RELATÓRIO COLORAÇÃO GRAM + E

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UNIVERSIDADE JOSÉ DO ROSÁRIO VELLANO – UNIFENAS
CURSO DE NUTRIÇÃO
MICROBIOLOGIA PRÁTICA
AMANDA DE CASSIA ALVES
LUANA MARIA DUARTE PINTO
WEVERTON TERRA
COLORAÇÃO DE GRAM 
Alfenas – MG
Abril de 2018
AMANDA DE CASSIA ALVES
LUANA MARIA DUARTE PINTO
WEVERTON TERRA
COLORAÇÃO DE GRAM 
Relatório apresentado ao Curso de Nutrição - UNIFENAS, como parte das exigências da disciplina de Microbiologia de Alimentos. 
Orientador(a): Profª. Nelma de Mello Silva Oliveira
 
Alfenas – MG
Abril de 2018
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO	3
2 OBJETIVOS	5
3 MATERIAL E MÉTODOS	6
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO	8
5 CONCLUSÕES	9
REFERÊNCIAS	10
1 INTRODUÇÃO
Hans Christian Gram, um bacteriologista dinamarquês, estudou e definiu a técnica para corar bactérias, a coloração Gram, em 1884. Nesta ocasião, experimentalmente, corou lâminas com esfregaços (uma espécie de “raspa”, grosseiramente falando, de um determinado lugar do corpo ou de uma cultura que se queira fazer a pesquisa) com violeta de genciana e percebeu que se as bactérias existentes nestes esfregaços uma vez coradas não desbotavam com álcool, se previamente fossem tratadas com iodo.
Avançando e aprimorando o método, adicionou ainda outros corantes denominados “contra-corantes”, tais como safranina e fucsina básica. As bactérias contidas no esfregaço podem ser classificadas como Gram-positivas (aproximadamente de cor roxa) ou Gram-negativas (aproximadamente de cor vermelha), isto dependerá da parede celular da bactéria. Se for estruturalmente simples a coloração será positiva, se for estruturalmente complexa a coloração será então negativa.
Existe um protocolo que se segue para fazer a coração de um esfregaço, com etapas bem definidas e com misturas de substâncias (solução de cristal violeta; solução de lugol (iodeto de potássio - KI); solução de safranina e solução de álcool) que resultarão na coloração positiva ou negativa, como nas figuras abaixo:
Esta coloração permite distinguir os mais variados tipos de bactérias e que tipo de parede celular elas tem (se mais simples ou mais complexas, com mais ou menos peptideoglicanos – principal componente da parede celular bacteriana). As bactérias que descorarem quando submetidas à um solvente orgânico são Gram-negativas, e as que permanecerem coradas mesmo quando em contato com o solvente são denominadas Gram-positivas.
Estas bactérias de diferentes colorações tem também graus diferentes de virulência. As Gram-negativas, por exemplo, são constituídas por uma endotoxina denominada LPS (lipopolissacarídeo), que é causadora da patogenicidade. Já as Gram-positivas possuem a exotoxina rica em ácido lipoprotéico que confere aderência à bactéria.
1.1 Diferença entre bactéria Gram-positiva e Gram-negativa
Há diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos.
As bactérias Gram-positivas retém o cristal violeta devido à presença de uma espessa camada de peptideoglicano (polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias) em suas paredes celulares, apresentando-se na cor roxa.
Já as bactérias Gram-negativas possuem uma parede de peptideoglicano mais fina que não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração e recebem a cor vermelha no processo de coloração final.
1.2 Bactérias Gram-negativas
As proteobactérias compôem a maior parte das bactérias gram negativas. As principais são: Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, Legionella, entre outras, como Chlorobi, Chloroflexi, Cianobactérias, Espiroquetas, etc.
1.3 Bactérias Gram-positivas
Filo Firmicutes (Bacilos, Estreptococos, Estafilococos, Enterococos). 
