ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO

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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
ELISA
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Conceito:
 É um método quantitativo em que a reação antígeno-anticorpo é medida através da atividade enzimática sobre um substrato específico.
Princípio:
 Imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida enquanto o outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade da enzima quanto da imunológica do Ac.
Sinônimos: 
 - Enzimaimunoensaio
 - ELISA (Enzyme-Linked-Immunoabsorbent-assay)
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Ac / Ag
Ag / Ac
Anti-Ac
Anti-Ac
Ac / Ag
Ac / Ag
Ag / Ac
Ag / Ac
Substrato /
Cromógeno
Produto -
 Cor
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Enzimas: Alta atividade específica; estabilidade; fácil conjugação com outras moléculas.
 - mais usadas: peroxidase, fosfatase alcalina, lisozima, malato desidrogenase.
Produto da Reação: Estabilidade; de fácil quantificação; alto coeficiente de extinção molar (detecção de pequenas quantidades).
 - Sensibilidade de detecção: nanogramas(ng); picogramas(pg)
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
‘Antígenos’: Proteínas microbianas; hormônios, drogas,
citocinas, etc.;
Anticorpos: Contra bactérias, vírus, fungos e protozoários.
Antígeno
 (Ag)
Anticorpo
 (Ac)
Antígeno
 (Ag)
Anticorpo
 (Ac)
ou
ENSAIO DIRETO
ENSAIO INDIRETO
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Etapas: 
 1) Adsorção;
 2) Bloqueio;
 3) Adição do soro-teste;
 4) Adição do Conjugado;
 5) Revelação / Leitura;
 6) Lavagens.
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
 1) Adsorção: 
 Imobilização de um dos reagentes na fase sólida (placa) através de interação covalente.
 - fase sólida: É a placa plástica (mais usada); podem ser de polivinil, poliestireno e polipropileno.
 
Incuba-se a 4ºC - overnight ou por 18 horas
Indireto
Direto
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2) Bloqueio: Ocupação dos sítios ‘vazios’ – eliminação das reações cruzadas.
- Solução utilizada: Alta concentração de proteínas (5mg/ml); leite desnatado, soro albumina bovina, gelatina, caseína, etc.
Tempo de bloqueio: 2 horas a 37ºC
Direto
Indireto
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
3) Adição de soro-teste:
Soro: Contém inúmeras proteínas – Complemento, enzimas, Ac e outras;
Diluição: ‘Separação’ dos anticorpos – evita a competição entre eles.
Incuba-se a 37ºC – 1 a 2 horas ou overnight
Direto
Indireto
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
3) Adição de soro-teste:
 
 Durante a incubação há a formação de inúmeros complexos Ag-Ac.
Incuba-se a 37ºC – 1 a 2 horas ou overnight
Direto
Indireto
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
4) Adição do Conjugado (Cjg): É o anti-anticorpo marcado com uma enzima, ex.: peroxidase;
- Diluição: Quantidade equivalente de Ac marcado que reconhece o complexo Ag-Ac. 
Incuba-se a 37ºC por 1 hora
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
4) Adição do Conjugado (Cjg): 
 Durante a incubação com o Conjugado há o reconhecimento do complexo Ag-Ac pelo anti-anticorpo marcado.
Incuba-se a 37ºC por 1 hora
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
6) Lavagem: É realizada entre as etapas p/ retirada do excesso de reagentes, evitando assim as reações cruzadas. A solução de lavagem contém um detergente não-iônico (Tween 20).
Ac / Ag
Ag / Ac
Anti-Ac
Anti-Ac
Ac / Ag
Ac / Ag
Ag / Ac
Ag / Ac
Lavagem
Lavagem
Lavagem
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
6) Revelação: Depois que o Cjg reconhece o complexo Ag-Ac adiciona-se o substrato da enzima que marca o conjugado (Anti-anticorpo) - Ex. água oxigenada-H2O2. Adiciona-se também o reagente cromógeno – 
 - Ex. ortofenilenodiamina- OPD. Aparece então cor na reação.
Incuba-se por 15 minutos a temperatura ambiente
Substrato + Cromógeno 
H2O2
OPD
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
6) Revelação: Para estabilizar a reação acrescenta-se uma solução ácida, (ex. ácido sulfúrico) e procede-se à leitura.
H2SO4 (4N)
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7) Leitura : Utiliza o espectrofotômetro para ELISA que mede a densidade ótica (intensidade da cor) da reação;
A cor é proporcional à quantidade de complexo Ag-Ac-Anti-ac marcado formado.
 
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Vantagens do teste de ELISA:
 - Rápido;
 - Múltiplos ensaios;
 - Elevada sensibilidade e especificidade;
 - Detecta quantidades mínimas do Ac/Ag;
 - Baixo custo.
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
A
B
E
C
F
D
D
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Protocolo de prática
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Cut off ou Limiar de Reatividade:
 É o valor que delimita qual teste é positivo ou negativo.
 > ou igual cut off – POSITIVO
 < cut off - NEGATIVO 
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ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO
Interpretação de resultados:
 - branco = 0,053
 - controle positivo = 1,583 (1,540)
 - controle negativo = 0,153 (0,100)
 Cut off= 1,540
 - soros-teste = 1,645 (1,592)
 - soros-teste = 0,213 (0,160)
 - soros-teste = 0,149 (0,087)
 - soros-teste = 2,359 (2,306)
POSITIVO
NEGATIVO
NEGATIVO
POSITIVO
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Obrigado!