 3,0-5,5 -
Citros 22,0 1,2 10,0 30,0 3,0 2,0
Coco 17,0 1,0 5,0 5,0 3,0 -
Couve-flor 25,0 5,0 25,0 35,0 - -
Feijão arranca 30,0-50,0 2,0-3,0 20,0-25,0 15,0-20,0 4,0-7,0 5,0-10,0
Feijão corda 18,0-22,0 1,2-1,5 30,0-35,0 50,0-55,0 5,0-8,0 1,5-2,0
Goiaba 22,0-26,0 1,4-1,9 14,0-20,0 7,0-15,0 2,5-4,0 2,5-3,5
Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barreto | 265
Cultura
(cont.)
N P K Ca Mg S
g Kg-1
Mamão/limbo 45,0-50,0 5,0-7,0 25,0-30,0 20,0-22,0 10,0 4,0-6,0
Mandioca 51,0-58,0 3,0-5,0 13,0-20,0 7,5-8,5 2,9-3,1 2,6-3,0
Manga 12,0-13,0 1,2-1,4 4,0-6,0 30,0-33,0 5,0-6,0 1,6-1,8
Maracujá 40,0-50,0 4,0-5,0 35,0-45,0 15,0-20,0 3,0-4,0 3,0-4,0
Milho 27,5-32,5 2,5-3,5 17,5-22,5 2,5-4,0 2,5-4,0 1,5-2,0
Pepino(a) 30,0-35,0 6,-–7,0 24,0-26,0 48,0-49,0 9,0-10,5 -
Pimentão 30,0-45,0 3,0-7,0 40,0-54,0 4,0-6,0 10,0-17,0 -
Soja 45,0-55,0 2,6-5,0 17,0-25,0 4,0-20,0 3,0-10,0 2,5
Sorgo 13,0-15,0 4,0-8,0 25,0-30,0 4,0-6,0 4,0-6,0 8,0-10,0
Tomate 30,0 3,5 40,0 14,0–18,0 4,0 3,0
Videira/limbo 15,0-25,0 2,0-4,0 12,0-20,0 20,0-35,0 3,0-6,0 -
(a) folha com pecíolo
Cultura
B Cu Fe M Zn
mg Kg-1
Abacate 15-100 5-15 50-200 30-500 30-150
Abacaxi 30-40 9-12 100-200 50-200 10-15
Alface 25-55 10-80 50-500 30-200 25-150
Algodão 50 8 - - 30
Alho 50 25 200 100 75
Amendoim 140-180 - - 110-440 -
Arroz - - 89-193 237-744 22-161
Aspargo 25-211 6-11 - 72-173 16-30
Banana 15 8 70 - 20
Batata 30-60 6-20 70-150 50-300 20-60
Cacau 32 15 - - 30
Café 40 6 70 50 10
Cana-de-açúcar 10 6 100 50 10
Cebola 30-45 6-20 - - 20-55
Cenoura 29-35 5-7 120-350 190-350 20-50
266 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas
Cultura
(cont.)
B Cu Fe M Zn
mg Kg-1
Citros 50 6 60 25 25
Couve-flor 40 5 - 60 -
Feijão de arranca 30-60 10-20 100-450 30-300 20-100
Feijão corda 150-200 5-7 700-900 400-425 40-50
Goiaba 20-25 10-40 50-150 80-180 25-35
Mamão/limbo 15 11 291 70 43
Mandioca 30-60 6-10 120-140 50-120 30-60
Manga 30 30 70 120 90
Maracujá 40-50 10-20 120-200 400-600 25-40
Milho 15-20 6-20 50-250 50-150 15-50
Pimentão 40-100 10-20 - 26-300 35-260
Soja 21-55 10-30 51-350 21-100 21-50
Sorgo 20 10 200 100 20
Tomate 50-70 10-15 500-700 250-400 60-70
Videira/limbo 25-40 12-20 60-180 80-120 25-60
Fonte: CAVALCANTI, F.J. de A. et al. Recomendações de adubação para o 
estado de Pernambuco. Recife: Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA. 
2008. p 64.
An
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Semeador
Cecília Amoroso
 
No imenso campo do mundo,
Tu és um semeador.
Semeia, mestre, semeia
Cada vez com mais amor.
Não digas que o solo é mau.
Que chove frequentemente. 
Ou o sol castiga a terra
Ou que não serve a semente.
Enfrenta as dificuldades, 
Não podes desanimar.
Aqui, no campo do mundo, 
Teu dever é semear.
Tua palavra é semente, 
Teu exemplo, teu perdão. 
É semente todo zelo
Com que dás tua lição.
É semente teu sorriso,
O teu aperto de mão.
É semente tudo, tudo
Que vem do teu coração.
Não esperas recompensa
Mas recompensa terás.
E nem, pensas em riqueza
Mas rico sei que serás.
Porque trabalhas num reino
Onde perder é ganhar,
Onde dar é receber.
Vamos, mestre, semear.
Semeia, semeia sempre.
Cada vez com mais amor.
No imenso campo do mundo,
Tu és um SEMEADOR.
Outras obras dos autores:
Métodos de Análises Químicas em Plantas (2004)
O potássio no Metabolismo Vegetal (2000)
Introdução às Técnicas Cromatográficas (2000)
Técnicas de Hidroponia (2000)
Análise Química de Tecidos e Produtos Vegetais (1994)
EDITORA
UNIVERSITÁRIA
DA UFRPE