Cinética Enzimática: Parâmetros Cinéticos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ 
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA 
EQI029– LABORATÓRIO DE ENGENHARIA QUÍMICA III 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS EM UMA REAÇÃO 
ENZIMÁTICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ITAJUBÁ 
23-08-2017 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ITAJUBÁ 
CURSO DE GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA 
EQI029– LABORATÓRIO DE ENGENHARIA QUÍMICA III 
 
 
 
 
MARINA REIS PIVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS EM UMA REAÇÃO 
ENZIMÁTICA 
 
 
 
 
 
Relatório submetido aos Professores 
Luciano Jacob Corrêa como requisito parcial 
para aprovação na disciplina de Laboratório 
de Engenharia Química III (EQI029) do curso 
de graduação em Engenharia Química da 
Universidade Federal de Itajubá. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ITAJUBÁ 
23-08-2017 
1. INTRODUÇÃO 
 
As enzimas são definidas por Monteiro e Silva (2009) como proteínas 
especializadas na catálise de reações biológicas cuja função é acelerar a velocidade 
das reações químicas e que são aplicadas industrialmente nos bioprocessos. Estes 
processos catalisados por enzimas são, geralmente, mais rápidos, eficientes e 
ambientalmente sustentáveis. 
 As enzimas podem ser obtidas a partir de vegetais, animais ou de fonte 
microbiana. Suas aplicações se estendem a processos das indústrias têxtil, 
farmacêutica, de alimentos e de papel e celulose. 
 O estudo da cinética das reações enzimáticas é fundamental para a 
compreensão dos bioprocessos que envolvem a catálise enzimática, já que estas 
operam em condições ótimas muito específicas de temperatura e pressão. 
 A cinética enzimática tem como principais características a alta especificidade 
e propriedades catalíticas de redução da energia de ativação dos reagentes, 
acelerando a reação sem afetar a constante de equilíbrio e sem serem consumidas 
(BASTOS, 2011). 
 A alta especificidade das enzimas em relação a determinados substratos é 
consequência da presença de sítios ativos, ou seja, resíduos de aminoácidos em 
locais específicos onde ocorre a ligação da enzima com o substrato, formando um 
intermediário complexo Enzima-Substrato (ES). 
 
1.1. Cinética de Michaelis-Menten 
 Em 1913, baseando-se no conceito de formação do complexo ES como 
intermediário na catálise enzimática, Michaelis e Menten propuseram uma equação 
para a velocidade das reações enzimáticas. Para chegar a uma relação matemática 
algumas hipóteses foram adotadas: 
 A velocidade de uma reação enzimática depende da concentração dessa 
enzima; 
 A concentração de substrato afeta a velocidade da reação de modo que, para 
uma mesma concentração de enzimas, a concentração de substrato segue o 
seguinte comportamento. 
 
 
Figura 1. Relação entre concentração de substrato e a velocidade da reação na cinética sem inibição 
Fonte: BASTOS (2011) 
 
 Na primeira região a condição indica que a velocidade da reação aumenta 
proporcionalmente ao aumento da concentração de substrato. 
 A segunda parte, na qual não há mais o comportamento linear, indica que a 
concentração de substrato não é mais o fator limitante. 
 A terceira seção, pois, apresenta uma saturação das enzimas e o que passa a 
ser limitante é o número de sítios ativos. A reação passa a independer da 
concentração de substrato pois todas as moléculas possíveis já estão conectadas na 
forma do complexo ES a cada instante. 
 O modelo de Michaelis-Menten foi além, propondo a reação química na forma 
na qual E representa a enzima, S o substrato, ES é o complexo enzima-substrato e 
P é o produto formado. Como o estudo se baseava em velocidades iniciais da 
reação a reação inversa do produto se tornando complexo é considerada 
desprezível. 
 A constante de Michaelis-Menten km surge a partir do balanço de complexo 
ES e é um valor característico para cada reação enzimática. Quão menor os valores 
de km, maior a afinidade da enzima pelo substrato. 
 
