1.2 Prática Biotecnologia I Cinetica enzimática

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AULA PRÁTICA
 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
	Disciplina: Biotecnologia
	Curso: Farmácia
	Turma: N12605A
	Semestre: 9°
	Professor: Ricardo Hakime
	Título da Prática: Estudo de Cinética Enzimática da Invertase
	Código da aula: 
	Data da realização: 06/03/2018
	Grupos: 10
	
		PROTOCOLO EXPERIMENTAL
	Objetivo(s): Este estudo teve como objetivo extrair e determinar os parâmetros cinéticos da enzima Invertase da levedura Saccharonices ceriviae .
	Descrição do Método: Cinético epectrofotométrico. 
	
Procedimentos experimentais
2.1 Preparo do extrato enzimático do fermento S. cerivisiae. 
Para obtenção do extrato enzimático “invertase”, utilizar 10g de fermento biológico (Fleichmann), adicionar 5g de areia fina (previamente lavada, esterilizada e seca) no gral de porcelana, 10 mL de Éter etílico. Macerar por 5 minutos. Em seguida, transferir o material do gral para um erlenmayer de 125 mL e adicionar 30 mL de tampão acetato 0,02M, pH 5,0. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos e posteriormente, centrifugar a 3500 rpm, por 10 minutos. 
Conservar o sobrenadante em gelo até o momento do uso.
2.2 Determinação da atividade catalítica da invertase
	
	Tubo 1
	Tubo 2
	Tubo 3
	Extrato enzimático
	----------
	----------
	0,1 mL
	Sacarose 0,02 M
	0,5 mL 
	-----------
	0,5 mL
	Glicose 0,02 M
	-----------
	0,5 mL
	-----------
	Tampão acetato pH 5,0
	1,5 mL
	1,5 mL
	1,5 mL
	
Incubar a temperatura ambiente por 20 minutos
	DNS
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	
Levar a fervura todos os tubos de uma única vez por 5 minutos. Terminado o tempo, observar a coloração.
	
	Coloração
	Tubo 1
	
	Tubo 2
	
	Tubo 3
	
2.3 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS
2.3.1 Preparo da curva de calibração de glicose para açúcares redutores totais (ART)
Fazer uma solução estoque de glicose a 0,01 M 
Preparar uma série de 7 tubos conforme indicado a baixo:
	
Tubos
	glicose 0,01 M (mL)
	H2O (mL)
	DNSA (mL)
	Ferver por 5 minutos
	H2O (mL)
	Resfriar e homogeneizar
	[mM] de glicose
	
A540 nm
	1
	------
	1,00
	1,0
	
	8,0
	
	0,000
	0,000
	2
	0,20
	0,80
	1,0
	
	8,0
	
	
	
	3
	0,30
	0,70
	1,0
	
	8,0
	
	
	
	4
	0,40
	0,60
	1,0
	
	8,0
	
	
	
	5
	0,60
	0,40
	1,0
	
	8,0
	
	
	
	6
	0,80
	0,20
	1,0
	
	8,0
	
	
	
	7
	1,00
	---------
	1,0
	
	8,0
	
	
	
OBS: Zerar o espectrofotômetro com o tubo 1
Volume final = 10 mL
A partir da solução estoque de glicose (a 0,01 M) determinar a concentração diluída em cada tubo, usando a equação: M1 . V1 = M2 . V2
Determinar a equação da reta ou a tangente do ângulo para a obtenção do coeficiente angular [será igual ao coeficiente de absortividade molar ()] e assim obter o fator (F) de ART. 
 ou Pela equação da reta: y = a.x+b onde = a
2.3.2 Escolha da melhor diluição do extrato enzimático
	As enzimas quando diluídas tendem em apresentar melhor atividade catalítica.
	
