Apostila Imunologia Clinica 2018

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INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO DE FARMÁCIA/BIOMEDICINA
ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS 
DISCIPLINA: 
IMUNOLOGIA CLÍNICA
�
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: FARMÁCIA/BIOMEDICINA
Disciplina: Imunologia Clínica
Titulo da Aula: Aglutinação
	AULA
1
OBJETIVO: mostrar ao aluno, reações de formação do complexo antígeno-anticorpo “in vitro”
Aglutinação Passiva: Determinação de Proteína C-Reativa 
Finalidade: Teste de aglutinação passiva para detecção da Proteína C-Reativa no soro humano. A Proteína C-Reativa (PCR) em altas concentrações está associada à infecções agudas, situações necróticas e a uma variedade de estados inflamatórios. A monitorização dos níveis de PCR nos permite avaliar a eficácia do tratamento e a recuperação do paciente.
Princípio: As partículas de látex são sensibilizadas com anticorpos humanos anti-PCR. Quando se mistura a suspensão de látex contendo elevados níveis de PCR, irá produzir-se uma aglutinação nítida em um período máximo de 2 minutos. 
Procedimento: Teste Qualitativo
1) Em cada círculo da placa colocar:
	
	Círculo número 1
	Círculo número 2
	Círculo número 3
	Círculo número 4
	Controle Negativo
	50(l
	-
	-
	-
	Controle Positivo
	-
	50(l
	-
	-
	Amostra número 1
	-
	-
	50(l
	-
	**Látex FR
	1 gota
	1 gota
	1 gota
	1 gota
2) Misturar com auxílio de espátula utilizando toda a extensão de cada círculo da lâmina.
3) Agitar a lâmina com movimentos circulares por dois minutos.
4) Observar os resultados.
REAÇÃO POSITIVA: Nítida aglutinação.
REAÇÃO NEGATIVA: Ausência de aglutinação (suspensão homogênea).
2) Aglutinação Passiva: Determinação de Fator Reumatóide
Finalidade: Teste de aglutinação passiva para o diagnóstico de fator reumatóide (FR).
Princípio: Partículas de látex sensibilizadas com IgG. A aglutinação é visível em amostra com concentração de FR igual ou superior a 8 UI/ml, de acordo com as referências estabelecidas.
Exercícios propostos (não obrigatório)
1) Nos testes de hamaglutinação para Toxoplasmose e doença de Chagas, pede-se:
a) Qual suporte foi empregado?
b) Realizou-se a pesquisa de anticorpos. Que tipo de antígeno foi empregado?
c) Quais cuidados devem ser observados na realização do teste?
d) Qual tipo de resposta imunológica foi ativada? Explique.
e) Suponhamos que tenha se detectado na pesquisa da paciente a presença de IgM (IgM+ - ou reagente), o que significa? Qual a relevância da positividade de uma IgM em uma gestante?
f) Qual o valor da pesquisa de IgG para a Doença de Chagas? Explique.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Descarte com hipoclorito
	
	Placa de fundo escuro (acompanha o kit)
	
	Palito para homogeneizar os reagentes (acompanha o kit) 
	
	Pipeta automática de 5(l -20(l
	
	Ponteiras amarelas (menor volume)
	
	
	
	
	
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: FARMÁCIA/BIOMEDICINA
Disciplina: Imunologia Clínica
Titulo da Aula: Aglutinação - Hemaglutinação
	AULA
2
Hemaglutinação Passiva para Doença de Chagas 
Finalidade: Teste de hemaglutinação passiva para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas.
Princípio: Hemácias de aves estabilizadas e sensibilizadas com antígenos totais de Trypanosoma cruzi (antígenos solúveis), são aglutinadas quando colocadas em contato com diluições de soros de pacientes chagásicos.
Procedimento: Teste Quantitativo
Em tubo de ensaio, diluir a amostra a 1/40 a ensaiar e os soros controle positivo (R3) e negativo (R4), adicionando: 10(l de amostra + 0,4ml de diluente (R2A).
Adicionar na microplaca a partir da 2( cavidade 50(l de diluente (R2A).
Transferir 50(l da amostra diluída para a 1( cavidade.
Transferir 50(l da amostra diluída a 2( cavidade e homogeneizar e transferir 50(l para a 3( cavidade, homogeneizar e transferir 50(l para a 4( cavidade e assim sucessivamente até a 8( cavidade, em que após a homogeneização 50(l serão desprezados (observar esquema).
Controle positivo: seguir o mesmo esquema de diluição (item d), até a 6( cavidade, em que após a homogeneização 50(l serão desprezados (observar esquema).
Controle negativo: adicionar 50(l do controle diluído nas 7( e 8( cavidades.
Homogeneizar bem a suspensão de hemácias (R1), por agitação delicada do frasco e adicionar 25 (l a cada cavidade.
Bater levemente nas laterais da placa para homogeneização dos reagentes.
Deixar a placa em repouso por 1 hora, a temperatura ambiente, em local isento de vibrações.
Efetuar leitura ao final da incubação.
Resultado: 
O título será a maior diluição que ainda fornecer um resultado positivo. Para validar o teste deve-se encontrar nas mesmas condições de leitura, o título do soro positivo (R3) indicado na etiqueta ( 1 diluição.
REAÇÃO POSITIVA: Véu uniforme de hemácias recobrindo toda a cavidade, podendo estar às vezes parcialmente retraído nas bordas.
REAÇÃO FRACAMENTE POSITIVA: Véu pouco nítido, apresentando pequeno depósito de hemácias no fundo da cavidade.
REAÇÃO NEGATIVA: Botão compacto de hemácias no fundo da cavidade.
	