 
 
 
 
 
 
(1) 
 Observando a Figura 1, pode-se dizer que km representa a concentração de 
substrato no ponto em que . Comparando à segunda parte da equação 
1, pode-se também afirmar que km é aproximadamente igual à constante de 
dissociação do complexo ES visto que a constante k3 geralmente é muito menor que 
k1 e k2. Logo: 
 
 
 
 
(2) 
 Além disso, como k3 é menor, podemos considerar a conversão de enzima e 
substrato no complexo ES como a etapa rápida, enquanto a conversão do complexo 
em produto, por sua baixa constante de velocidade, a etapa lenta. Doravante, a 
velocidade da reação pode ser representada por uma cinética descrita na equação 
3. 
 (3) 
 Obedecendo a cinética e as hipóteses propostas por Michaelis-Menten, pode-
se inferir que a velocidade da reação atingirá seu valor máximo quando todas as 
enzimas estiverem conectadas na forma de complexo ES. Isso pode ser 
representado por 
 (4) 
onde E0 é a quantidade total de enzimas. 
 Compondo as equações 4 e 2, chega-se a equação de Michaelis-Menten, 
apresentada na equação 5. 
 
 
 
 
(5) 
que pode ser analisada tal que: 
 Se [S] >> km, a condição é de saturação dos sítios ativos das enzimas e a 
reação é de ordem zero ( ); 
 Se [S] << km, a condição apresenta o substrato como limitante e a reação 
obedece cinética de primeira ordem (região inicial da curva); 
 Se pode-se validar que km = [S]. 
 
 A referência utilizada do livro tecnologias das fermentações: fundamentos de 
bioprocessos do autor Reinaldo Gaspar Bastos apresenta km de 9,1 mM para a 
conversão de sacarose a partir de invertase obtida de Saccharomyces cerevisiae. 
 
1.2. Aquisição de parâmetros cinéticos 
 A obtenção dos parâmetros cinéticos a partir da curva v x [S] é complexa. O 
gráfico apresenta comportamento não-linear e diferentes condições para cada uma 
das três regiões. 
 Estudantes posteriores do modelo de Michaelis-Menten procuraram 
estabelecer relações lineares do tipo para caracterizar a curva e obter os 
parâmetros cinéticos km e vmáx para uma determinada reação catalisada por 
enzimas. 
 A primeira transformação da equação foi feita por Lineweaver-Burk por meio 
da inversão e rearranjo, obtendo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(6) 
 A segunda transformação é a proposta por Langmuir que é interessante para 
altos valor de v, apesar de obter intersecção próxima de zero, resultando em erros 
na medida de km. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(7) 
 Para aplicar as equações 6 e 7 na descoberta dos valores de km e vmáx pode 
ser utilizado, por exemplo, um modelo de aquisição de dados como o método da 
velocidade inicial. Sua concepção baseia-se em analisar um período de tempo muito 
pequeno após o início da reação, de modo que ela se conserve na região proposta 
por Michaelis-Menten. A concentração de enzimas é fixa e varia-se apenas a 
concentração inicial de substrato. 
 
1.3. Inibição enzimática 
 O modelo de Michaelis-Menten não apresenta nenhuma referência a inibição, 
embora esta seja muito comum em bioprocessos que envolvam catálise enzimática. 
Muitas vezes, osinibidores podem estar dissolvidos na solução ou se apresentarem 
na forma de elementos fundamentais da mesma, sendo um produto ou o substrato. 
 A inibição pode ser irreversível, quando o inibidor (geralmente um metal ou 
gás inibidor) se liga diretamente ao sítio ativo da enzima, formando um complexo 
enzima-inibidor inativo, incapaz de realizar catálise. Isso reduz drasticamente a 
formação de produto pela enzima e prejudica o modelo que descreve a cinética da 
reação. 
 A inibição também pode ser reversível. Para inibição reversível existem 
alguns tipos: 
 inibição reversível competitiva; 
 inibição reversível não-competitiva; 
 inibição reversível incompetitiva; 
 inibição reversível pelo substrato. 
 No presente experimento, é pressuposta a pureza da água e do processo de 
realização da reação enzimática. Portanto, não devem ser observados processos de 
inibição dependentes de agentes inibidores, como o caso da inibição competitiva, 
não-competitiva e incompetitiva. 
 Para concentrações altas de substrato, entretanto, pode acontecer inibição 
por substrato. Este fenômeno acontece quando há ligação de outra molécula de 
substrato a um sítio ativo já complexado na forma ES. Formando um novo complexo, 
ESS (enzima + substrato + substrato). 
 Neste caso, embora a reação de formação de ESS seja reversível, a cinética 
não será mais representada pelo modelo de Michaelis-Menten ou pela Figura 1. As 
características e equações que descrevem esse modelo passam a depender de uma 
constante de inibição ki. Como o objetivo do método das velocidades iniciais é obter 
os parâmetros cinéticos, concentrações que não puderem ser representadas na 
faixa de Michaelis-Menten gerarão erros e são comumente descartadas. 
 