Preparar uma série de 5 tubos conforme indicado a baixo:
	Reagentes
	Tubo 1
	Tubo 2
	Tubo3
	Tubo 4
	Tubo 5
	Sacarose 0,02M
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	Tampão acetato 0,02M pH 5,0
	0,8 mL
	0,8 mL
	0,8 mL
	0,8 mL
	0,8 mL
	
Extrato enzimático
	------------
	0,2 mL
puro
	0,2 mL diluição 1:1*
	0,2 mL
diluição 1:2*
	0,2 mL
diluição 1:5*
	Água destilada
	0,2 ml
	------------
	------------
	------------
	------------
	
Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. 
Interromper a reação com a adição de 1 mL de DNSA. 
Agitar bem os tubos e colocar em banho de água fervente ( 90º C) por 5 minutos. 
Resfriar e colocar 7,5 ml de água destilada em todos os tubos. 
Homogeneizar e ler a absorbância a 540 nm, zerando o aparelho com o tubo 01. 
	Absorbância a 540 nm
	Branco
	
	
	
	
OBS: * Diluição com tampão acetato.
 Escolher como a melhor diluição, o tubo que tiver uma absorbância em torno de 0,5.
2.3.3 Determinação do efeito da concentração de sacarose sobre a atividade da invertase: 	
	Preparar uma solução estoque de sacarose a 0,02 M em tampão acetato 0,02 M e pH 5,0 (vol.= 100 mL).
	Neste ensaio serão testadas as concentrações variadas de sacarose, para determinar a velocidade máxima da enzima invertase. 
Preparar uma série de 7 tubos conforme indicado a baixo:
	
	Branco
	Tubo 1
	Tubo2
	Tubo 3
	Tubo 4
	Tubo 5
	Tubo 6
	Extrato enzima diluído
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	Sacarose 0,02 M em tampão Acetato. pH 5,0
	----------
	0,1 mL
	0,2 mL
	0,3 mL
	0,4 mL
	0,5 mL
	0,6 mL
	Tampão Acetato 0,02 M pH 5,0
	1,3 mL
	1,2 mL
	1,1 mL
	1,0 mL
	0,9 mL
	0,8 mL
	0,7 mL
	Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos e após o tempo:
	Reativo DNSA
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	H2O destilada
	7,5 mL
	7,5 mL
	7,5 mL
	7,5 mL
	7,5 mL
	7,5 mL
	7,5 mL
	Levar a fervura todos os tubos de uma única vez por 5 minutos.
 Terminado o tempo, resfriar os tubos e ler a absorbância a 540 nm, zerando o aparelho com o branco.
Volume final = 10 mL
Cálculo: ou onde: F = 1/
Dados cinéticos:
	Tubos
	Substrato
 (mM)
	Absorbância
a 540 nm
	ART 
(mM)
	Vo
(mM/min)
	1
	
	
	
	
	2
	
	
	
	
	3
	
	
	
	
	4
	
	
	
	
	5
	
	
	
	
	6
	
	
	
	
Fazer um gráfico ART x tempo (minutos) para cada concentração de sacarose utilizada e determinar a velocidade
inicial (Vo) da reação enzimática. A Vo será a equivalente tangente do ângulo. Vo = mM/min 
 onde t = 10 minutos
Fazer um gráfico Vo x [S] e determinar a velocidade máxima (Vmáx , pelo gráfico de Michaelis – Menten).
Fazer um gráfico duplo recíproco (1/Vo X 1/[S]) e determinar a Vmáx e KM para enzima invertase.
2.3.4 Determinação do efeito do pH sobre a atividade da invertase:
Preparar uma série de 8 tubos conforme indicado a baixo:
	
	Tubo 1
Branco
	Tubo2
pH = 3,0
	Tubo 3
pH = 4,0
	Tubo 4
pH = 5,0
	Tubo 5
pH = 6,0
	Tubo 6
pH = 7,0
	Tubo 7
pH = 8,0
	Tubo 8
pH = 9,0
	Extrato enzima diluído
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	0,2 mL
	Sacarose 0,02 M
	-----------
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	Tampão: respectivos pH
	------------
	1,5 mL
	1,5 mL
	1,5 mL
	1,5 mL
	1,5 mL
	1,5 mL
	1,5 mL
	Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos, após o tempo:
	Reativo DNSA
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	H2O destilada
	5,0 mL
	3,0 mL
	3,0 mL
	3,0 mL
	3,0 mL
	3,0 mL
	3,0 mL
	3,0 mL
	
Levar a fervura todos os tubos de uma única vez por 5 minutos.
Terminado o tempo, resfriar os tubos e ler a absorbância a 540 nm, zerando o aparelho com o branco.
Cálculo: 
Decorrido o tempo de reação, retirar uma alíquota de 0,5 mL do meio de incubação, quantificando-se a concentração de ART pelo método do DNS. 
Fazer um gráfico Vo x pH e determinar o pH ótimo de reação (onde a quantidade de ART é máxima).
	pH
	Absorbância
a 540 nm
	ART 
(mM)
	Vo
(mM/min)
	3
	