2 OBJETIVOS
Aprender a confeccionar preparações coradas de bactérias com a coloração de Gram para visualização de microscopia.
Aprender a diferenciar pela microscopia as bactérias Gram positivas das Gram negativas. 
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coloração de Gram
No experimento para observar se a bactéria é gram-positiva ou gram-negativa, foi utilizado:
Lâmina para microscopia
Lápis para vidro
Alça de platina
Bico de Bunsen
Tubo contendo solução salina
Cultura de bactéria Gram positiva
Cultura de bactéria Gram negativa
Bateria de corante: cristal violeta, lugol, álcool absoluto e fucsina
Microscópio, óleo de imersão e papel absorvente
Suporte para lâmina
Primeiramente foi ligado o Bico de Bunsen, pego a alça de platina e flambada no fogo até ficar laranja, visto que o fogo deixaria a alça esterilizada neste ponto. Então, foi deixada de lado para esfriar, pois se colocássemos ela quente dentro do tubo de cultura para coleta de bactérias o calor poderia mata-las. Também foi flambada a boca do tubo de cultura, passando ela pelo fogo três vezes, tomando o cuidado para o calor não estourar o tubo. Após ambos materiais esfriados, foi colocada a alça de platina dentro do tubo de cultura para a coleta de bactérias, e assim realizar o esfregaço na lâmina de vidro que já havia sido pega pela outra integrante do experimento. 
Foi feita na lâmina o esfregaço em movimentos rotacionais, formando um esfregaço em forma oval e uniforme. Foi passada a lâmina, com o lado em que havia se colocado as bactérias contrária à chama do bico de Bunsen, para ela secar e não haver presença de água, e assim fixar o esfregaço na lâmina. 
Após o esfregaço, a lâmina foi levada até próximo a pia para então ser feita a coloração de Gram. A seguir, os passos feitos para a coloração de Gram, sendo mencionado os corantes utilizados e seu tempo de ação:
 A lâmina contendo o esfregaço fixado foi corado com o cristal violeta, e deixado ele agir por um minuto, após isso escorreu-se a solução; 
 Colocou-se o lugol e deixou por mais um minuto, após isso lavou-se a lâmina com água corrente rapidamente; 
 Foi então colocado o álcool absoluto e deixado agir por 15 segundos, e após isso foi escorrido;
 Então, corou-se a lâmina com o corante fúcsia, deixando agir por 1 minuto e lavado rapidamente em água corrente. 
Após essas etapas da coloração de Gram, foi esperado a lâmina secar para visualizá-la em microscopia. 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A visualização da coloração de Gram foi feita em microscopia, com objetivo de imersão, com a intenção diferenciar as bactérias Gram-positivas das Gram-negativas. Em nossa lâmina, foram visualizadas bactérias Gram-negativas, já que ela apresentaram a coloração rosa, devido à fina camada de peptideoglicano existente em sua membrana, que após ser corada com o cristal violeta e lugol, e receber o álcool, ela perde esse corante para o meio, sendo corada novamente com o fúcsia. Elas geralmente têm a forma de bastonete.
Já as bactérias Gram-positivas, que não foram visualizadas em nossa lâmina, possuem a coloração roxa, devido a grossa camada de peptideoglicano não deixar o primeiro corante, cristal violeta, sair da célula após receber o álcool. Elas geralmente têm a forma de cocos. 
Figura 1 – Representação das bactérias visualizadas em microscópio eletrônico
5 CONCLUSÃO
Por meio desse experimento foi aprendido a confeccionar preparações de coloração de Gram para observação ao microscópio, e feito o reconhecimento das bactérias existentes na lâmina, em gram-postivas ou gram-negativas. 
REFERÊNCIAS
< http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfpYsAC/bacterias-gram >. Acesso em 12/03/2018. 
JORGE, O.C. Microbiologia: Atividades práticas . 2. Ed. São Paulo: Santos, 
2008