	
	
	
	Esquema Geral
	
	
	
	
	Cavidade da placa
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	Diluente (R2A) (l
	-
	50
	50
	50
	50
	50
	50
	50
	Amostra diluída a 1/40 ((l)
	50
	50
	
	
	
	
	
	
	Transferir 50(l
	
	→
	→
	→
	→
	→
	→
	→
desprezar
	Hemácias (R1) (l
	25
	25
	25
	25
	25
	25
	25
	25
	Título do Soro
	40
	80
	160
	320
	640
	1280
	2560
	5120
Interpretação dos Resultados:
Título do soro menor que 1/40: soro não reagente – indivíduo não parasitado.
Título do soro maior ou igual a 1/40: soro reagente – indivíduo com suspeita da parasitose.
�
Hemaglutinação Passiva para Toxoplasmose 
Finalidade: Teste de hemaglutinação passiva para o diagnóstico sorológico da toxoplasmose.
Princípio: Hemácias de aves estabilizadas e sensibilizadas com antígenos totais de Toxoplasma gondii (antígenos solúveis), são aglutinadas quando colocadas em contato com diluições de soros com anticorpos específicos.
Procedimento: Teste Quantitativo
Em tubo de ensaio, diluir a amostra a 1/16 a ensaiar e os soros controle positivo e negativo, adicionando: 25(l de amostra + 0,4ml de diluente.
Adicionar na microplaca a partir da 2( cavidade 50(l de diluente.
Transferir 50(l da amostra diluída para a 1( cavidade.
Transferir 50(l da amostra diluída a 2( cavidade e homogeneizar e transferir 50(l para a 3( cavidade, homogeneizar e transferir 50(l para a 4( cavidade e assim sucessivamente até a 8( cavidade, em que após a homogeneização 50(l serão desprezados (observar esquema).
Controle positivo: seguir o mesmo esquema de diluição (item d), até a 6( cavidade, em que após a homogeneização 50(l serão desprezados (observar esquema).
Controle negativo: adicionar 50(l do controle diluído nas 7( e 8( cavidades.
Homogeneizar bem a suspensão de hemácias, por agitação delicada do frasco e adicionar 25 (l a cada cavidade.
Bater levemente nas laterais da placa para homogeneização dos reagentes.
Deixar a placa em repouso por 1 hora, a temperatura ambiente, em local isento de vibrações.
Efetuar leitura ao final da incubação.
Resultado: 
O título será a maior diluição que ainda fornecer um resultado positivo. Para validar o teste deve-se encontrar nas mesmas condições de leitura, o título do soro positivo indicado na etiqueta ( 1 diluição.
REAÇÃO POSITIVA: Véu uniforme de hemácias recobrindo toda a cavidade, podendo estar às vezes parcialmente retraído nas bordas.
REAÇÃO FRACAMENTE POSITIVA: Véu pouco nítido, apresentando pequeno depósito de hemácias no fundo da cavidade.
REAÇÃO NEGATIVA: Botão compacto de hemácias no fundo da cavidade.
	
	
	
	
	Esquema Geral
Cavidade da placa
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	Diluente (R2) (l
	-
	50
	50
	50
	50
	50
	50
	50
	Amostra diluída a 1/16 ((l)
	50
	50
	
	
	
	
	