	
	
	4
	
	
	
	5
	
	
	
	6
	
	
	
	7
	
	
	
	8
	
	
	
	9
	
	
	
	10
	
	
	
2.3.5 Unidade Atividade (U) e Atividade Específica (AE)
2.3.5.1 Determinação de proteína total na amostra enzimática: Kit Microprot (Doles)
Reativo: Microprote pirogalol (Doles)
		Tubos
	Branco
	Padrão
	Amostra
	A 600 nm
	Extrato puro
	-----------
	-----------
	20 uL
	
	Água destilada
	20 uL
	-----------
	-----------
	
	Padrão
	------------
	20 uL
	-----------
	
	Reativo
	1 mL
	1 mL
	1 mL
	
	Homogeneizar e incubar a 37º C por 10 minutos. Ler a 600 nm zerar com o branco.onde: [P] =100 mg/dL (mg/dL para mg/mL, dividir por 100)|Z
2.3.5.2 Determinação de unidade atividade (U), U total e Atividade Específica (AE)
		
	Branco
	Tubo1
	Extrato enzimático
	-----------
	0,2 mL
	Sacarose 0,02 M
	0,5 mL
	0,5 mL
	Solução Tampão Acetato pH 5,0
	1,5 mL
	1,5 mL
	Incubar a temperatura ambiente por 20 minutos
Interromper a reação com a adição de 1 mL de DNSA. Agitar bem os tubos e colocar em banho de água fervente ( 90º C) por 5 minutos. Resfriar e colocar 8,0 ml de água destilada em todos os tubos. Homogeneizar e ler a absorbância a 540 nm, zerando o aparelho com o tubo do branco. 
Calcular a concentração de ART no tubo 1 pela equação: 
 = determinado na aula 2.1
Uma unidade atividade (U) é a quantidade em mM de produto (ART) liberado por 0,1 mL do extrato enzimático em 10 minutos de reação, utilizando tampão acetato 0,02 M e pH 5,0. 
Obs.: 1,0 Molar = 1000 mM
Para determinar a unidade atividade (U), utilizar a [ART] obtido em uma cinética utilizando sacarose a 0,02 M.
Para determinar a Unidade Atividade Total (U total):
 
Para determinar a Atividade Específica (AE): 
	Data da entrega do protocolo:
	Ass. Prof.
	Recebido por: 
	Campus I ( ) Campus II (X)
	Cód. Do Prof.
	Cód. laboratório
	Data da realização: 06/03/2018
	Grupos práticos: 10
Deve ser entregue ao técnico do laboratório o Protocolo de solicitação de Aula prática e o protocolo experimental em anexo.		
1. Materiais e reagentes necessários para cada grupo (especificar quantidade: n° de materiais, volumes ou massas de reagentes, concentração dos mesmos, acessórios, etc).
	QTD
	Materiais Equipamentos Reagentes por grupo
	10
	Tubos de ensaio tamanho médios com estante
	
	
2.Materiais e/ou reagentes a serem disponibilizados em bancadas de apoio – Lateral
(ex. Balança, banho Maria, estufa, etc.)
	QTD
	Materiais Equipamentos Reagentes Apoio bancada lateral
	4 frascos
	Solução de sacarose em sol. Tampão acetato 20 mM, pH 5,0 – preparar 4 frascos de 100 mL cada.
	4 frascos
	Solução de glicose 10 mM – preparar 4 frascos de 100 mL cada.
	4 frascos
	Solução de DNSA– preparar 4 frascos de 100 mL cada.
	1 frascos
	Éter Etílico – Colocar na capela.
	4 frascos
	Solução Tampão Acetato a 20 mm, pH 5,0 – preparar 4 frascos de 100 mL cada.
	4 frascos
	Areia fina autoclavada e desidratada.
	2
	Banho-Maria com água fervente
	3
	Espectrofotômetro com cubeta
	
	Água deionizada 
3. Descrição para o preparo das soluções e reagentes:
	Reativo DNSA (3,5-dinitrosalicylic acid reagent): 1,0g 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) + 30 g sodium potassium tartrate + 20 mL NaOH 2 M, diluted to a final volume of 100 mL.
Universitário de Jaguariúna – Unifaj. Rodovia Adhemar de Barros Km 127 pista sul – Jaguariúna - São Paulo PABX(19) 3837-8500 email faj@faj.br http://www.faj.br