Figura 2. Relação entre a velocidade e a concentração de substrato seguindo cinética com inibição. 
Fonte: BASTOS (2011) 
 
2. PROCEDIMENTOS 
 
2.1 Materiais 
 Para a realização do experimento foram usados os seguintes equipamentos e 
produtos: 
 Banho termostático; 
 Sacarose; 
 Béquer; 
 Enzima invertase; 
 Balança analítica; 
 Espátula; 
 Cronômetro; 
 Pipetas automáticas; 
 Tubos de ensaio; 
 Banho com água fervente e banho com água fria; 
 Solução branco; 
 Reagente DNS (ácido dinitro-salicílico); 
 Água destilada; 
 Espectrofotômetro; 
 
2.2 Procedimento experimental 
Inicialmente ligou-se o banho termostático com a temperatura ajustada para 
40° C. Em seguida foi preparada 50 ml de uma solução de sacarose contendo a 
concentração de 10 g/L, (para isso foram usados balança analítica, béquer e 
espátula para pesar a sacarose necessária).Levou-se a solução para o banho 
termostático para estabilizar a temperatura. 
Após aproximadamente cinco minutos adicionou-se 0,1 ml da solução de 
enzima invertase de concentração (0,1 mg/ml) com a ajuda da pipeta automática, o 
béquer foi agitado e o tempo começou a ser cronometrado. 
Também com a ajuda da pipeta automática foram retiradas alíquotas de 0,5 
ml da solução de dois em dois minutos até o tempo de oito minutos e colocados em 
tubos de ensaio que foram imediatamente levados para o banho de água fervente 
onde permaneceram por cinco minutos e na sequência levados para o banho frio. 
Para a determinação do teor de açúcares redutores foi preparado uma 
solução branco contendo 10 ml de água destilada e10 ml de DNS para servir de 
comparação no espectrofotômetro. Logo em seguida foi adicionado 1,0 ml de DNS 
em cada tubo de ensaio e repetido o processo de cinco minutos em banho com água 
fervente e em seguida banho de água fria; na sequência 10 ml de água destilada foi 
adicionado em cada tubo de ensaio e estes foram levados para a leitura no 
espectrofotômetro a 540nm para a leitura da absorbância para a concentração de 
açúcares redutores. O experimento foi repetido para diferentes concentrações de 
sacarose (5, 20, 30, 50, 80) g/L. 
 
3. APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS RESULTADOS 
 
No primeiro procedimento, no qual foi observada a degradação da sacarose 
dentro os tubos de ensaio que continham a enzina invertase, após a retirada dos 
tubos do banho-maria e seu posterior banho de gelo, calculou-se a absorbância de 
cada tubo, medida com o auxílio da proteína DNS. 
A Tabela 1 mostra os resultados das absorbâncias obtidas em soluções de 
diversas concentrações de sacarose: 
 
Tabela 1 – Absorbância das soluções de sacarose 
Dados – absorbância 
Tempo (min) 5 10 20 30 50 80 
2 0,003 0,004 0,062 0,011 0,024 0,033 
4 0,008 0,018 0,026 0,025 0,028 0,047 
6 0,013 0,036 0,043 0,022 0,031 0,063 
8 0,018 0,049 0,071 0,042 0,046 0,068 
Fonte: Pessoal (2017) 
 