	
	Transferir 50(l
	
	→
	→
	→
	→
	→
	→
	→
desprezar
	Hemácias (R1) (l
	25
	25
	25
	25
	25
	25
	25
	25
	Título do Soro
	16
	32
	64
	128
	256
	512
	1024
	2048
Interpretação dos Resultados:
Verificar a máxima aglutinação
Exercícios propostos (não obrigatório)
I) Nos testes de hamaglutinação para Toxoplasmose e doença de Chagas e de aglutinação, pede-se:
a) Qual suporte foi empregado nos testes? Explique o princípio do método.
b) Realizou-se a pesquisa de anticorpos. Que tipo de antígeno foi empregado?
c) Quais cuidados devem ser observados na realização dos testes?
d) Qual tipo de resposta imunológica foi ativada? Explique.
e) Explique o significado clínico para uma gestante com resultado reagente para IgM na Toxoplasmose.
f) Qual o valor da pesquisa de IgG para a Doença de Chagas? Explique.
II) Indique o título das amostras (em A e B). 
Após análise do controle positivo e controle negativo, justifique a validação e a liberação dos resultados das amostras em cada teste.
Legenda:
C+ = controle positivo
C- = controle negativo
Reação positiva: véu uniforme de hamácias recobrindo toda a cavidade.
Reação negativa: botão compacto de hemácias no fundo da cavidade.
Teste A: Doença de Chagas 				Teste B: Toxoplasmose
	Diluição:
	Amostra
	
	
	
	Diluição:
	Amostra
	
	
	1:40
	(
	(
	C+
	
	1:16
	(
	(
	C+
	1:80
	(
	(
	C+
	
	1:32
	(
	(
	C+
	1:160
	(
	(
	C+
	
	1:64
	(
	(
	C+
	1:320
	(
	(
	C+
	
	1:128
	(
	(
	C+
	1:640
	(
	(
	C+
	
	1:256
	(
	(
	C+
	1:1280
	(
	(
	C+
	
	1:512
	(
	(
	C+
	1:2560
	(
	(
	C-
	
	1:1024
	(
	(
	C-
	1:5120
	(
	(
	C-
	
	1:2048
	(
	(
	C-
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Descarte com hipoclorito
	
	Pipeta automática de 25(l, 50(l 
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
 
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: FARMÁCIA/BIOMEDICINA
Disciplina: Imunologia Clínica
Titulo da Aula: Enzimático - ELISA
	AULA
3
OBJETIVO: Mostrar ao aluno, reações de formação do complexo antígeno-anticorpo “in vitro” com o emprego de um teste enzimático aplicado na prática de diagnóstico e de triagem.
Princípio
A amostra é diluída no suporte no qual se encontra o antígeno imobilizado. Se a mesma contiver os anticorpos específicos, estes formarão um complexo com os antígenos e permanecerão unidos. A fração não unida é eliminada por lavagem. Adicionar os anticorpos anti-imunoglobulina humana marcados pela enzima (conjugado). Se ocorrer a reação na primeira etapa do processo, o conjugado se unirá ao anticorpo da amostra. Após uma nova lavagem, se adiciona o substrato cromogênico. Nos casos onde o conjugado tiver se unido, haverá surgimento de coloração celeste. A reação se detém com ácido sulfúrico, com o que a coloração azul celeste torna-se amarela. 
Procedimento
Estabelecer o plano de distribuição e identificação das amostras e dos controles. 
Pipetar 200µl do diluente + 10µl dos controles positivo, negativo e amostra. Fazer um controle branco no qual será adicionado somente 200µl do diluente.
Bater levemente nas laterais da placa. 
Incubar por 30 minutos a 37(C . 
Desprezar o líquido de cada poço e lavar 5 vezes com tampão de lavagem. 
Distribuir 50µl do conjugado anti-Ig humano peroxidase. 
Incubar por 30 minutos a 37(C. 
Lavar como no item 5.
Distribuir 50µl do Revelador A + 50µl do Revelador B. (uma gota de cada e cada um dos poços).
 Incubar por 30 minutos a 37(C. 
Distribuir 50µl do “stoper” em cada poço.
LEITURA: Proceder à leitura da reação em espectrofotômetro para microplacas utilizando filtro 450(m. 
Exercício proposto (não obrigatório)
Para as técnicas imunoenzimáticas, responda:
Explique o princípio do teste imunoenzimático.
Esquematize um teste ELISA para a pesquisa de anticorpos.
Explique como em um teste ELISA pode-se determinar a fase da doença, contra qual doença é o anticorpo encontrado na amostra.
O que é o conjugado empregado no teste ELISA para a pesquisa de anticorpos? Explique.
Qual o princípio do teste de Western blotting WB? Explique.
Porque devemos realizar as etapas de lavagem? Qual o objetivo?
Diferencie o substrato cromogênico do teste ELISA e WB.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Descarte com hipoclorito
	
	Pipeta automática de 5(l , 25(l, 50(l, 100(l, 500(l
	
	Proveta 50mL (para diluir tampão de lavagem)
	
	Balão volumétrico 200mL (para diluir tampão de lavagem)
	
	Ponteiras amarelas (volume até 200(l)
	
	Ponteiras azuis (volume até 1000(l)
	
	Béquer de 200mL (para solução de lavagem)
	
	Pipeta Pasteur de plástico ou vidro (para lavagem)
	
	
	
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Leitora de placas (ELISA)
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança:
Antes de descartar as placas usadas autoclavar.
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