Interpretando a Tabela 1, observa-se que quanto maior foi o tempo 
termostático a 40ºC no qual cada solução foi submetida, maior foi a absorbância 
encontrada. Isto ocorre porque o banho termostático se encontra na temperatura 
ótima de atividade a enzima invertase, ou seja, a reação de inversão da sacarose vai 
ocorrendo no passo em que a enzima quebra a molécula de sacarose em glicose e 
frutose, alterando a capacidade da solução de absorver radiações em uma certa 
frequência. Porém, os valores de absorbância encontrados foram relativamente 
maiores dos que podem ser encontrados na literatura. Isto pode ter ocorrido por 
meio de erros experimentais como o mau preparo das soluções, ou um erro na 
cronometragem do tempo de reação de cada tubo de ensaio, 
O controle da temperatura durante a reação se faz necessário para obter uma 
reação mais eficiente, pois cada enzina possui uma faixa de temperatura ótima, na 
qual a sua atividade é maximizada. No caso da invertase, a quebra da molécula de 
sacarose ocorrerá com uma velocidade maior caso a enzima se encontre na faixa de 
temperatura ótima. 
Portanto, a etapa de banho-maria a 80ºC é importante justamente porque, 
com a mudança abrupta de temperatura de operação, a enzima é desativada e a 
reação é interrompida, justamente para fins de análise comparativa no final do 
experimento. Assim, quando foram retirados tubos do banho termostático em tempos 
diferentes e, em seguida, mergulhados em banho-maria, é possível observar o 
andamento da reação de inversão. 
Utilizando a curva padrão encontrada no anexo A, é possível aferir os valores 
da concentração de glicose formada a partir da absorbância das soluções. Assim, foi 
elaborada a Tabela 2: 
 
Tabela 2 – Concentrações de glicose nas soluções de sacarose 
Concentrações (g/L) 
Tempo (min) 5 10 20 30 50 80 
2 0,041 0,044 0,239 0,067 0,111 0,142 
4 0,057 0,091 0,118 0,115 0,125 0,189 
6 0,074 0,152 0,175 0,105 0,135 0,243 
8 0,091 0,195 0,270 0,172 0,185 0,259 
Fonte: Pessoal (2017) 
Os dados desta tabela estão de acordo com o esperado para essa prática, 
pois a concentração de glicose foi aumentando à medida que a reação se 
processava, mostrando que a reação de inversão estava acontecendo e que a 
sacarose estava sendo hidrolisada. Porém, o valor de concentração inicial da 
solução de 20 g/L de sacarose apresenta certa divergência em relação à literatura, 
provavelmente devido à má calibração do aparelho. 
Agora, pode-se encontrar a velocidade de formação da glicose para cada 
solução, utilizando a taxa de variação da concentração pelo tempo, ou seja, 
calculando 
 
 
 , através de uma regressão linear dos dados obtidos na Tabela 2. 
Desta forma, para efeitos de comparação, foi plotado o gráfico 1, que possui as 
curvas de todas as soluções de sacarose que foram submetidas ao experimento. 
 
Figura 1: Regressão linear das concentrações de glicose nas soluções 
 
Fonte: Pessoal (2017) 
 
Para a melhor compreensão dos dados do gráfico 1, foimontada uma tabela 
auxiliar contendo as equações das regressões, visto que a velocidade da reação em 
cada tubo é calculada através do coeficiente angular de cada regressão. Os dados 
estão contidos na Tabela 3. 
 
Tabela 3 - Equações da regressão linear para cada solução de sacarose 
Equações das regressões 
Concentração inicial de 
sacarose (g/L) Velocidade (g/L.min) 
y = 0,0084x + 0,0237 5 0,0084 
y = 0,0258x - 0,0083 10 0,0258 
y = 0,0152x + 0,0388 30 0,0152 
y = 0,0116x + 0,0809 50 0,0116 
y = 0,0204x + 0,1062 80 0,0204 
Fonte: Pessoal (2017) 
 
0,000 
0,050 
0,100 
0,150 
0,200 
0,250 
0,300 
0 2 4 6 8 10 
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
 d
e 
gl
ic
o
se
 (
g/
L)
 
Tempo (min) 
5 g/L 
10 g/L 
30 g/L 
50 g/L 
80 g/L 
Linear (5 g/L) 
Linear (10 g/L) 
Linear (30 g/L) 
Linear (50 g/L) 
Linear (80 g/L) 
Com estes dados, pode-se observar o efeito da concentração de substrato em 
uma reação enzimática: quanto maior for a concentração de substrato, maior será a 
a velocidade de consumo do mesmo e, portanto, maior será a velocidade de 
produção da substância desejada. Isto pode ser verificado pela equação de 
Michaelis-Mendel, na qual a velocidade da reação é diretamente proporcional a 
concentração de substrato. 
O próximo passo é realizar uma curva da velocidade média da reação de 
inversão para cada solução em relação a concentração de substrato. A Figura 2 
mostra esses resultados: 
 
Figura 2 – Curva da velocidade a reação x concentração de substrato 
 
Fonte: Pessoal (2017) 
 
Segundo o gráfico, há uma velocidade máxima alcançada quando a solução 
possui 10 g/L de sacarose, porém uma queda significativa da velocidade em uma 
solução entre 30 e 50 g/L indica que a enzina invertase sofre inibição a 
concentrações intermediárias de substrato, voltando a aumentar sua velocidade a 
altas concentrações de substrato. 
Para determinar os parâmetros cinéticos como a velocidade máxima da 
reação (Vmáx) e a constante de Michaelis-Mendel (km) é necessário linearizar a 
equação de Mendel para facilitar os cálculos. Em primeiro lugar, foi utilizada a 
linearização de Lineweaver-Burk, representada pela equação (6). Assim, com os 
dados anteriormente obtidos, foi possível obter os parâmetros desejados. A figura 3 
mostra o resultado da linearização: 
 
0 
0,005 
0,01 
0,015 
0,02 
0,025 
0,03 
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 
V
el
o
ci
d
ad
e 
d
a 
re
aç
ão
 e
n
zi
m
at
ic
a 
(g
/L
.m
in
) 
Concentração de sacarose (g/L) 
v versus [S] 
Figura 3: Gráfico da Linearização por Lineweaver-Burk 
 
Fonte: Pessoal (2017) 
 
Com esta linearização, obteve-se um valor de vmáx de 0,020 g/L.min e um 
valor de km de 5,52 g/L. 
Em seguida, foi utilizada a linearização de Langmuir, expressada pela 
equação (7). A figura 4 explicita o gráfico resultante. 
 
Figura 4 – Gráfico da Linearização por Langmuir 
 
Fonte: Pessoal (2017) 
 
Com esta segunda linearização, foram encontrados os valores de 0,019 
g/L.min para vmáx e 6,08 g/L para km. 
Ao comparar as duas linearizações percebe-se que, apesar dos valores os 
parâmetros se encontrarem em uma mesma faixa, a precisão e a exatidão de ambas 
as linearizações é bem pronunciada. Ao passo que a linearização de Langmuir é 
mais exata, porque descreve melhor o comportamento da concentração do substrato 
com a alteração da velocidade da reação, a linearização de Langmuir é mais 
precisa, porque os pontos de operação estão mais próximos da reta obtida. Isso 
mostra que, apesar de descreverem o mesmo fenômeno, cada linearização tem uma 
vantagem e uma desvantagem específica, e deve-se levar em conta as 
características de cada uma para decidir qual é a mais apropriada para cada 
processo estudado. 
 
4. CONCLUSÃO 
 
 Apesar de alguns resultados inesperados terem sido obtidos ao longo da 
prática, tais como os valores maiores do que os esperados para a absorbância, 
devido a ocorrência de possíveis erros experimentais e problemas na calibração dos 
equipamentos, considera-se a realização do experimento como satisfatória, uma vez 
que foi alcançado o objetivo do experimento, de determinar os parâmetros cinéticos 
(Vmax e Km) para a enzima invertase extraída do fermento comercial prensado. 
 
5. ANEXO A - CURVA PADRÃO ABSORBÂNCIA – CONCENTRAÇÃO DE 
GLICOSE 
 
 
Fonte: Pessoal (2017) 
 
y = 3,3689x + 0,0304 
R² = 0,9998 
0 
0,1 
0,2 
0,3 
0,4 
0,5 
0,6 
0,7 
0,8 
0,9 
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 
G
lic
o
se
 (
g/
L)
 
Absorbância 
Curva padrão 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
BASTOS, Reinaldo Gaspar. Tecnologia das fermentações: fundamentos de 
bioprocessos. 2011. 
MONTEIRO, Valdirene N., and R. N. Silva. "Aplicações industriais da biotecnologia 
enzimática." Revista processos químicos 3.5 (2009): 9-23.